124例HbH患者α珠蛋白基因的分析
作者：陈坚 孙琼 陈美珏 任兆瑞 黄淑帧
单位：200040 上海市儿童医院 上海医学遗传研究所
关键词：地中海贫血；α珠蛋白基因；诊断
上海医学990205 【摘要】 目的 分析124例HbH患者的α珠蛋白基因的分子缺陷状况及其分布，为HbH的基因诊断和产前诊断提供科学依据。 方法 应用Southern印迹杂交、限制性内切酶分析PCR产物、血红蛋白电泳和Long PCR等技术，对受检HbH病患者的α珠蛋白基因组织进行了鉴定。 结果 在124例HbH病患者中，缺失型患者有83例，占66.9%；其中右侧缺失型(α-3.7)45例，占缺失型患者总数的54.2%，主要分布于广东、湖北、云南等省区，左侧缺失型(α-4.2)38例，占缺失型患者总数的45.8%，主要分布在广西和江西；非缺失型患者41例，占33.1%；其中HbConstnt Spring(HbCS)患者9例，占非缺失型患者总数的22.0%，Hb广西(HbQS)患者3例，占非缺失型患者总数的7.3%，其他α+地贫突变类型29例，占非缺失型总数的70.7%。 结论 不同地区HbH患者的α珠蛋白基因的突变类型有明显的差异，该项研究为HbH病的分子遗传学和HbH病的基因诊断提供了依据。
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An analysis of α-globin genes in 124 cases with HbH disease
CHEN Jian, SUN Qiong, CHEN Meijue, et al.
Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children's Hospital, 200040
【Abstract】 Objective To analyze the molecular abnormalities as well as the distribution of α-globin genes in 124 cases with HbH disease; and provide scientific basis for molecular diagnosis and prenatal diagnosis in this hemoglobin disorder. Methods α-globin gene tissue of 124 cases with HbH disease were analyzed by Southern blot hybridization, restriction mapping of PCR products, hemoglobin electrophoresis and Long PCR technology. Results In 124 cases, 83 were identified to be the deletional type, accounting for 66.9%. Among the 83,45 cases belonged to the rightward type of deletion (α-3.7) and 38 cases were leftward type of deletion (α-4.2). The patients with rightward type of deletion mainly distributed in Guangdong, Hubei and Yunnan provinces, while patients with leftward type of deletion lived in Guangxi and Jiangxi. Another 41 cases were identified as non-deletional type of HbH disease, acounting for 33.1% of the tested cases. Among these patients, 9 cases were HbConstant Spring (HbCS) and 3 were HbQong-Sze(HbQS). The other remaining 29 cases were α+ thalassemia mutations which occupied 70.7% of the total non-deletional cases. Conclusion The molecular abnormalities of α-globin genes in HbH patients were significantly different in different regions. This study provides useful knowledge for the understanding the molecular genetics of HbH disease as well as for molecular diagnosis in the regions where the disease is prevalent.
