反义RNA对地中海贫血红系细胞β-珠蛋白mRNA异常剪接的纠正作用
作者：陈云弟 顾小锋 宫澜 任兆瑞 黄淑帧 曾溢滔
单位：200040 上海市儿童医院 上海医学遗传研究所
关键词：β-地中海贫血；反义RNA；基因治疗；红系细胞
上海医学990204 【摘要】 目的 研究反义RNA对β-地中海贫血红系细胞IVS2-654C→T(β654)突变mRNA异常剪接的纠正作用。方法 构建特异性针对β654mRNA前体异常剪接位点的反义RNA表达载体，和不针对上述位点的反义对照载体，转染培养的β654红系细胞后，抽提总RNA；以RT-PCR法作mRNA定量，检测正常和异常剪接的β-珠蛋白mRNA产物的比例[β/(β+β*)]；以珠蛋白肽链体外生物合成分析红系细胞中β-和α-珠蛋白肽链合成的比例(β/α)。结果 在RNA水平，β654/β654纯合子的β/(β+β*)值由0.19(转染后第0天)上升到0.58(第8天)，β654/βA杂合子由0.45(0天)上升到0.83(第8天)；在珠蛋白肽链水平，β654/β654细胞的β/α值由0.16(0天)上升到0.52(第8天)，β654/βA细胞由0.39(0天)上升到0.84(第8天)。反义RNA处理βA/βA红系细胞以及对照RNA处理这3类红系细胞，对其mRNA剪接和珠蛋白肽链合成均影响不大。结论 特异性反义RNA能抑制红系细胞β654mRNA前体的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径，从而改善珠蛋白肽链合成的不平衡状况。
, 百拇医药
Repair of thalassemic human β-globin mRNA in cultured erythroid cells by antisense RNA
CHEN Yundi, GU Xiaofeng, GONG Lan, et al.
Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children's Hospital, 200040
【Abstract】 Objective To investigate the restoration of correct splicing of β-thalassemia allele (IVS2-654C→T,β654) in cultured erythroid cells by antisense RNA.Methods Vectors transcribing an antisense RNA that was targeted against the aberrant splice sites of β654 pre-transcript(pCMVA) and transcribing a control antisense fragment (pCMVC) were constructed. The total RNA was extracted at given time point after transfection, and the effect of antisence RNA was studied by RT-PCR mediated mRNA quantitative assay as well as globin chain microbiosynthesis. Results The antisense fragment transcribed from pCMVA effectively improved the β654 splicing pattern in cultured erythroid cells. The level of correctly spliced transcript increased from 0.19(day 0 after transfection) to 0.58 (day 8) in β654/β654 homozygous erythroid cells, and from 0.45(day 0) to 0.83(day 8) in β654/βA heterozygous erythroid cells, as determined by the ratio of normally spliced β-globin transcript over total β-globin transcript. Correspondingly, the ratios of globin chain biosynthesis(β/α) increased from 0.16(day 0) to 0.52( day 8) in β654/β654 erythroid cells, and from 0.39(day 0) to 0.84(day 8) in β654/βA erythroid cells. Antisense RNA has no significant effect on the splicing pattern in βA/βA erythroid cells. The splicing pattern in transfected cells with pCMVA showed significant changes compared to that in untransfected cells and in transfected cells with pCMVc. Conclusions The antisense RNA transcribed from the mammalian expression vector pCMVA could efficiently and specifically suppress the aberrant splicing pattern of β654 mutant pre-transcript and restore the correct splicing pathway in vivo, leading to improvement of globin chain biosynthesis in thalassemic cells.
