三氧化二砷对急性早幼粒细胞性白血病细胞组织因子表达的影响
作者：郭为民 诸江 王鸿利 赵维莅 王学锋 陈竺 王振义
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院，上海血液学研究所
关键词：三氧化二砷；急性早幼粒细胞性白血病；组织因子
上海医学990207 【摘要】 目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞组织因子(TF)表达的影响。 方法 利用复钙时间检测使用1μM As2O3处理APL细胞株NB4细胞以及使用As2O3治疗中不同时间的APL病人的骨髓细胞的促凝活性(PCA)，并用ELISA方法检测其TF抗原、利用半定量RT-PCR检测TF mRNA的转录水平。 结果 As2O3可以以时间依赖的方式下调APL细胞的促凝活性、TF抗原水平以及TF mRNA的转录；此外，通过对PCR产物进行测序，发现APL细胞中还存在TF第五个外显子缺失的转录本，其生物学意义尚不明了。 结论 As2O3可下调APL细胞TF的表达；而且在使用As2O3诱导APL细胞凋亡的同时，As2O3有可能通过下调APL细胞TF的表达而预防DIC的发生。
, 百拇医药
Effects of arsenic trioxide on tissue factors expression of acute promyelocytic leukemia cells
Guo Weimin, Zhu Jiang, Wang Hongli, et al.
Shanghai Institute of Hematology, Rui-Jin Hospital, Shanghai Second Medical University
【Abstract】 Objective To investigate the effects of arsenic trioxide (As2O3) on tissue factors(TF) expression of acute promyelocytic leukemia(APL) cells. Methods Procoagulant activity(PCA) of APL cell line NB4 cell treated with 1μM As2O3 and freshly isolated bone marrow blasts from APL patients treated with As2O3 were detected using a one-stage clotting assay, as well as TF antigen detected by ELISA, TF mRNA by semi-quantitative RT-PCR. Results As2O3 can time-dependently downregulate the TF antigent, its mRNA transcription and membrane PCA of APL cells. Moreover, by dideoxy sequencing of DNA fragment derived from PCR, it was found that there was an exon 5 deletion transcript of TF in APL cell as well, its biological significance remained unknown. Conclusion Tissue factors expression of APL cells may be downregulated by As2O3, and by downregulating the TF expression, As2O3 may also be used as a preventive agent for DIC in APL during its induction of APL cells to apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Arsenic trioxide Acute promyelocytic leukemia Tissue factors
急性早幼粒细胞性白血病(APL)是一种经常伴发严重出血的急性白血病，其出血并发症比其它类型急性白血病多见且严重[1]。最近，有报告使用三氧化二砷(As2O3)能有效治疗APL，且无明显的骨髓抑制，同时可改善其出血倾向。完整的APL细胞表面异常地表达组织因子(TF)这一血液凝固的触发因子，在APL伴发DIC时起着非常重要的作用[2，3]。为研究临床As2O3改善APL出血并发症的作用机制，我们检测了使用As2O3处理的APL细胞株NB4细胞以及使用As2O3治疗中不同时间的APL病人的骨髓细胞的促凝活性(PCA)，并用ELISA方法检测其TF抗原、半定量RT-PCR检测TF mRNA的水平，以探讨As2O3对APL细胞TF表达的影响。
, 百拇医药
材料和方法
一、患者及其标本采集
