细胞间粘附分子-1在局部缺血再灌流脑损伤中作用的研究
作者：谢红妹 朱玲
单位：200065 上海铁道大学医学院附属甘泉医院神经科(谢红妹)上海铁道大学医学院病理生理教研室(朱 玲)
关键词：细胞间粘附分子-1；脑缺血再灌流；微血管内皮细胞；免疫组织化学
上海医学990212 【摘要】 目的 探讨局部脑缺血再灌流后脑微血管内皮细胞表面表达的ICAM-1参与的缺血性炎症反应。方法 用免疫组织化学的方法观察大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时再灌流0、3、12、24、72、120小时脑微血管内皮细胞ICAM-1的表达。结果 大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时未见ICAM-1的表达，栓堵2小时再灌流3小时病变侧脑组织微血管内皮细胞开始出现ICAM-1的表达，12～24小时达高峰，并持续至72小时，非缺血侧脑组织微血管未见ICAM-1的表达。结论 ICAM-1参与了缺血性脑损伤早期的病理过程。提示在缺血早期阻断ICAM-1的表达可能有助于减轻缺血性脑损害的程度。
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The role of ICAM-1 during regional ischemic and reperfusional cerebral injury in rats
XIE Hongmei, ZHU Ling Department of Neurology,Gan Quan Hospital affiliated to Medical College of Shanghai Tei Dao University, Shanghai 200065
【Abstract】 Objective To study the role of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in ischemic reperfusional cerebral injury.Methods By immunohistochemistry alone, The expression of ICAM-1 on cerebral microvascular endothelial cells after occlusion of the left middle cerebral artery for 2 hours and reperfusion for 0、3、12、24、72 and 120 hours were observed.Results There was upregulation of ICAM-1 on microvascular endothelial cells of ischemic cerebral tissue which was peaked and retained at 3、24、 and 72 hr respectively after MCAO and reperfusion.Conclusion ICAM-1 may be involved in the early pathologic process of cerebral ischemia. It is also suggested blockage of ICAM-1 expression during early ischemic period may reduce the cerebral damage.
, 百拇医药
【Key words】 Intercellular adhesion molecule-1; Cerebral ischemia and reperfusion; Microvascular endothelial cells; Immunohistochemistry
目前，在不同的脑缺血模型中已经证实，中性核粒细胞和单核细胞在缺血区的聚集和浸润是缺血区脑组织损伤的重要因素[1～3]。而此过程的始动因素部分是由于在脑血管内皮细胞表达的细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和其配基，在白细胞表面表达的整合素分子CD11/CD18糖蛋白相互作用而引起的[4]。ICAM-1是粘附分子免疫球蛋白基因超家族中的一种单链糖蛋白，正常情况下可在血管内皮细胞有少量表达，但在由毒素、TNF-α、IL-1和IFN-γ等刺激下，其在血管内皮细胞的表达明显升高[5]。为研究脑缺血再灌流后ICAM-1在脑组织损伤中的作用，我们用免疫组化的方法研究大鼠脑局部缺血再灌流后脑组织ICAM-1的表达。
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材料与方法
选用健康雄性Wistar大鼠，3～4月龄，体重250～300g(上海BK公司)。用直径0.165mm的尼龙单丝栓堵一侧大脑中动脉的方法建立局部脑缺血再灌流模型。假手术组大鼠不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙单丝。栓堵成功的大鼠于缺血后2小时拔出尼龙单丝进行再灌流，并分别于再灌流后0、3、12、24、72、120小时经左心室灌注生理盐水后处死取脑。每个时间点3～4只大鼠，并同时配1～2只假手术大鼠。
脑组织取出后，迅速放入液氮冷冻，10分钟后取出，OCT包埋，Cryocut 1800冷冻切片机自视交叉处开始向下行冠状切片，片厚12μm。冷丙酮固定5分钟。常规ABC法染色。步骤如下：将脑切片放入0.01mol/L PBS中冲洗3次，每次5分钟，然后加入10%正常羊封闭血清，置室温下3小时；PBS冲洗后，加入1%Triton X-100，5分钟后再次PBS冲洗；然后加入小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体(克隆1A 29，购于美国PHARMINGEN公司)，1∶100稀释，置4℃冰箱孵育48小时；再次PBS冲洗后，分别加入免抗小鼠二抗和辣根过氧化物酶标记的抗免三抗(ABC试剂盒购于美国ZYMED公司)，均按1∶200稀释分别置室温下3小时；PBS冲洗后，0.06%二氨基联苯胺+2.5%硫酸镍铵+0.6%过氧化氢进行呈色，适时中止反应。系列乙醇脱水，二甲苯透明，DPX封片。阴性对照组染色步骤相同，只是用小鼠IgG代替小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体。