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【Key words】 β-Thalassemia Antisense RNA Gene therapy Erythroid cell
β-地中海贫血(β-地贫)是一种遗传性血液疾病，流行于地中海流域、中东、东南亚和非洲地区。已知导致β-珠蛋白基因表达缺陷或β-珠蛋白链缺乏的地中海突变190多种，但是世界范围内约90%的病例是由其中不到10种引起的[1]。在这些热点突变中，引起人β-珠蛋白基因内含子1剪接异常的突变在东欧南部、塞浦路斯、黎巴嫩(IVS1-110)，印度、马来西亚和印度尼西亚(IVS1-5)占优势；另2种剪接突变IVS1-6和IVS2-745在上述国家也很普遍。而IVS2-654C→T突变(β654)常见于中国和泰国[2]。所有这些突变均激活异常剪接位点，改变剪接途径，虽然正确的剪接位点仍然具有潜在活力。如β654突变在IVS2第653位产生了一个新的5′供体剪接位点，同时激活了第579位一个潜在的3′受体剪接位点，导致IVS2一段长73bp的序列被作为额外的外显子插入到外显子2和3之间[2]，引起β-地贫表现型。
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我们和其他作者[3]认为：采用特异性反义核酸封闭异常剪接位点或其他剪接元件有可能迫使剪接机制回到正确的剪接途径，诱导形成正常β-珠蛋白mRNA和多肽链，从而恢复β-珠蛋白基因的功能。为此，我们构建了特异性针对β654mRNA前体异常剪接位点的反义RNA表达载体和不针对上述位点的反义对照载体，在培养的β654红系细胞中观察反义RNA处理对β654mRNA剪接模式和珠蛋白肽链合成的影响。目前反义核酸大多用来序列特异性地下调基因表达[4]。与此不同，我们的研究提供了一条利用反义RNA恢复突变基因功能的新途径。
材料和方法
一、病例
4个无血缘关系的β-地贫患者和3个正常人的血样来自上海医学遗传研究所遗传门诊。他们的基因型经分子诊断确定，血液学和分子生物学资料见表1。采集血样前均得到他们的书面许可。
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表1 受检者的血液学和分子生物学资料 例号
性别-年龄
(岁)
Hb(g/L)
Ret.(%)
MCV(fl)
MCH(pg)
MCHC(%)
HbA2(%)
HbF(%)
β地贫类型
基因型
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(β+γ)/αa
1
M-5
40.0
1.6
61.0
17.4
28.6
2.0
22.1
重型
β654/β654
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0.31
2
M-30
138.0
1.2
65.2
20.9
32.1
3.5
4.7
轻型
β654/βA
0.78
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3
F-27
115.0
1.4
68.0
19.2
28.2
3.9
2.1
轻型
β654/βA
0.71
4
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M-54
121.0
0.5
67.0
21.0
31.0
3.6
1.9
轻型
β654/βA
未测
5
M-46
, 百拇医药
153.0
1.1
93.5
33.3
35.6
1.8
1.4
正常
βA/βA
0.97
6
M-33
158.0
, 百拇医药
1.2
94.2
34.3
36.1
1.7
1.8
正常
βA/βA
0.98
7
M-51
147.0
1.1
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95.1
33.5
35.9
1.8
1.6
正常
βA/βA
1.01
α珠蛋白肽链体外生物合成实验结果
二、反义RNA表达载体和对照载体的构建
从β654纯合子基因组DNA中PCR扩增获得的反义片段A长207bp,覆盖IVS2 nt.457-663，针对β654mRNA前体的两个异常剪接位点IVS2-579和IVS2-653；所用引物为5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′和5′-ATTGCTATTAC CTTAACCC-3′。对照片段C来自人SRY(Sex Determinning Region Y)基因，长218bp，与人β珠蛋白基因完全不同源，PCR扩增引物为5′-CCATGAACGCATTCATCGTGTGG-3′和5′-CGCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3′。A和C分别插入真核表达载体pcDNA3(Invitragen)。质粒的提取、酶切、连接和细菌转化等基因工程操作按Sambrook等的方法[5]进行。得到2个克隆：反义片段表达载体pCMVA和对照片段表达载体pCMVC(图1)。所有克隆均经测序(Thermo sequenase cycle sequencing kit, Amersham)鉴定。
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三、β654红系细胞转染
从20～25ml受检者外周血中以Ficoll-Hypaque梯度(1.077 g/ml)分离单个核细胞，进行双相液体红系细胞培养[6]。在第二相的第6天，用3μg pCMVA或pCMVC按厂方说明书分别与15μg lipofectin(GIBCO/BRL)及5×106个细胞保温，转染后0、3、6、8天(即第二相的第6、9、12、14天)抽取总RNA[7]，用无RNase的DNase I(Promega)去除RNA样品中混杂的少量DNA后，进行β-珠蛋白基因转录的mRNA定量分析。同时分别取部分细胞进行细胞计数、形态观察和珠蛋白肽链体外生物合成分析。
图1 反义RNA表达载体pCMVA和对照载体pCMVC构建流程。A：针对βIVS2-654 C→T突变剪接位点的反义片段；C：来自SRY基因的对照片段；pCMV：人巨大细胞病毒(human cytomegalovirus, CMV)启动子；SVori:SV40复制起始位点；ColE1:ColE1复制起始位点；NeoR:新霉素抗性基因；Amp:青霉素抗性基因。Ap:ApaⅠ;N:NotⅠ.