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【Key words】 Thalassemia α-globin gene Diagnosis
该项研究受国家自然科学基金(39770711)和卫生部科学基金(96-1-323)资助 HbH病是我国较为常见的一种α地中海贫血(简称地贫)类型，患者由于三个α珠蛋白基因缺失或缺陷，导致α珠蛋白肽链的合成速率的明显降低，过剩的β珠蛋白肽链形成β4四聚体-HbH，并在红细胞内形成HbH包涵体，引起慢性溶血性贫血[1]。因HbH病患者的一条16号染色体缺失了两个α珠蛋白基因，故为α0地贫突变，我国的绝大部分患者都表现为东南亚缺失型突变(--SEA)[2]；患者的另一条16号染色体上则表现为α+地贫突变，即一个α珠蛋白基因正常但另一个α珠蛋白基因缺失或缺陷。α+地贫突变又可分成缺失型和非缺失型α地贫突变两大类，最常见的缺失类型是3.7kb缺失(α-3.7)，即右侧缺失型和4.2kb缺失(α-4.2)，即左侧缺失型[3]。非缺失型α地贫目前已报道了27种不同的点突变类型[4]，而在中国和东南亚地区，主要是HbGuong-Sze(广西，HbQS，即α2珠蛋白基因第125位密码子(CD125)CTG→CCG)和HbConstant Spring(HbCS，即α2珠蛋白基因第142位密码子(CD142)TAA→CAA)两类[5，6]。本文分析124例HbH患者的α珠蛋白基因异常的情况，特别是α+地贫的不同类型在我国的地理分布，为深入开展HbH病的分子遗传学研究以及其基因诊断等提供有价值的科学资料。
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材料和方法
一、材料
124例HbH患者分别来自广西、江西、广东、湖北、云南和四川等省、自治区。经血液学检查确诊后，取5ml静脉血置于含1ml柠檬酸钠-葡萄糖保养液的试管内混匀。
二、方法
(一) DNA抽提 按文献[7]的方法抽提外周血白细胞DNA。
(二) 血红蛋白组成和理化性质测定 按上海医学遗传研究所常规方法进行测定[8]。血红蛋白电泳图谱中如发现特异的HbCS带，即可诊断为HbCS型α+地贫突变。
(三) α珠蛋白基因分析 (1) α珠蛋白基因缺失的检测：以Southern印迹杂交技术[3]进行。用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别酶解DNA样品，经电泳、变性、中和后转移到硝酸纤维薄膜上，用(α-32P)dCTP(Amersham, 110TBq/mmol)标记的α珠蛋白基因探针进行杂交，洗膜后放射自显影。(2) HbQS的检测：α2珠蛋白基因第125位密码子(CD125)CTG→CCG点突变则增添了一个新的HpaⅡ的切点(5′-CCGG-3′)，因此选用HpaⅡ限制性内切酶来酶解包含HbQS突变位点的α2珠蛋白基因的PCR扩增产物，就可以方便地鉴定正常或突变的等位基因。PCR扩增产物的长度为328bp，上游引物为5′-TGACCCTCTTCTCTGCACAGC-3′；下游引物为：5′-GTCTGAGACAGGTAAACACCTCC-3′。正常的α2珠蛋白基因扩增产物经HpaⅡ酶解后将出现218bp、70bp和40bp三个片段；HbQS的α2珠蛋白基因扩增产物经酶解后则出现122bp、96bp、70bp和40bp四个片段。根据酶解片段的不同可以确定是否为HbQS型α+地贫突变。(3) 长片段PCR(Long PCR)对α珠蛋白基因缺失的诊断：应用本所建立的应用长片段PCR技术对部分患者进行了α珠蛋白基因的分析[9]，在α2珠蛋白基因的上游和α1珠蛋白基因的下游非同源区设计了一对引物，它们的序列分别为5′-ACTGTAGATACCCGTGTACA ACC-3′和5′-GAGGCCCAAGGGGCAAGAAGCA T-3′。在正常的α珠蛋白基因组织能特异地扩增出包括α2和α1珠蛋白基因在内的6.4kb的DNA片段；而在右侧缺失型α珠蛋白基因组织(α-3.7)，扩增片段的大小则为2.6kb。根据这些扩增片段的不同组合，结合Southern图谱可以鉴定出患者α珠蛋白基因缺失的类型。
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结果
应用Southern印迹杂交、限制性内切酶分析PCR产物、长片段PCR以及血红蛋白电泳等技术，对来自广西、江西、广东、湖北、云南和四川等省、自治区共124例经血液学检查确诊的HbH病患者的α珠蛋白基因组织进行了鉴定。结果表明：缺失型患者有83例，占66.9%；其中右侧缺失型(α-3.7)45例，占缺失型患者总数的54.2%，左侧缺失型(α-4.2)38例，占缺失型患者总数的45.8%。124例HbH病患者中，非缺失型患者41例，占33.1%；其中HbCS患者9例，占22.0%，HbQS患者3例，占7.3%，其他类型29例，占70.7%。124例HbH病患者的α+地贫突变种类和地理分布见表1。部分HbH病患者的Southern印迹杂交图谱(用Bgl Ⅱ消化)见图1；HpaⅡ酶解α2珠蛋白基因PCR产物检测HbQS的部分结果见图2；长片段PCR检测右侧缺失型α珠蛋白基因的结果见图3。