6例APL患者(初始1例，复发5例；14～54岁，其中男4例，女2例)用As2O3(0.1% As2O3 10ml/天，静脉滴注)治疗前、治疗后7天、14天及完全缓解(CR)时经髂后上棘抽取骨髓液3ml, Ficoll-Hypaque分离单个核细胞(除CR外，骨髓原始+早幼粒细胞>80%)。
二、细胞培养、活力测定
NB4细胞(本所自备)在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco-BRL)中于37°C、5%CO2饱和湿度培养，并于1μM As2O3处理0、6、12、24、48、72、95小时收集NB4细胞，以台盼蓝拒染法观察细胞活力。
, 百拇医药
三、PCA的检测
参照文献描述的方法[4]，分别使用正常人混合血浆(NHP)、乏因子VⅡ(FVⅡD)血浆或乏因子VⅢ(FVⅢD)血浆(均为Diagnostic Stago产品)检测APL细胞的复钙时间。使用磷酸缓冲液(PBS，pH=7.4)调节NB4细胞或APL患者骨髓单个核细胞浓度为1×107/ml，以50μl标本加等体积血浆于37°C孵育180秒，然后加50μl 0.05M氯化钙，利用凝血分析仪(ST4 Diagnostic Stago)记录凝固时间。
四、TF抗原的测定
将收集的NB4细胞或APL患者骨髓单个核细胞参照文献的方法[4]裂解细胞后使用TF ELISA Kit(America Diagnostic Immubind)检测TF抗原。
, 百拇医药
五、RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录
应用TRIzol试剂(Gibco-BRL)进行一步法抽提APL细胞总RNA，用RNase-free DNase对抽提的总RNA进行消化，酚氯仿抽提，紫外分光光度法定量，然后进行电泳鉴定；利用Superscript Ⅱ Amplication Kit(Gibco-BRL)将2μg RNA加随机引物进行逆转录；取1/8体积的逆转录产物进行PCR扩增。
利用计算机软件PCRDESNA设计TF引物，上游引物为5′ GGATGTGAAGCAGACGTACT 3′，下游引物为5′ GTGTAGAGATATAGCCAGGA 3′，扩增的长度为535bp。将PCR产物克隆到pGEM-T载体后，利用Sanger双脱氧法将PCR扩增的TF片段进行DNA测序。利用克隆到载体的TF片段中Hpa I和EcoR I两个酶切位点切除TF片段中的55bp，然后进行连接反应，并以此构建作为PCR的内参照。
, 百拇医药
将构建的内参照模板经系列稀释后加入到上述逆转录产物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为95°C1分钟，58°C1分钟，72°C1分钟，35个循环，取10μl PCR产物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
结果
一、As2O3处理的NB4细胞生长曲线
图1 As2O3处理的NB4细胞生长曲线
二、As2O3对NB4细胞PCA、TF抗原的影响
三、As2O3对APL病人骨髓单个核细胞PCA、TF抗原的影响
, http://www.100md.com
四、As2O3对APL细胞TF mRNA转录的影响
图2 PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳结果，每一时间点自右至左依次加入0.025pg、0.0125pg、0.00625pg TF内参照模板对逆转录产物进行PCR扩增，扩增的TF片段长度为535bp，内参照的长度为480bp，375bp为缺失第5个外显子的TF片段。
图3 TF引物设计示意图
表1 As2O3对NB4细胞PCA、TF抗原的影响
孵育时间(小时)
, 百拇医药
0
6
12
24
48
72
96
PCA-NHP(秒)
对照组
52
52.2
59.5
54.7
, http://www.100md.com
52.8
60
58.2
As2O3组
52
54
57.8
57
71.8
108
143.5
PCA-FVIID(秒)
, http://www.100md.com 对照组
208.6
214.9
224.9
250.8
238.3
313.9
434.4
As2O3组
208.6
206.6
230.4
, http://www.100md.com
247.3
241.2
288.7
252.4
PCA-FVIIID(秒)
对照组
55.8
52.4
49.1
48.9
53.3
63.8
59.5
, 百拇医药
As2O3组
55.8
52.4
46.4
56.8
66.2
91.5
116.4
TF:Ag(pg/105 cells)
对照组
280.6
319.5
, 百拇医药
316.2
314.6
307.2
255.3
280.2
As2O3组
280.6
236.1
135.5
108.7
51.9
24.6
, 百拇医药
17.8
表2 As2O3对病人BM单个核细胞PCA、TF抗原的影响
例数
治疗前
第7天
第7天
CR
对照组(n=8)