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四、RNA分析
0.5μg总RNA用于RT-PCR反应[8]，引物为5′-CTCGGTGCCTTTAGTGATGG-3′和5′-AGCCTGCACTGGTGGGGTG-3′。反应混合物中加1μl[α-32P]dCTP(29.6GBq/mol,Amersham),94°C变性1分钟，63°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，28个循环。从凝胶上切下扩增得到的正常和异常剪接的β-珠蛋白cDNA带和一条对照空白带，液体闪烁计数(LKB)，计算正常剪接的β-珠蛋白mRNA与总β-珠蛋白mRNA的比值[β/(β+β*)]。RT-PCR介导的mRNA相对定量的线形范围和效率按前述方法[8]确定。
五、珠蛋白肽链体外合成分析
1×106个红系细胞与含有18种L-氨基酸(Sigma, Cat.No.LAA-21)和[2,3，4，5-3H]亮氨酸(4.48 TBq/mmol,ICN)的生物合成混合物37°C保温2小时，用冷盐水洗2次，加入4倍体积的水4°C裂解20分钟，然后10 000×g离心10分钟去除细胞残骸，取20μl裂解液用HPLC分离新合成的珠蛋白肽链[9]，每1.2ml收集液与10ml闪烁液混匀后，液体闪烁计数，计算β-和α-珠蛋白肽链生物合成的比例(β/α)。结果
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一、反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞β654mRNA异常剪接的纠正作用
pCMVA转染后，培养的β654红系细胞β-珠蛋白mRNA的剪接模式得到了极大改善(图2，表2)：β654纯合子(病例1)正常剪接的mRNA比例[β/(β+β*)]由0.19(转染后0天)上升到0.58(第8天)；β654/βA杂合子(病例2～4)由0.45(0天)上升至0.83(第8天)；βA/βA细胞(病例5～7)未见明显差别。未转染和pCMVC转染β654纯合子、β654/βA杂合子、βA/βA细胞均未显示明显差别。提示在培养红系细胞内，pCMVA转录产生的反义RNA能抑制β654突变mRNA前体的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径。
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图2 反义RNA表达载体对培养的β654红系细胞β-珠蛋白mRNA前体异常剪接的纠正作用。(a) β654/β654纯合子；(b) β654/βA杂合子；
(c) 正常人对照。M:123bpDNA分子量标记；1～4道：pCMVC转染，第0，3，6，8天；5～7道:
pCMVA转染，第3，6，8天；183bp带：正常剪接产物(β)；256bp带：异常剪接产物(β*)表2 反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞
β654mRNA异常剪接的纠正作用[β/(β+β*)] 时间(天)
0
, 百拇医药
3
6
8
β654/β654a
pCMVA
0.19
0.44
0.44
0.58
pCMVC
0.21
0.13
, 百拇医药 0.21
0.23
未转染
0.19
0.20
0.15
0.20
β654/βA
pCMVAb
0.45±0.06
0.65±0.06
0.72±0.02
, 百拇医药
0.83±0.06
pCMVCc
0.41
0.53
0.46
0.42
未转染b
0.45±0.06
0.48±0.03
0.46±0.05
0.43±0.03
βA/βA
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pCMVAb
0.95±0.03
0.94±0.03
0.94±0.04
0.90±0.08
pCMVCc
0.96
0.96
0.97
0.96
未转染b
0.95±0.03
, 百拇医药
0.92±0.05
0.95±0.03
0.94±0.03
a 3次实验的平均值；b 3个病例的X±SX；c 2个病例的平均值。
二、反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞珠蛋白肽链生物合成不平衡的纠正作用
培养的β654红系细胞经pCMVA转染后，其珠蛋白肽链生物合成比例(β/α)也得到了显著改善(表3)：β654纯合子(病例1)的β/α值由0.16(0天)上升到0.52(第8天)，β654/βA细胞(病例2～4)由0.39(0天)上升到0.84(第8天)，而βA/βA细胞(例5～7)未显示明显差别。同样，未转染和pCMVC转染的β654纯合子β654/βA杂合子、βA/βA细胞均未显示明显差别。这些结果提示，由pCMVA转录产生的反义RNA能改善β654红系细胞的珠蛋白肽链生物合成比例。
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三、反义RNA表达载体转染对培养红系细胞的细胞学影响
我们在转染后0、3、6、8天对培养的红系细胞进行了细胞计数和形态观察，未见反义载体和脂质体对细胞的形态、生长、发育和分化有任何显著影响(数据未显示)，提示载体转染没有引起显著的副作用。表3 反义RNA表达载体pCMVA转染对β654红系