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表1 124例HbH病的类型和地理分布 地区
病例数
非缺失型
缺失型
α+-thal
α-QS
α-CS
α-3.7
α-4.2
广西
57
16
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0
2
17
22
江西
29
4
1
5
8
11
广东
11
2
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0
1
6
2
湖北
17
4
2
0
9
2
云南
6
2
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0
1
3
0
四川
4
1
0
0
2
1
总计
124
29
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3
9
45
38
图1 HbH患者的Southern blot放射性字显影图谱(DNA用BglⅡ消化，32P标记的α-珠蛋白基因cDNA为探针)
1，2，6：右侧缺失型HbH病患者，仅显示16.5kb的α-珠蛋白基因片段，而没有正常人的12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段。
3：正常人，显示12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段。
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4：α0地贫杂合子，显示12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段，但其放射自显影强度比正常人的弱(只有正常人的一半左右)。
5：右侧缺失型α+地贫杂合子：除具有正常人的12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段外，还有16.5kb的片段。
图2 应用Long PCR技术分析α-珠蛋白基因的缺失的琼脂糖凝胶电泳图
M: 123bp梯度分子量标志。
1： 正常人，显示6.4kb的扩增区带。
2： 右侧缺失型α+地贫杂合子：除显示6.4kb的扩增区带外，还有2.6kb的扩增带。
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3： 右侧缺失型HbH病患者：仅有2.6kb的扩增带。
图3 PCR/HapⅡ酶解图谱分析HbQS(α2 125CTG→CCG)突变
M：50bp梯度DNA分子量标记。
1： --/αQSα个体：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
2： --/αQSα个体：PCR产物经HapⅡ酶解，显示122bp,96bp,70bp和40bp四个片段。
3： 正常人：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
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4： 正常人：PCR产物经HapⅡ酶解，显示218bp,70bp和40bp三个片段。
5： αα/αQSα个体：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
6： αα/αQSα个体：PCR产物经HapⅡ酶解，显示218bp，122bp，96bp，70bp和40bp五个片段。讨论
从遗传学角度来看，HbH病是α+地贫和α0地贫的双重杂合子，由于四个α基因中有三个缺失或缺陷，使α链的合成受到严重影响，而相对过剩的β珠蛋白肽链则形成HbH(β4)。HbH是一种不稳定的四聚体，其β链上的巯基(-SH)易被氧化，导致β4的解体，生成游离的β链。游离β链不能稳定地存在于红细胞内，结果沉淀聚积，形成H包涵体，附着于红细胞膜上，使红细胞膜受损，红细胞失去柔韧性，易被脾脏破坏，导致慢性溶血性贫血[1]。近年来，对HbH病的分子生物学的研究结果揭示，该病的分子基础是α珠蛋白基因缺失和α珠蛋白基因点突变[4]。由于α珠蛋白基因之间存在着高度同源性，故在减数分裂时同源染色体之间可产生错位配对而引发不等交换，导致α珠蛋白基因簇不同程度的缺失。在中国人中，α珠蛋白基因缺失的类型主要有三种：东南亚缺失型(--SEA)，缺失范围包括α2和α1珠蛋白基因在内约20kb的片段，为α0地贫；右侧缺失型(α-3.7)，缺失片段的大小约为3.7kb，包括α2珠蛋白基因的3′端和α1珠蛋白基因的5′端；左侧缺失型(α-4.2)，缺失了整个α2珠蛋白基因，缺失片段的长度为4.2kb，右侧缺失型和左侧缺失型两者均为α+地贫。我国目前已明确的α地贫点突变，即非缺失型突变有两种，一种是HbCS，α2珠蛋白基因的第142位终止密码子TAA突变成编码谷氨酰胺的CAA，肽链处延合成到173位的第二个终止密码子结束；另一种是HbQS，乃由于α2珠蛋白基因第125位密码子突变使原来编码亮氨酸变为编码脯氨酸所致。两者都导致α+地贫。