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结果
大鼠假手术组及阴性对照组均未见ICAM-1的表达。缺血2小时再灌流0小时双侧大脑脑组织亦未见ICAM-1的表达。再灌流3小时，缺血侧大脑半球脑组织微血管开始出现ICAM-1的表达(附图A)；12、24小时表达达高峰(附图B)；72小时仍可见到ICAM-1的表达(附图C)；120小时则ICAM-1的表达完全消失。ICAM-1的表达主要集中在缺血侧大脑半球的皮层和底节。非缺血侧半球各时间点均未见到ICAM-1的表达(附图D)。
附图 大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时再灌流3小时病变侧脑组织微血管可见ICAM-1有少量表达(图A底节，×30)；再灌流24小时ICAM-1的表达达高峰(图B皮层，×30)；再灌流72小时仍可见ICAM-1有少量表达(图C皮层，×30)；栓堵后再灌流24小时病变对侧(非缺血侧)未见ICAM-1的表达(图D皮层，×30)。讨论
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目前的资料显示，脑缺血再灌流可能会加重缺血区脑组织的损伤[6]。脑的缺血再灌流损伤主要是由于血循环中的白细胞在缺血区的浸润及局部许多化学介质的释放所引起的[7，8]。减少外周血循环中的白细胞可以减轻由再灌流引起的损伤[9，10]。目前认为白细胞和血管内皮细胞之间的粘附是白细胞浸润的关键步骤，而这种粘附主要是由缺血区脑组织微血管内皮细胞表面表达的ICAM-1及其配基在白细胞表面表达的β2整合素所介导的。1991年，Clark[11]等人发现抗ICAM-1单克隆抗体可以减轻兔的可逆行脊髓缺血的损害。1994年，Zhang[12]等人在大鼠局部脑缺血再灌流模型中进一步发现，抗ICAM-1单克隆抗体可以减轻大鼠脑的梗塞面积，并同时伴有缺血区脑组织白细胞数量的明显减少。但Zhang[13]等人同时发现ICAM-1单克隆抗体却不能减轻大鼠持续性局部脑缺血后脑组织的损伤。同年，Wang[14]等人用Northern blot法对大鼠持续性脑缺血及缺血再灌流后ICAM-1 mRNA的表达进行了研究，结果发现ICAM-1 mRNA表达的高峰时间和持续时间在这两种模型中基本相同，所不同的只是ICAM-1 mRNA开始表达的时间，前者是在缺血后3小时，后者是在缺血再灌流后6小时。同时，Okada[15]等人在狒狒持续性局部脑缺血和再灌流模型中发现，持续阻断大脑中动脉2小时，缺血侧脑组织未有见ICAM-1的表达，阻断3小时再灌流1小时缺血侧脑组织微血管内皮细胞开始出现ICAM-1的表达，再灌流24小时ICAM-1的表达达高峰。他们同时证实了ICAM-1的表达主要是在直径为7.5～30.0μm的毛细血管后小静脉的内皮细胞上。
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脑缺血再灌流时ICAM-1表达增高的原因可能是由于缺血再灌流时某些炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1、IFN-γ等和某些化学因子如MCP-1、CINC等的增高所诱导的[6，16]。而ICAM-1表达的增高又反过来加重炎性细胞在缺血区的聚集，聚集的白细胞可以阻塞脑局部的毛细血管造成“无再灌流性损伤”，还可以在局部释放某些细胞因子及其它毒性物质，进一步加重脑组织的损伤。因此，如果在缺血早期阻断ICAM-1的表达，减轻由ICAM-1介导的白细胞与内皮细胞的粘附，可能有助于减轻脑的缺血性损害，为缺血性脑血管病的治疗开辟新的途径。
参考文献
[1] Clark RK, Lee EV, Fish CJ, et al. Development of tissue damage, inflammation and resolution following stroke: an immunohistochemical and quantitative planimetric study. Brain Res Bull, 1993,31:565-572.
, 百拇医药
[2] Barone FC, Hillegass LM, Price WJ, et al. Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue: myeloperoxidase activity assay and histological verification. J Neurosci Res, 1991,29:336-345.
[3] Hallenbeck JM, Dutka AJ, Taneshima T, et al. Polymorphonulear leukocyte accumulation in brain region with low blood flw during the early postischemic period. Stroke, 1986,17:246-253.
[4] Diamond M S, Staunton D E, de Fougerolles AR, et al. ICAM-1 (CD54): a counter receptor for Mac-1 (CD11b/CD18). J Cell Biol, 1990,111:3129-3139.