细胞珠蛋白肽链生物合成不平衡的纠正作用(β/α) 时间(天)
0
3
6
8
β654/β654a
, 百拇医药
pCMVA
0.16
0.27
0.30
0.52
pCMVC
0.16
0.21
0.21
0.22
未转染
0.16
0.20
, 百拇医药
0.18
0.21
β654/βA
pCMVAb
0.39±0.03
0.59±0.01
0.77±0.05
0.84±0.03
pCMVCc
0.39
0.43
, 百拇医药
0.39
0.46
未转染b
0.39±0.03
0.40±0.03
0.56±0.05
0.59±0.01
βA/βA
pCMVAb
0.91±0.01
0.93±0.06
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0.97±0.01
0.94±0.01
pCMVCc
1.03
0.97
0.98
1.01
未转染b
0.91±0.01
0.95±0.01
0.96±0.01
0.93±0.01
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a 3个实验的平均值;b 3个病例的X±SX;c 2个病例的平均值。
讨论
β-地贫的主要特征为成人型血红蛋白(HbA,α2β2)不足或缺乏，主要病理变化为珠蛋白肽链合成不平衡[10]。β654突变在形成异常剪接的β mRNA的同时，还能形成少量正常的β mRNA[2] ，是一种β+-地贫。因此，有可能通过提高其正常mRNA水平来改善或部分改善患者临床症状，使得β654成为遗传病基因治疗研究的理想对象。反义RNA用于调节基因表达和基因治疗的可能性是当前研究的热点[11]。我们设计了一种特异性针对β654mRNA异常剪接位点的反义片段，克隆进真核表达载体pcDNA3。重组子能在β654红系细胞内转录出目标反义RNA，阻断突变mRNA的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径，使正常剪接的β-珠蛋白mRNA增多。而且，反义RNA作用后产生的正常β mRNA能翻译出β-珠蛋白肽链：β654/β654细胞的珠蛋白肽链生物合成比例(β/α)由0.16(转染后0天)上升到0.52(第8天)，证明反义RNA改善了β654红系细胞中珠蛋白肽链合成的不平衡状况。
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我们将来自SRY基因的一个长度相近的片段作为对照。结果表明，只有针对异常剪接位点的反义片段能纠正β654mRMA的剪接方式，对照片段对此没有显著影响，提示反义RNA的作用是序列特异性的。
与反义寡核苷酸相比，我们策略的优势在于构建了一个真核表达载体pCMVA。它能在靶细胞中持续转录产生目标反义RNA片段。当反义RNA的转录与降解达到动态平衡时，就可以在靶细胞内维持一定的反义RNA浓度，因此1次转染就可以输入足量的反义核酸，避免了反复输入化学修饰的反义寡核苷酸的不便和昂贵费用。
值得注意的是，载体pCMVA在靶细胞中比较稳定，并能随着细胞传代而传递下去。虽然还未确定载体在所转染的细胞中的存在状态，但是我们已经从转染pCMVA后保存1年的β654HeLa细胞中回收了该载体。将回收的pCMVA再转染另外的β654HeLa细胞，仍可纠正β654mRNA前体的异常剪接。这一结果既说明反义载体在真核细胞内有一定的稳定性，也从一个方面证明了β654异常剪接的纠正作用的确是反义RNA作用的结果。
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我们先前的研究证明：红系细胞液体培养系统能忠实地模拟生理条件下人类红系细胞的生长、发育和分化状况，代表体内发育过程中由于珠蛋白基因表达开关的作用，而引起的珠蛋白肽链合成的改变[9]。采用这一系统，我们检测了反义载体和对照载体处理后的细胞活力，未见载体转染对细胞的发育和分化有任何副作用(数据未显示)，提示反义处理对靶细胞毒性很小。
反义RNA纠正剪接缺陷并不局限于β654突变。据报道，遗传病的点突变中有将近15%导致剪接缺陷[12]，因此这一技术有广泛的潜在应用价值。
本课题由国家自然科学基金(No.39392903,39780019)和上海生命科学研究中心研究基金(No.95JC14009)资助参考文献
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(收稿：1998-07-01), 百拇医药
单位：200040 上海市儿童医院 上海医学遗传研究所
关键词：β-地中海贫血；反义RNA；基因治疗；红系细胞