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本文结果显示：我国缺失型HbH病患者占66.9%，非缺失型患者占33.1%，表明缺失型是形成HbH病的主要原因。α+地贫基因缺失的类型，在不同地区的人群中发生的频率并不一致。广东和湖北两省的患者以右侧缺失型为主，而广西和江西的左侧缺失型的比例略高于右侧缺失型。总体上右侧缺失型略高，占缺失型总数的54.2%，左侧缺失型则占46.8%。在41例非缺失型α+地贫基因中，HbCS9例，占22.0%，HbQS 3例，占7.3%，其他类型29例，占70.7%。尤其是广西壮族自治区的18例非缺失型患者中，HbCS只有2例，这与以往的报道结果[5，6]有所不同，可能是取材的差异所致。此外，本文报道的9例HbCS中5例发生在江西省，这与左侧缺失型较高的地理分布相吻合。本文报道的41例非缺失型HbH病患者中，还有29例尚未确定α+地贫基因的突变类型，进一步阐明这些α+地贫基因的分子机理，对于丰富我国地中海贫血的分子遗传学资料，在该病高发地区开展基因诊断和产前诊断具有重要的意义。
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在对α地贫实施基因诊断时，由于α1和α2珠蛋白基因及其旁侧序列之间存在着广泛的同源性，故应用普通PCR往往难以鉴定α珠蛋白基因的突变情况及其类型，目前对α地贫(包括HbH病)的基因诊断主要依靠限制性内切酶分析技术。长片段PCR是近年新发明的一种能扩增出很长DNA片段的PCR技术[10]，在长片段PCR体系中，除了包含有TaqDNA聚合酶外，还有一定比例的具有3′→5′外切酶活性的耐热聚合酶，故可切除PCR反应中引入的错配硷基，降低扩增产物的硷基错配率，克服普通PCR限制片段延伸的因素，因此长片段PCR可以扩增出十几甚至几十千硷基对的DNA片段。最近我们利用长片段PCR技术的这一特点，在α珠蛋白基因的上下游非同源区设计一对长片段PCR引物，并通过长片段PCR，成功地诊断我国最常见的右侧缺失型HbH病(α-3.7/--)，为HbH病的基因诊断提供了又一种简便、快速和可靠的方法[9]。
HbH病是α地贫中较为严重的一种类型，目前仍以输血为主要的治疗手段，对于长期严重贫血患者，可试用脾脏切除或脾静脉栓塞术，可使部分患者的血红蛋白回升；而在疾病高发地区，积极开展α珠蛋白基因分析对HbH病高危胎儿进行产前诊断，避免患儿的出生则是一项预防该病发生的有效措施。
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参考文献
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[2] 曾溢滔主编.遗传性血液疾病.第一版，北京：科学出版社，1991.
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[6] 阎志杰，吴冠云，王荣新，等.非缺失型HbH病基因突变类型的研究.中华血液学杂志，1994，15：393.
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[10] Barnes WM. PCR amplification of up to 35Kb DNA with high fidelity and high yield from λ bacterio-phage templates. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2216.
(收稿：1997-07-12), 百拇医药
单位：200040 上海市儿童医院 上海医学遗传研究所
关键词：地中海贫血；α珠蛋白基因；诊断
上海医学990205 【摘要】 目的 分析124例HbH患者的α珠蛋白基因的分子缺陷状况及其分布，为HbH的基因诊断和产前诊断提供科学依据。 方法 应用Southern印迹杂交、限制性内切酶分析PCR产物、血红蛋白电泳和Long PCR等技术，对受检HbH病患者的α珠蛋白基因组织进行了鉴定。 结果 在124例HbH病患者中，缺失型患者有83例，占66.9%；其中右侧缺失型(α-3.7)45例，占缺失型患者总数的54.2%，主要分布于广东、湖北、云南等省区，左侧缺失型(α-4.2)38例，占缺失型患者总数的45.8%，主要分布在广西和江西；非缺失型患者41例，占33.1%；其中HbConstnt Spring(HbCS)患者9例，占非缺失型患者总数的22.0%，Hb广西(HbQS)患者3例，占非缺失型患者总数的7.3%，其他α+地贫突变类型29例，占非缺失型总数的70.7%。 结论 不同地区HbH患者的α珠蛋白基因的突变类型有明显的差异，该项研究为HbH病的分子遗传学和HbH病的基因诊断提供了依据。
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An analysis of α-globin genes in 124 cases with HbH disease
CHEN Jian, SUN Qiong, CHEN Meijue, et al.
Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children's Hospital, 200040
【Abstract】 Objective To analyze the molecular abnormalities as well as the distribution of α-globin genes in 124 cases with HbH disease; and provide scientific basis for molecular diagnosis and prenatal diagnosis in this hemoglobin disorder. Methods α-globin gene tissue of 124 cases with HbH disease were analyzed by Southern blot hybridization, restriction mapping of PCR products, hemoglobin electrophoresis and Long PCR technology. Results In 124 cases, 83 were identified to be the deletional type, accounting for 66.9%. Among the 83,45 cases belonged to the rightward type of deletion (α-3.7) and 38 cases were leftward type of deletion (α-4.2). The patients with rightward type of deletion mainly distributed in Guangdong, Hubei and Yunnan provinces, while patients with leftward type of deletion lived in Guangxi and Jiangxi. Another 41 cases were identified as non-deletional type of HbH disease, acounting for 33.1% of the tested cases. Among these patients, 9 cases were HbConstant Spring (HbCS) and 3 were HbQong-Sze(HbQS). The other remaining 29 cases were α+ thalassemia mutations which occupied 70.7% of the total non-deletional cases. Conclusion The molecular abnormalities of α-globin genes in HbH patients were significantly different in different regions. This study provides useful knowledge for the understanding the molecular genetics of HbH disease as well as for molecular diagnosis in the regions where the disease is prevalent.
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【Key words】 Thalassemia α-globin gene Diagnosis
该项研究受国家自然科学基金(39770711)和卫生部科学基金(96-1-323)资助 HbH病是我国较为常见的一种α地中海贫血(简称地贫)类型，患者由于三个α珠蛋白基因缺失或缺陷，导致α珠蛋白肽链的合成速率的明显降低，过剩的β珠蛋白肽链形成β4四聚体-HbH，并在红细胞内形成HbH包涵体，引起慢性溶血性贫血[1]。因HbH病患者的一条16号染色体缺失了两个α珠蛋白基因，故为α0地贫突变，我国的绝大部分患者都表现为东南亚缺失型突变(--SEA)[2]；患者的另一条16号染色体上则表现为α+地贫突变，即一个α珠蛋白基因正常但另一个α珠蛋白基因缺失或缺陷。α+地贫突变又可分成缺失型和非缺失型α地贫突变两大类，最常见的缺失类型是3.7kb缺失(α-3.7)，即右侧缺失型和4.2kb缺失(α-4.2)，即左侧缺失型[3]。非缺失型α地贫目前已报道了27种不同的点突变类型[4]，而在中国和东南亚地区，主要是HbGuong-Sze(广西，HbQS，即α2珠蛋白基因第125位密码子(CD125)CTG→CCG)和HbConstant Spring(HbCS，即α2珠蛋白基因第142位密码子(CD142)TAA→CAA)两类[5，6]。本文分析124例HbH患者的α珠蛋白基因异常的情况，特别是α+地贫的不同类型在我国的地理分布，为深入开展HbH病的分子遗传学研究以及其基因诊断等提供有价值的科学资料。
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材料和方法
一、材料
124例HbH患者分别来自广西、江西、广东、湖北、云南和四川等省、自治区。经血液学检查确诊后，取5ml静脉血置于含1ml柠檬酸钠-葡萄糖保养液的试管内混匀。
二、方法
(一) DNA抽提 按文献[7]的方法抽提外周血白细胞DNA。
(二) 血红蛋白组成和理化性质测定 按上海医学遗传研究所常规方法进行测定[8]。血红蛋白电泳图谱中如发现特异的HbCS带，即可诊断为HbCS型α+地贫突变。