PCA-NHP(秒)
6
68.7±22.1
122.0±22.7*
, 百拇医药
214.6±51.6*
230.2±64.0*
222.6±30.7
PCA-FVIID(秒)
6
245.3±68.6
180.5±61.8
200.5±35.3
271.2±77.3
314.2±87.4
PCA-FVIIID(秒)
, 百拇医药
6
79.0±36.2
194.1±31.7*
238.5±92.1*
309.3±114.2*
372.4±64.6
TF:Ag(pg/105 cells)
6
368.02±151.2
21.35±22.27
, 百拇医药 ND
ND
ND
注：与治疗前比较：*P<0.001,ND：未测到讨论
APL细胞表面TF的异常高表达是APL并发DIC出血的一个重要原因。临床研究发现使用As2O3可有效地治疗APL，同时可改善其出血倾向。我们的体外研究发现经As2O3处理NB4细胞6小时后，其TF抗原水平就开始逐渐下降，而且NB4细胞活力在90%以上，未发生明显细胞凋亡的阶段，NB4细胞PCA亦逐渐下降，TF mRNA的转录水平亦逐渐下降，表明As2O3可下调APL细胞TF的表达，这种影响至少部分机制是通过作用在TF的转录水平而实现的。Kayama等[4]利用抗TF抗体的中和试验证明NB4细胞表面的PCA主要取决于TF抗原，我们利用NHP、FVⅡD血浆以及FVⅢD血浆测定NB4细胞PCA的结果也表明NB4细胞表面的PCA主要依赖于FVⅡ，说明NB4细胞表面的PCA主要反映TF的功能活性。6例APL病人使用As2O3治疗前均有出血症状，As2O3治疗1周后出血症状基本消失，从APL病人骨髓分离的单个核细胞所进行的试验结果与体外实验完全一致，表明在使用As2O3诱导APL细胞凋亡的同时，As2O3有可能通过下调APL细胞TF的表达而预防DIC的发生。
, 百拇医药
实验研究发现人体细胞中存在2.1～2.3kb和3.1～3.4kb的TF转录本，低丰度的较大的TF转录本含有第一个内含子，因此这种较大的TF转录本并不翻译成为具有功能活性的TF蛋白，据认为TF转录中的这种选择性剪切参与了TF表达的调节[5]。我们通过对PCR产物的DNA测序发现了APL细胞还存在第5个外显子缺失的TF转录本，其生物学意义尚不清楚。
我们曾分别多次使用核素标记或地高辛标记的TF探针利用Northern blot的方法检测APL细胞TF mRNA的改变，但这种方法的敏感性不足以检测逐渐下调的TF mRNA的变化。于是我们构建了TF的突变体作为RT-PCR的内参照，由于作为内参照的人工模板与所检测APL细胞TF的表达共用一对引物，用这种经系列稀释的内参照模板进行的竞争性RT-PCR为TF mRNA的半定量检测提供了一种可靠的方法。
本课题受胡应洲基金部分资助
, 百拇医药
参考文献
[1] Rodeghiero F, Avvisati G, Castaman C, et al. Early deaths and anti-hemorrhagic treatments in acute promyelocytic leukemia. A GIMEMA retrospective study in 268 consecutive patients. Blood, 1990, 75:2112-2117.
[2] Tallman MS, Kwaan HC. Reassessing the hemostatic disorder associated with acute promyelocytic leukemia. Blood, 1992, 79:543-553.
[3] Tanaka M, Yamanishi H. The expression of tissue factor antigen and activity on the surface of leukemic cells. Leukemia Res, 1993,17:103.
, 百拇医药
[4] Koyama T, Hirosawa S, Kawamata N, et al. All-trans retinoic acid upregulates thrombomodulin and downregulates tissue factor exprssion in acute promyelocytic leukemia cells: distinct expression of thrombomodulin and tissue factor in human leukemic cells. Blood, 1994, 84:3001-3009.
[5] Brand K, Fowler BJ, Edging TS, et al. Tissue factor mRNA in THP-1 monocytic cells is regulated at both transcriptional and posttranscriptional levels in response to lipopolysaccharide. Mol Cell Biol, 1991, 11:4732-4738.