上海医学990204 【摘要】 目的 研究反义RNA对β-地中海贫血红系细胞IVS2-654C→T(β654)突变mRNA异常剪接的纠正作用。方法 构建特异性针对β654mRNA前体异常剪接位点的反义RNA表达载体，和不针对上述位点的反义对照载体，转染培养的β654红系细胞后，抽提总RNA；以RT-PCR法作mRNA定量，检测正常和异常剪接的β-珠蛋白mRNA产物的比例[β/(β+β*)]；以珠蛋白肽链体外生物合成分析红系细胞中β-和α-珠蛋白肽链合成的比例(β/α)。结果 在RNA水平，β654/β654纯合子的β/(β+β*)值由0.19(转染后第0天)上升到0.58(第8天)，β654/βA杂合子由0.45(0天)上升到0.83(第8天)；在珠蛋白肽链水平，β654/β654细胞的β/α值由0.16(0天)上升到0.52(第8天)，β654/βA细胞由0.39(0天)上升到0.84(第8天)。反义RNA处理βA/βA红系细胞以及对照RNA处理这3类红系细胞，对其mRNA剪接和珠蛋白肽链合成均影响不大。结论 特异性反义RNA能抑制红系细胞β654mRNA前体的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径，从而改善珠蛋白肽链合成的不平衡状况。
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Repair of thalassemic human β-globin mRNA in cultured erythroid cells by antisense RNA
CHEN Yundi, GU Xiaofeng, GONG Lan, et al.
Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children's Hospital, 200040
【Abstract】 Objective To investigate the restoration of correct splicing of β-thalassemia allele (IVS2-654C→T,β654) in cultured erythroid cells by antisense RNA.Methods Vectors transcribing an antisense RNA that was targeted against the aberrant splice sites of β654 pre-transcript(pCMVA) and transcribing a control antisense fragment (pCMVC) were constructed. The total RNA was extracted at given time point after transfection, and the effect of antisence RNA was studied by RT-PCR mediated mRNA quantitative assay as well as globin chain microbiosynthesis. Results The antisense fragment transcribed from pCMVA effectively improved the β654 splicing pattern in cultured erythroid cells. The level of correctly spliced transcript increased from 0.19(day 0 after transfection) to 0.58 (day 8) in β654/β654 homozygous erythroid cells, and from 0.45(day 0) to 0.83(day 8) in β654/βA heterozygous erythroid cells, as determined by the ratio of normally spliced β-globin transcript over total β-globin transcript. Correspondingly, the ratios of globin chain biosynthesis(β/α) increased from 0.16(day 0) to 0.52( day 8) in β654/β654 erythroid cells, and from 0.39(day 0) to 0.84(day 8) in β654/βA erythroid cells. Antisense RNA has no significant effect on the splicing pattern in βA/βA erythroid cells. The splicing pattern in transfected cells with pCMVA showed significant changes compared to that in untransfected cells and in transfected cells with pCMVc. Conclusions The antisense RNA transcribed from the mammalian expression vector pCMVA could efficiently and specifically suppress the aberrant splicing pattern of β654 mutant pre-transcript and restore the correct splicing pathway in vivo, leading to improvement of globin chain biosynthesis in thalassemic cells.