(三) α珠蛋白基因分析 (1) α珠蛋白基因缺失的检测：以Southern印迹杂交技术[3]进行。用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别酶解DNA样品，经电泳、变性、中和后转移到硝酸纤维薄膜上，用(α-32P)dCTP(Amersham, 110TBq/mmol)标记的α珠蛋白基因探针进行杂交，洗膜后放射自显影。(2) HbQS的检测：α2珠蛋白基因第125位密码子(CD125)CTG→CCG点突变则增添了一个新的HpaⅡ的切点(5′-CCGG-3′)，因此选用HpaⅡ限制性内切酶来酶解包含HbQS突变位点的α2珠蛋白基因的PCR扩增产物，就可以方便地鉴定正常或突变的等位基因。PCR扩增产物的长度为328bp，上游引物为5′-TGACCCTCTTCTCTGCACAGC-3′；下游引物为：5′-GTCTGAGACAGGTAAACACCTCC-3′。正常的α2珠蛋白基因扩增产物经HpaⅡ酶解后将出现218bp、70bp和40bp三个片段；HbQS的α2珠蛋白基因扩增产物经酶解后则出现122bp、96bp、70bp和40bp四个片段。根据酶解片段的不同可以确定是否为HbQS型α+地贫突变。(3) 长片段PCR(Long PCR)对α珠蛋白基因缺失的诊断：应用本所建立的应用长片段PCR技术对部分患者进行了α珠蛋白基因的分析[9]，在α2珠蛋白基因的上游和α1珠蛋白基因的下游非同源区设计了一对引物，它们的序列分别为5′-ACTGTAGATACCCGTGTACA ACC-3′和5′-GAGGCCCAAGGGGCAAGAAGCA T-3′。在正常的α珠蛋白基因组织能特异地扩增出包括α2和α1珠蛋白基因在内的6.4kb的DNA片段；而在右侧缺失型α珠蛋白基因组织(α-3.7)，扩增片段的大小则为2.6kb。根据这些扩增片段的不同组合，结合Southern图谱可以鉴定出患者α珠蛋白基因缺失的类型。
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结果
应用Southern印迹杂交、限制性内切酶分析PCR产物、长片段PCR以及血红蛋白电泳等技术，对来自广西、江西、广东、湖北、云南和四川等省、自治区共124例经血液学检查确诊的HbH病患者的α珠蛋白基因组织进行了鉴定。结果表明：缺失型患者有83例，占66.9%；其中右侧缺失型(α-3.7)45例，占缺失型患者总数的54.2%，左侧缺失型(α-4.2)38例，占缺失型患者总数的45.8%。124例HbH病患者中，非缺失型患者41例，占33.1%；其中HbCS患者9例，占22.0%，HbQS患者3例，占7.3%，其他类型29例，占70.7%。124例HbH病患者的α+地贫突变种类和地理分布见表1。部分HbH病患者的Southern印迹杂交图谱(用Bgl Ⅱ消化)见图1；HpaⅡ酶解α2珠蛋白基因PCR产物检测HbQS的部分结果见图2；长片段PCR检测右侧缺失型α珠蛋白基因的结果见图3。
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表1 124例HbH病的类型和地理分布 地区
病例数
非缺失型
缺失型
α+-thal
α-QS
α-CS
α-3.7
α-4.2
广西
57
16
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2
17
22
江西
29
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1
5
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广东
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湖北
17
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云南
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四川
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总计
124
29
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9
45
38
图1 HbH患者的Southern blot放射性字显影图谱(DNA用BglⅡ消化，32P标记的α-珠蛋白基因cDNA为探针)
1，2，6：右侧缺失型HbH病患者，仅显示16.5kb的α-珠蛋白基因片段，而没有正常人的12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段。
3：正常人，显示12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段。
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4：α0地贫杂合子，显示12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段，但其放射自显影强度比正常人的弱(只有正常人的一半左右)。
5：右侧缺失型α+地贫杂合子：除具有正常人的12.5kb和7.7kb的α-珠蛋白基因片段外，还有16.5kb的片段。
图2 应用Long PCR技术分析α-珠蛋白基因的缺失的琼脂糖凝胶电泳图
M: 123bp梯度分子量标志。
1： 正常人，显示6.4kb的扩增区带。
2： 右侧缺失型α+地贫杂合子：除显示6.4kb的扩增区带外，还有2.6kb的扩增带。
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3： 右侧缺失型HbH病患者：仅有2.6kb的扩增带。