(收稿：1998-11-03), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院，上海血液学研究所
关键词：三氧化二砷；急性早幼粒细胞性白血病；组织因子
上海医学990207 【摘要】 目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞组织因子(TF)表达的影响。 方法 利用复钙时间检测使用1μM As2O3处理APL细胞株NB4细胞以及使用As2O3治疗中不同时间的APL病人的骨髓细胞的促凝活性(PCA)，并用ELISA方法检测其TF抗原、利用半定量RT-PCR检测TF mRNA的转录水平。 结果 As2O3可以以时间依赖的方式下调APL细胞的促凝活性、TF抗原水平以及TF mRNA的转录；此外，通过对PCR产物进行测序，发现APL细胞中还存在TF第五个外显子缺失的转录本，其生物学意义尚不明了。 结论 As2O3可下调APL细胞TF的表达；而且在使用As2O3诱导APL细胞凋亡的同时，As2O3有可能通过下调APL细胞TF的表达而预防DIC的发生。
, 百拇医药
Effects of arsenic trioxide on tissue factors expression of acute promyelocytic leukemia cells
Guo Weimin, Zhu Jiang, Wang Hongli, et al.
Shanghai Institute of Hematology, Rui-Jin Hospital, Shanghai Second Medical University
【Abstract】 Objective To investigate the effects of arsenic trioxide (As2O3) on tissue factors(TF) expression of acute promyelocytic leukemia(APL) cells. Methods Procoagulant activity(PCA) of APL cell line NB4 cell treated with 1μM As2O3 and freshly isolated bone marrow blasts from APL patients treated with As2O3 were detected using a one-stage clotting assay, as well as TF antigen detected by ELISA, TF mRNA by semi-quantitative RT-PCR. Results As2O3 can time-dependently downregulate the TF antigent, its mRNA transcription and membrane PCA of APL cells. Moreover, by dideoxy sequencing of DNA fragment derived from PCR, it was found that there was an exon 5 deletion transcript of TF in APL cell as well, its biological significance remained unknown. Conclusion Tissue factors expression of APL cells may be downregulated by As2O3, and by downregulating the TF expression, As2O3 may also be used as a preventive agent for DIC in APL during its induction of APL cells to apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Arsenic trioxide Acute promyelocytic leukemia Tissue factors
急性早幼粒细胞性白血病(APL)是一种经常伴发严重出血的急性白血病，其出血并发症比其它类型急性白血病多见且严重[1]。最近，有报告使用三氧化二砷(As2O3)能有效治疗APL，且无明显的骨髓抑制，同时可改善其出血倾向。完整的APL细胞表面异常地表达组织因子(TF)这一血液凝固的触发因子，在APL伴发DIC时起着非常重要的作用[2，3]。为研究临床As2O3改善APL出血并发症的作用机制，我们检测了使用As2O3处理的APL细胞株NB4细胞以及使用As2O3治疗中不同时间的APL病人的骨髓细胞的促凝活性(PCA)，并用ELISA方法检测其TF抗原、半定量RT-PCR检测TF mRNA的水平，以探讨As2O3对APL细胞TF表达的影响。
, 百拇医药
材料和方法
一、患者及其标本采集
6例APL患者(初始1例，复发5例；14～54岁，其中男4例，女2例)用As2O3(0.1% As2O3 10ml/天，静脉滴注)治疗前、治疗后7天、14天及完全缓解(CR)时经髂后上棘抽取骨髓液3ml, Ficoll-Hypaque分离单个核细胞(除CR外，骨髓原始+早幼粒细胞>80%)。