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【Key words】 β-Thalassemia Antisense RNA Gene therapy Erythroid cell
β-地中海贫血(β-地贫)是一种遗传性血液疾病，流行于地中海流域、中东、东南亚和非洲地区。已知导致β-珠蛋白基因表达缺陷或β-珠蛋白链缺乏的地中海突变190多种，但是世界范围内约90%的病例是由其中不到10种引起的[1]。在这些热点突变中，引起人β-珠蛋白基因内含子1剪接异常的突变在东欧南部、塞浦路斯、黎巴嫩(IVS1-110)，印度、马来西亚和印度尼西亚(IVS1-5)占优势；另2种剪接突变IVS1-6和IVS2-745在上述国家也很普遍。而IVS2-654C→T突变(β654)常见于中国和泰国[2]。所有这些突变均激活异常剪接位点，改变剪接途径，虽然正确的剪接位点仍然具有潜在活力。如β654突变在IVS2第653位产生了一个新的5′供体剪接位点，同时激活了第579位一个潜在的3′受体剪接位点，导致IVS2一段长73bp的序列被作为额外的外显子插入到外显子2和3之间[2]，引起β-地贫表现型。
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我们和其他作者[3]认为：采用特异性反义核酸封闭异常剪接位点或其他剪接元件有可能迫使剪接机制回到正确的剪接途径，诱导形成正常β-珠蛋白mRNA和多肽链，从而恢复β-珠蛋白基因的功能。为此，我们构建了特异性针对β654mRNA前体异常剪接位点的反义RNA表达载体和不针对上述位点的反义对照载体，在培养的β654红系细胞中观察反义RNA处理对β654mRNA剪接模式和珠蛋白肽链合成的影响。目前反义核酸大多用来序列特异性地下调基因表达[4]。与此不同，我们的研究提供了一条利用反义RNA恢复突变基因功能的新途径。
材料和方法
一、病例
4个无血缘关系的β-地贫患者和3个正常人的血样来自上海医学遗传研究所遗传门诊。他们的基因型经分子诊断确定，血液学和分子生物学资料见表1。采集血样前均得到他们的书面许可。
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表1 受检者的血液学和分子生物学资料 例号
性别-年龄
(岁)
Hb(g/L)
Ret.(%)
MCV(fl)
MCH(pg)
MCHC(%)
HbA2(%)
HbF(%)
β地贫类型
基因型
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(β+γ)/αa
1
M-5
40.0
1.6
61.0
17.4
28.6
2.0
22.1
重型
β654/β654
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0.31
2
M-30
138.0
1.2
65.2
20.9
32.1
3.5
4.7
轻型
β654/βA
0.78
, 百拇医药
3
F-27
115.0
1.4
68.0
19.2
28.2
3.9
2.1
轻型
β654/βA
0.71
4
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M-54
121.0
0.5
67.0
21.0
31.0
3.6
1.9
轻型
β654/βA
未测
5
M-46
, 百拇医药
153.0
1.1
93.5
33.3
35.6
1.8
1.4
正常
βA/βA
0.97
6
M-33
158.0
, 百拇医药
1.2
94.2
34.3
36.1
1.7
1.8
正常
βA/βA
0.98
7
M-51
147.0
1.1
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95.1
33.5
35.9
1.8
1.6
正常
βA/βA
1.01
α珠蛋白肽链体外生物合成实验结果
二、反义RNA表达载体和对照载体的构建
从β654纯合子基因组DNA中PCR扩增获得的反义片段A长207bp,覆盖IVS2 nt.457-663，针对β654mRNA前体的两个异常剪接位点IVS2-579和IVS2-653；所用引物为5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′和5′-ATTGCTATTAC CTTAACCC-3′。对照片段C来自人SRY(Sex Determinning Region Y)基因，长218bp，与人β珠蛋白基因完全不同源，PCR扩增引物为5′-CCATGAACGCATTCATCGTGTGG-3′和5′-CGCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3′。A和C分别插入真核表达载体pcDNA3(Invitragen)。质粒的提取、酶切、连接和细菌转化等基因工程操作按Sambrook等的方法[5]进行。得到2个克隆：反义片段表达载体pCMVA和对照片段表达载体pCMVC(图1)。所有克隆均经测序(Thermo sequenase cycle sequencing kit, Amersham)鉴定。
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三、β654红系细胞转染
从20～25ml受检者外周血中以Ficoll-Hypaque梯度(1.077 g/ml)分离单个核细胞，进行双相液体红系细胞培养[6]。在第二相的第6天，用3μg pCMVA或pCMVC按厂方说明书分别与15μg lipofectin(GIBCO/BRL)及5×106个细胞保温，转染后0、3、6、8天(即第二相的第6、9、12、14天)抽取总RNA[7]，用无RNase的DNase I(Promega)去除RNA样品中混杂的少量DNA后，进行β-珠蛋白基因转录的mRNA定量分析。同时分别取部分细胞进行细胞计数、形态观察和珠蛋白肽链体外生物合成分析。
图1 反义RNA表达载体pCMVA和对照载体pCMVC构建流程。A：针对βIVS2-654 C→T突变剪接位点的反义片段；C：来自SRY基因的对照片段；pCMV：人巨大细胞病毒(human cytomegalovirus, CMV)启动子；SVori:SV40复制起始位点；ColE1:ColE1复制起始位点；NeoR:新霉素抗性基因；Amp:青霉素抗性基因。Ap:ApaⅠ;N:NotⅠ.