图3 PCR/HapⅡ酶解图谱分析HbQS(α2 125CTG→CCG)突变
M：50bp梯度DNA分子量标记。
1： --/αQSα个体：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
2： --/αQSα个体：PCR产物经HapⅡ酶解，显示122bp,96bp,70bp和40bp四个片段。
3： 正常人：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
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4： 正常人：PCR产物经HapⅡ酶解，显示218bp,70bp和40bp三个片段。
5： αα/αQSα个体：PCR产物未经HapⅡ酶解，仅有328bp扩增区带。
6： αα/αQSα个体：PCR产物经HapⅡ酶解，显示218bp，122bp，96bp，70bp和40bp五个片段。讨论
从遗传学角度来看，HbH病是α+地贫和α0地贫的双重杂合子，由于四个α基因中有三个缺失或缺陷，使α链的合成受到严重影响，而相对过剩的β珠蛋白肽链则形成HbH(β4)。HbH是一种不稳定的四聚体，其β链上的巯基(-SH)易被氧化，导致β4的解体，生成游离的β链。游离β链不能稳定地存在于红细胞内，结果沉淀聚积，形成H包涵体，附着于红细胞膜上，使红细胞膜受损，红细胞失去柔韧性，易被脾脏破坏，导致慢性溶血性贫血[1]。近年来，对HbH病的分子生物学的研究结果揭示，该病的分子基础是α珠蛋白基因缺失和α珠蛋白基因点突变[4]。由于α珠蛋白基因之间存在着高度同源性，故在减数分裂时同源染色体之间可产生错位配对而引发不等交换，导致α珠蛋白基因簇不同程度的缺失。在中国人中，α珠蛋白基因缺失的类型主要有三种：东南亚缺失型(--SEA)，缺失范围包括α2和α1珠蛋白基因在内约20kb的片段，为α0地贫；右侧缺失型(α-3.7)，缺失片段的大小约为3.7kb，包括α2珠蛋白基因的3′端和α1珠蛋白基因的5′端；左侧缺失型(α-4.2)，缺失了整个α2珠蛋白基因，缺失片段的长度为4.2kb，右侧缺失型和左侧缺失型两者均为α+地贫。我国目前已明确的α地贫点突变，即非缺失型突变有两种，一种是HbCS，α2珠蛋白基因的第142位终止密码子TAA突变成编码谷氨酰胺的CAA，肽链处延合成到173位的第二个终止密码子结束；另一种是HbQS，乃由于α2珠蛋白基因第125位密码子突变使原来编码亮氨酸变为编码脯氨酸所致。两者都导致α+地贫。
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本文结果显示：我国缺失型HbH病患者占66.9%，非缺失型患者占33.1%，表明缺失型是形成HbH病的主要原因。α+地贫基因缺失的类型，在不同地区的人群中发生的频率并不一致。广东和湖北两省的患者以右侧缺失型为主，而广西和江西的左侧缺失型的比例略高于右侧缺失型。总体上右侧缺失型略高，占缺失型总数的54.2%，左侧缺失型则占46.8%。在41例非缺失型α+地贫基因中，HbCS9例，占22.0%，HbQS 3例，占7.3%，其他类型29例，占70.7%。尤其是广西壮族自治区的18例非缺失型患者中，HbCS只有2例，这与以往的报道结果[5，6]有所不同，可能是取材的差异所致。此外，本文报道的9例HbCS中5例发生在江西省，这与左侧缺失型较高的地理分布相吻合。本文报道的41例非缺失型HbH病患者中，还有29例尚未确定α+地贫基因的突变类型，进一步阐明这些α+地贫基因的分子机理，对于丰富我国地中海贫血的分子遗传学资料，在该病高发地区开展基因诊断和产前诊断具有重要的意义。
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在对α地贫实施基因诊断时，由于α1和α2珠蛋白基因及其旁侧序列之间存在着广泛的同源性，故应用普通PCR往往难以鉴定α珠蛋白基因的突变情况及其类型，目前对α地贫(包括HbH病)的基因诊断主要依靠限制性内切酶分析技术。长片段PCR是近年新发明的一种能扩增出很长DNA片段的PCR技术[10]，在长片段PCR体系中，除了包含有TaqDNA聚合酶外，还有一定比例的具有3′→5′外切酶活性的耐热聚合酶，故可切除PCR反应中引入的错配硷基，降低扩增产物的硷基错配率，克服普通PCR限制片段延伸的因素，因此长片段PCR可以扩增出十几甚至几十千硷基对的DNA片段。最近我们利用长片段PCR技术的这一特点，在α珠蛋白基因的上下游非同源区设计一对长片段PCR引物，并通过长片段PCR，成功地诊断我国最常见的右侧缺失型HbH病(α-3.7/--)，为HbH病的基因诊断提供了又一种简便、快速和可靠的方法[9]。
HbH病是α地贫中较为严重的一种类型，目前仍以输血为主要的治疗手段，对于长期严重贫血患者，可试用脾脏切除或脾静脉栓塞术，可使部分患者的血红蛋白回升；而在疾病高发地区，积极开展α珠蛋白基因分析对HbH病高危胎儿进行产前诊断，避免患儿的出生则是一项预防该病发生的有效措施。
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参考文献
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[10] Barnes WM. PCR amplification of up to 35Kb DNA with high fidelity and high yield from λ bacterio-phage templates. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2216.
(收稿：1997-07-12), 百拇医药