二、细胞培养、活力测定
NB4细胞(本所自备)在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco-BRL)中于37°C、5%CO2饱和湿度培养，并于1μM As2O3处理0、6、12、24、48、72、95小时收集NB4细胞，以台盼蓝拒染法观察细胞活力。
, 百拇医药
三、PCA的检测
参照文献描述的方法[4]，分别使用正常人混合血浆(NHP)、乏因子VⅡ(FVⅡD)血浆或乏因子VⅢ(FVⅢD)血浆(均为Diagnostic Stago产品)检测APL细胞的复钙时间。使用磷酸缓冲液(PBS，pH=7.4)调节NB4细胞或APL患者骨髓单个核细胞浓度为1×107/ml，以50μl标本加等体积血浆于37°C孵育180秒，然后加50μl 0.05M氯化钙，利用凝血分析仪(ST4 Diagnostic Stago)记录凝固时间。
四、TF抗原的测定
将收集的NB4细胞或APL患者骨髓单个核细胞参照文献的方法[4]裂解细胞后使用TF ELISA Kit(America Diagnostic Immubind)检测TF抗原。
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五、RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录
应用TRIzol试剂(Gibco-BRL)进行一步法抽提APL细胞总RNA，用RNase-free DNase对抽提的总RNA进行消化，酚氯仿抽提，紫外分光光度法定量，然后进行电泳鉴定；利用Superscript Ⅱ Amplication Kit(Gibco-BRL)将2μg RNA加随机引物进行逆转录；取1/8体积的逆转录产物进行PCR扩增。
利用计算机软件PCRDESNA设计TF引物，上游引物为5′ GGATGTGAAGCAGACGTACT 3′，下游引物为5′ GTGTAGAGATATAGCCAGGA 3′，扩增的长度为535bp。将PCR产物克隆到pGEM-T载体后，利用Sanger双脱氧法将PCR扩增的TF片段进行DNA测序。利用克隆到载体的TF片段中Hpa I和EcoR I两个酶切位点切除TF片段中的55bp，然后进行连接反应，并以此构建作为PCR的内参照。
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将构建的内参照模板经系列稀释后加入到上述逆转录产物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为95°C1分钟，58°C1分钟，72°C1分钟，35个循环，取10μl PCR产物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
结果
一、As2O3处理的NB4细胞生长曲线
图1 As2O3处理的NB4细胞生长曲线
二、As2O3对NB4细胞PCA、TF抗原的影响
三、As2O3对APL病人骨髓单个核细胞PCA、TF抗原的影响
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四、As2O3对APL细胞TF mRNA转录的影响
图2 PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳结果，每一时间点自右至左依次加入0.025pg、0.0125pg、0.00625pg TF内参照模板对逆转录产物进行PCR扩增，扩增的TF片段长度为535bp，内参照的长度为480bp，375bp为缺失第5个外显子的TF片段。
图3 TF引物设计示意图
表1 As2O3对NB4细胞PCA、TF抗原的影响
孵育时间(小时)
, 百拇医药
0
6
12
24
48
72
96
PCA-NHP(秒)
对照组
52
52.2
59.5
54.7
, http://www.100md.com
52.8
60
58.2
As2O3组
52
54
57.8
57
71.8
108
143.5
PCA-FVIID(秒)
, http://www.100md.com 对照组
208.6
214.9
224.9
250.8
238.3
313.9
434.4
As2O3组
208.6
206.6
230.4
, http://www.100md.com
247.3
241.2
288.7
252.4
PCA-FVIIID(秒)
对照组
55.8
52.4
49.1
48.9
53.3
63.8
59.5
, 百拇医药
As2O3组
55.8
52.4
46.4
56.8
66.2
91.5
116.4
TF:Ag(pg/105 cells)
对照组
280.6
319.5
, 百拇医药
316.2
314.6
307.2
255.3
280.2
As2O3组
280.6
236.1
135.5
108.7
51.9
24.6
, 百拇医药
17.8
表2 As2O3对病人BM单个核细胞PCA、TF抗原的影响
例数
治疗前
第7天
第7天
CR
对照组(n=8)
PCA-NHP(秒)
6
68.7±22.1
122.0±22.7*
, 百拇医药