, 百拇医药
[5] 郝延磊，蒲传强.细胞粘附分子与缺血性脑血管病.中华神经科杂志，1996，29：368-370.
[6] Nagasawa H and Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion. Stroke, 1989,20:1037-1043.
[7] Barone FC, Schmidt DB, Hillegass LM, et al. Reperfusion increases neurophils and leukotriene B4 receptor binding in rat focal ischemia. Stroke, 1992,23:1337-1348.
[8] Liu T, Young PR, Mc Donnell PC, et al. Cytokine induced neutrophil chemoattractant mRNA expression in cerebral ischemia. Neurosci Lett, 1993,164:125-128.
, 百拇医药
[9] Chen H, Chopp M, Bodzin G. Neuropenia reduces thevolume of cerebral infarct after transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Neurosci Res Commun, 1992,11:93-99.
[10] Matsuo Y, Onodera H, Shiga Y, et al. Correlation between myeloperoxidase-quantified neurophil accumulation and ischemic brain injury in the rat: Effects of neutrophil depletion. Stroke, 1994,25:1469-1475.
[11] Clark WM, Madden KP, Rothlein R, et al. Regulation of central nervous system ischemic injury by monoclonal antibody to inter cellular adhesion molecules. J Neurosury, 1991,75:623-627.
, 百拇医药
[12] Zhang R L, Chopp M, Li Y, et al. Anti-ICAM-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient middle cerebral artery occlusin in the rat. Neurology, 1994,44:1747-1751.
[13] Zhang R L, Chopp M, Jiang N, et al. Anti-Intercellar adhesion. molecule-1 antibody reduce ischemic cell damage after transient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rat. Stroke, 1995,26:1438-1442.
[14] Wang X K, Siren A L, Liu Y, et al. Upregulation of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) on brain microvascular endothelial cells in rat ischemic cortex. Mol Bra Res, 1994,26:61-68.
, 百拇医药
[15] Okada Y, Copeland B R, Mori E, et al. P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion. Stroke, 1994,25:202-210.
[16] Liu T, Clark RK, Mc Donnell PC, et al. Tumor necrosis factor α expression in ischemic neurons. Stroke, 1994,25:1481-1488.
(收稿：1998-07-14 修回：1998-10-10), 百拇医药
单位：200065 上海铁道大学医学院附属甘泉医院神经科(谢红妹)上海铁道大学医学院病理生理教研室(朱 玲)
关键词：细胞间粘附分子-1；脑缺血再灌流；微血管内皮细胞；免疫组织化学
上海医学990212 【摘要】 目的 探讨局部脑缺血再灌流后脑微血管内皮细胞表面表达的ICAM-1参与的缺血性炎症反应。方法 用免疫组织化学的方法观察大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时再灌流0、3、12、24、72、120小时脑微血管内皮细胞ICAM-1的表达。结果 大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时未见ICAM-1的表达，栓堵2小时再灌流3小时病变侧脑组织微血管内皮细胞开始出现ICAM-1的表达，12～24小时达高峰，并持续至72小时，非缺血侧脑组织微血管未见ICAM-1的表达。结论 ICAM-1参与了缺血性脑损伤早期的病理过程。提示在缺血早期阻断ICAM-1的表达可能有助于减轻缺血性脑损害的程度。
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The role of ICAM-1 during regional ischemic and reperfusional cerebral injury in rats
XIE Hongmei, ZHU Ling Department of Neurology,Gan Quan Hospital affiliated to Medical College of Shanghai Tei Dao University, Shanghai 200065
【Abstract】 Objective To study the role of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in ischemic reperfusional cerebral injury.Methods By immunohistochemistry alone, The expression of ICAM-1 on cerebral microvascular endothelial cells after occlusion of the left middle cerebral artery for 2 hours and reperfusion for 0、3、12、24、72 and 120 hours were observed.Results There was upregulation of ICAM-1 on microvascular endothelial cells of ischemic cerebral tissue which was peaked and retained at 3、24、 and 72 hr respectively after MCAO and reperfusion.Conclusion ICAM-1 may be involved in the early pathologic process of cerebral ischemia. It is also suggested blockage of ICAM-1 expression during early ischemic period may reduce the cerebral damage.