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四、RNA分析
0.5μg总RNA用于RT-PCR反应[8]，引物为5′-CTCGGTGCCTTTAGTGATGG-3′和5′-AGCCTGCACTGGTGGGGTG-3′。反应混合物中加1μl[α-32P]dCTP(29.6GBq/mol,Amersham),94°C变性1分钟，63°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，28个循环。从凝胶上切下扩增得到的正常和异常剪接的β-珠蛋白cDNA带和一条对照空白带，液体闪烁计数(LKB)，计算正常剪接的β-珠蛋白mRNA与总β-珠蛋白mRNA的比值[β/(β+β*)]。RT-PCR介导的mRNA相对定量的线形范围和效率按前述方法[8]确定。
五、珠蛋白肽链体外合成分析
1×106个红系细胞与含有18种L-氨基酸(Sigma, Cat.No.LAA-21)和[2,3，4，5-3H]亮氨酸(4.48 TBq/mmol,ICN)的生物合成混合物37°C保温2小时，用冷盐水洗2次，加入4倍体积的水4°C裂解20分钟，然后10 000×g离心10分钟去除细胞残骸，取20μl裂解液用HPLC分离新合成的珠蛋白肽链[9]，每1.2ml收集液与10ml闪烁液混匀后，液体闪烁计数，计算β-和α-珠蛋白肽链生物合成的比例(β/α)。结果
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一、反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞β654mRNA异常剪接的纠正作用
pCMVA转染后，培养的β654红系细胞β-珠蛋白mRNA的剪接模式得到了极大改善(图2，表2)：β654纯合子(病例1)正常剪接的mRNA比例[β/(β+β*)]由0.19(转染后0天)上升到0.58(第8天)；β654/βA杂合子(病例2～4)由0.45(0天)上升至0.83(第8天)；βA/βA细胞(病例5～7)未见明显差别。未转染和pCMVC转染β654纯合子、β654/βA杂合子、βA/βA细胞均未显示明显差别。提示在培养红系细胞内，pCMVA转录产生的反义RNA能抑制β654突变mRNA前体的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径。
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图2 反义RNA表达载体对培养的β654红系细胞β-珠蛋白mRNA前体异常剪接的纠正作用。(a) β654/β654纯合子；(b) β654/βA杂合子；
(c) 正常人对照。M:123bpDNA分子量标记；1～4道：pCMVC转染，第0，3，6，8天；5～7道:
pCMVA转染，第3，6，8天；183bp带：正常剪接产物(β)；256bp带：异常剪接产物(β*)表2 反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞
β654mRNA异常剪接的纠正作用[β/(β+β*)] 时间(天)
0
, 百拇医药
3
6
8
β654/β654a
pCMVA
0.19
0.44
0.44
0.58
pCMVC
0.21
0.13
, 百拇医药 0.21
0.23
未转染
0.19
0.20
0.15
0.20
β654/βA
pCMVAb
0.45±0.06
0.65±0.06
0.72±0.02
, 百拇医药
0.83±0.06
pCMVCc
0.41
0.53
0.46
0.42
未转染b
0.45±0.06
0.48±0.03
0.46±0.05
0.43±0.03
βA/βA
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pCMVAb
0.95±0.03
0.94±0.03
0.94±0.04
0.90±0.08
pCMVCc
0.96
0.96
0.97
0.96
未转染b
0.95±0.03
, 百拇医药
0.92±0.05
0.95±0.03
0.94±0.03
a 3次实验的平均值；b 3个病例的X±SX；c 2个病例的平均值。
二、反义RNA表达载体pCMVA转染对红系细胞珠蛋白肽链生物合成不平衡的纠正作用