214.6±51.6*
230.2±64.0*
222.6±30.7
PCA-FVIID(秒)
6
245.3±68.6
180.5±61.8
200.5±35.3
271.2±77.3
314.2±87.4
PCA-FVIIID(秒)
, 百拇医药
6
79.0±36.2
194.1±31.7*
238.5±92.1*
309.3±114.2*
372.4±64.6
TF:Ag(pg/105 cells)
6
368.02±151.2
21.35±22.27
, 百拇医药 ND
ND
ND
注：与治疗前比较：*P<0.001,ND：未测到讨论
APL细胞表面TF的异常高表达是APL并发DIC出血的一个重要原因。临床研究发现使用As2O3可有效地治疗APL，同时可改善其出血倾向。我们的体外研究发现经As2O3处理NB4细胞6小时后，其TF抗原水平就开始逐渐下降，而且NB4细胞活力在90%以上，未发生明显细胞凋亡的阶段，NB4细胞PCA亦逐渐下降，TF mRNA的转录水平亦逐渐下降，表明As2O3可下调APL细胞TF的表达，这种影响至少部分机制是通过作用在TF的转录水平而实现的。Kayama等[4]利用抗TF抗体的中和试验证明NB4细胞表面的PCA主要取决于TF抗原，我们利用NHP、FVⅡD血浆以及FVⅢD血浆测定NB4细胞PCA的结果也表明NB4细胞表面的PCA主要依赖于FVⅡ，说明NB4细胞表面的PCA主要反映TF的功能活性。6例APL病人使用As2O3治疗前均有出血症状，As2O3治疗1周后出血症状基本消失，从APL病人骨髓分离的单个核细胞所进行的试验结果与体外实验完全一致，表明在使用As2O3诱导APL细胞凋亡的同时，As2O3有可能通过下调APL细胞TF的表达而预防DIC的发生。
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实验研究发现人体细胞中存在2.1～2.3kb和3.1～3.4kb的TF转录本，低丰度的较大的TF转录本含有第一个内含子，因此这种较大的TF转录本并不翻译成为具有功能活性的TF蛋白，据认为TF转录中的这种选择性剪切参与了TF表达的调节[5]。我们通过对PCR产物的DNA测序发现了APL细胞还存在第5个外显子缺失的TF转录本，其生物学意义尚不清楚。
我们曾分别多次使用核素标记或地高辛标记的TF探针利用Northern blot的方法检测APL细胞TF mRNA的改变，但这种方法的敏感性不足以检测逐渐下调的TF mRNA的变化。于是我们构建了TF的突变体作为RT-PCR的内参照，由于作为内参照的人工模板与所检测APL细胞TF的表达共用一对引物，用这种经系列稀释的内参照模板进行的竞争性RT-PCR为TF mRNA的半定量检测提供了一种可靠的方法。
本课题受胡应洲基金部分资助
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参考文献
[1] Rodeghiero F, Avvisati G, Castaman C, et al. Early deaths and anti-hemorrhagic treatments in acute promyelocytic leukemia. A GIMEMA retrospective study in 268 consecutive patients. Blood, 1990, 75:2112-2117.
[2] Tallman MS, Kwaan HC. Reassessing the hemostatic disorder associated with acute promyelocytic leukemia. Blood, 1992, 79:543-553.
[3] Tanaka M, Yamanishi H. The expression of tissue factor antigen and activity on the surface of leukemic cells. Leukemia Res, 1993,17:103.
, 百拇医药
[4] Koyama T, Hirosawa S, Kawamata N, et al. All-trans retinoic acid upregulates thrombomodulin and downregulates tissue factor exprssion in acute promyelocytic leukemia cells: distinct expression of thrombomodulin and tissue factor in human leukemic cells. Blood, 1994, 84:3001-3009.
[5] Brand K, Fowler BJ, Edging TS, et al. Tissue factor mRNA in THP-1 monocytic cells is regulated at both transcriptional and posttranscriptional levels in response to lipopolysaccharide. Mol Cell Biol, 1991, 11:4732-4738.
(收稿：1998-11-03), 百拇医药