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【Key words】 Intercellular adhesion molecule-1; Cerebral ischemia and reperfusion; Microvascular endothelial cells; Immunohistochemistry
目前，在不同的脑缺血模型中已经证实，中性核粒细胞和单核细胞在缺血区的聚集和浸润是缺血区脑组织损伤的重要因素[1～3]。而此过程的始动因素部分是由于在脑血管内皮细胞表达的细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和其配基，在白细胞表面表达的整合素分子CD11/CD18糖蛋白相互作用而引起的[4]。ICAM-1是粘附分子免疫球蛋白基因超家族中的一种单链糖蛋白，正常情况下可在血管内皮细胞有少量表达，但在由毒素、TNF-α、IL-1和IFN-γ等刺激下，其在血管内皮细胞的表达明显升高[5]。为研究脑缺血再灌流后ICAM-1在脑组织损伤中的作用，我们用免疫组化的方法研究大鼠脑局部缺血再灌流后脑组织ICAM-1的表达。
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材料与方法
选用健康雄性Wistar大鼠，3～4月龄，体重250～300g(上海BK公司)。用直径0.165mm的尼龙单丝栓堵一侧大脑中动脉的方法建立局部脑缺血再灌流模型。假手术组大鼠不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙单丝。栓堵成功的大鼠于缺血后2小时拔出尼龙单丝进行再灌流，并分别于再灌流后0、3、12、24、72、120小时经左心室灌注生理盐水后处死取脑。每个时间点3～4只大鼠，并同时配1～2只假手术大鼠。
脑组织取出后，迅速放入液氮冷冻，10分钟后取出，OCT包埋，Cryocut 1800冷冻切片机自视交叉处开始向下行冠状切片，片厚12μm。冷丙酮固定5分钟。常规ABC法染色。步骤如下：将脑切片放入0.01mol/L PBS中冲洗3次，每次5分钟，然后加入10%正常羊封闭血清，置室温下3小时；PBS冲洗后，加入1%Triton X-100，5分钟后再次PBS冲洗；然后加入小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体(克隆1A 29，购于美国PHARMINGEN公司)，1∶100稀释，置4℃冰箱孵育48小时；再次PBS冲洗后，分别加入免抗小鼠二抗和辣根过氧化物酶标记的抗免三抗(ABC试剂盒购于美国ZYMED公司)，均按1∶200稀释分别置室温下3小时；PBS冲洗后，0.06%二氨基联苯胺+2.5%硫酸镍铵+0.6%过氧化氢进行呈色，适时中止反应。系列乙醇脱水，二甲苯透明，DPX封片。阴性对照组染色步骤相同，只是用小鼠IgG代替小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体。
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结果
大鼠假手术组及阴性对照组均未见ICAM-1的表达。缺血2小时再灌流0小时双侧大脑脑组织亦未见ICAM-1的表达。再灌流3小时，缺血侧大脑半球脑组织微血管开始出现ICAM-1的表达(附图A)；12、24小时表达达高峰(附图B)；72小时仍可见到ICAM-1的表达(附图C)；120小时则ICAM-1的表达完全消失。ICAM-1的表达主要集中在缺血侧大脑半球的皮层和底节。非缺血侧半球各时间点均未见到ICAM-1的表达(附图D)。
附图 大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时再灌流3小时病变侧脑组织微血管可见ICAM-1有少量表达(图A底节，×30)；再灌流24小时ICAM-1的表达达高峰(图B皮层，×30)；再灌流72小时仍可见ICAM-1有少量表达(图C皮层，×30)；栓堵后再灌流24小时病变对侧(非缺血侧)未见ICAM-1的表达(图D皮层，×30)。讨论
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目前的资料显示，脑缺血再灌流可能会加重缺血区脑组织的损伤[6]。脑的缺血再灌流损伤主要是由于血循环中的白细胞在缺血区的浸润及局部许多化学介质的释放所引起的[7，8]。减少外周血循环中的白细胞可以减轻由再灌流引起的损伤[9，10]。目前认为白细胞和血管内皮细胞之间的粘附是白细胞浸润的关键步骤，而这种粘附主要是由缺血区脑组织微血管内皮细胞表面表达的ICAM-1及其配基在白细胞表面表达的β2整合素所介导的。1991年，Clark[11]等人发现抗ICAM-1单克隆抗体可以减轻兔的可逆行脊髓缺血的损害。1994年，Zhang[12]等人在大鼠局部脑缺血再灌流模型中进一步发现，抗ICAM-1单克隆抗体可以减轻大鼠脑的梗塞面积，并同时伴有缺血区脑组织白细胞数量的明显减少。但Zhang[13]等人同时发现ICAM-1单克隆抗体却不能减轻大鼠持续性局部脑缺血后脑组织的损伤。同年，Wang[14]等人用Northern blot法对大鼠持续性脑缺血及缺血再灌流后ICAM-1 mRNA的表达进行了研究，结果发现ICAM-1 mRNA表达的高峰时间和持续时间在这两种模型中基本相同，所不同的只是ICAM-1 mRNA开始表达的时间，前者是在缺血后3小时，后者是在缺血再灌流后6小时。同时，Okada[15]等人在狒狒持续性局部脑缺血和再灌流模型中发现，持续阻断大脑中动脉2小时，缺血侧脑组织未有见ICAM-1的表达，阻断3小时再灌流1小时缺血侧脑组织微血管内皮细胞开始出现ICAM-1的表达，再灌流24小时ICAM-1的表达达高峰。他们同时证实了ICAM-1的表达主要是在直径为7.5～30.0μm的毛细血管后小静脉的内皮细胞上。
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脑缺血再灌流时ICAM-1表达增高的原因可能是由于缺血再灌流时某些炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1、IFN-γ等和某些化学因子如MCP-1、CINC等的增高所诱导的[6，16]。而ICAM-1表达的增高又反过来加重炎性细胞在缺血区的聚集，聚集的白细胞可以阻塞脑局部的毛细血管造成“无再灌流性损伤”，还可以在局部释放某些细胞因子及其它毒性物质，进一步加重脑组织的损伤。因此，如果在缺血早期阻断ICAM-1的表达，减轻由ICAM-1介导的白细胞与内皮细胞的粘附，可能有助于减轻脑的缺血性损害，为缺血性脑血管病的治疗开辟新的途径。
参考文献
[1] Clark RK, Lee EV, Fish CJ, et al. Development of tissue damage, inflammation and resolution following stroke: an immunohistochemical and quantitative planimetric study. Brain Res Bull, 1993,31:565-572.
, 百拇医药
[2] Barone FC, Hillegass LM, Price WJ, et al. Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue: myeloperoxidase activity assay and histological verification. J Neurosci Res, 1991,29:336-345.
[3] Hallenbeck JM, Dutka AJ, Taneshima T, et al. Polymorphonulear leukocyte accumulation in brain region with low blood flw during the early postischemic period. Stroke, 1986,17:246-253.
[4] Diamond M S, Staunton D E, de Fougerolles AR, et al. ICAM-1 (CD54): a counter receptor for Mac-1 (CD11b/CD18). J Cell Biol, 1990,111:3129-3139.
, 百拇医药
[5] 郝延磊，蒲传强.细胞粘附分子与缺血性脑血管病.中华神经科杂志，1996，29：368-370.
[6] Nagasawa H and Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion. Stroke, 1989,20:1037-1043.
[7] Barone FC, Schmidt DB, Hillegass LM, et al. Reperfusion increases neurophils and leukotriene B4 receptor binding in rat focal ischemia. Stroke, 1992,23:1337-1348.
[8] Liu T, Young PR, Mc Donnell PC, et al. Cytokine induced neutrophil chemoattractant mRNA expression in cerebral ischemia. Neurosci Lett, 1993,164:125-128.
, 百拇医药
[9] Chen H, Chopp M, Bodzin G. Neuropenia reduces thevolume of cerebral infarct after transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Neurosci Res Commun, 1992,11:93-99.
[10] Matsuo Y, Onodera H, Shiga Y, et al. Correlation between myeloperoxidase-quantified neurophil accumulation and ischemic brain injury in the rat: Effects of neutrophil depletion. Stroke, 1994,25:1469-1475.
[11] Clark WM, Madden KP, Rothlein R, et al. Regulation of central nervous system ischemic injury by monoclonal antibody to inter cellular adhesion molecules. J Neurosury, 1991,75:623-627.
, 百拇医药
[12] Zhang R L, Chopp M, Li Y, et al. Anti-ICAM-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient middle cerebral artery occlusin in the rat. Neurology, 1994,44:1747-1751.
[13] Zhang R L, Chopp M, Jiang N, et al. Anti-Intercellar adhesion. molecule-1 antibody reduce ischemic cell damage after transient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rat. Stroke, 1995,26:1438-1442.
[14] Wang X K, Siren A L, Liu Y, et al. Upregulation of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) on brain microvascular endothelial cells in rat ischemic cortex. Mol Bra Res, 1994,26:61-68.
, 百拇医药
[15] Okada Y, Copeland B R, Mori E, et al. P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion. Stroke, 1994,25:202-210.
[16] Liu T, Clark RK, Mc Donnell PC, et al. Tumor necrosis factor α expression in ischemic neurons. Stroke, 1994,25:1481-1488.
(收稿：1998-07-14 修回：1998-10-10), 百拇医药