培养的β654红系细胞经pCMVA转染后，其珠蛋白肽链生物合成比例(β/α)也得到了显著改善(表3)：β654纯合子(病例1)的β/α值由0.16(0天)上升到0.52(第8天)，β654/βA细胞(病例2～4)由0.39(0天)上升到0.84(第8天)，而βA/βA细胞(例5～7)未显示明显差别。同样，未转染和pCMVC转染的β654纯合子β654/βA杂合子、βA/βA细胞均未显示明显差别。这些结果提示，由pCMVA转录产生的反义RNA能改善β654红系细胞的珠蛋白肽链生物合成比例。
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三、反义RNA表达载体转染对培养红系细胞的细胞学影响
我们在转染后0、3、6、8天对培养的红系细胞进行了细胞计数和形态观察，未见反义载体和脂质体对细胞的形态、生长、发育和分化有任何显著影响(数据未显示)，提示载体转染没有引起显著的副作用。表3 反义RNA表达载体pCMVA转染对β654红系
细胞珠蛋白肽链生物合成不平衡的纠正作用(β/α) 时间(天)
0
3
6
8
β654/β654a
, 百拇医药
pCMVA
0.16
0.27
0.30
0.52
pCMVC
0.16
0.21
0.21
0.22
未转染
0.16
0.20
, 百拇医药
0.18
0.21
β654/βA
pCMVAb
0.39±0.03
0.59±0.01
0.77±0.05
0.84±0.03
pCMVCc
0.39
0.43
, 百拇医药
0.39
0.46
未转染b
0.39±0.03
0.40±0.03
0.56±0.05
0.59±0.01
βA/βA
pCMVAb
0.91±0.01
0.93±0.06
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0.97±0.01
0.94±0.01
pCMVCc
1.03
0.97
0.98
1.01
未转染b
0.91±0.01
0.95±0.01
0.96±0.01
0.93±0.01
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a 3个实验的平均值;b 3个病例的X±SX;c 2个病例的平均值。
讨论
β-地贫的主要特征为成人型血红蛋白(HbA,α2β2)不足或缺乏，主要病理变化为珠蛋白肽链合成不平衡[10]。β654突变在形成异常剪接的β mRNA的同时，还能形成少量正常的β mRNA[2] ，是一种β+-地贫。因此，有可能通过提高其正常mRNA水平来改善或部分改善患者临床症状，使得β654成为遗传病基因治疗研究的理想对象。反义RNA用于调节基因表达和基因治疗的可能性是当前研究的热点[11]。我们设计了一种特异性针对β654mRNA异常剪接位点的反义片段，克隆进真核表达载体pcDNA3。重组子能在β654红系细胞内转录出目标反义RNA，阻断突变mRNA的异常剪接，部分恢复其正常剪接途径，使正常剪接的β-珠蛋白mRNA增多。而且，反义RNA作用后产生的正常β mRNA能翻译出β-珠蛋白肽链：β654/β654细胞的珠蛋白肽链生物合成比例(β/α)由0.16(转染后0天)上升到0.52(第8天)，证明反义RNA改善了β654红系细胞中珠蛋白肽链合成的不平衡状况。
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我们将来自SRY基因的一个长度相近的片段作为对照。结果表明，只有针对异常剪接位点的反义片段能纠正β654mRMA的剪接方式，对照片段对此没有显著影响，提示反义RNA的作用是序列特异性的。
与反义寡核苷酸相比，我们策略的优势在于构建了一个真核表达载体pCMVA。它能在靶细胞中持续转录产生目标反义RNA片段。当反义RNA的转录与降解达到动态平衡时，就可以在靶细胞内维持一定的反义RNA浓度，因此1次转染就可以输入足量的反义核酸，避免了反复输入化学修饰的反义寡核苷酸的不便和昂贵费用。
值得注意的是，载体pCMVA在靶细胞中比较稳定，并能随着细胞传代而传递下去。虽然还未确定载体在所转染的细胞中的存在状态，但是我们已经从转染pCMVA后保存1年的β654HeLa细胞中回收了该载体。将回收的pCMVA再转染另外的β654HeLa细胞，仍可纠正β654mRNA前体的异常剪接。这一结果既说明反义载体在真核细胞内有一定的稳定性，也从一个方面证明了β654异常剪接的纠正作用的确是反义RNA作用的结果。
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我们先前的研究证明：红系细胞液体培养系统能忠实地模拟生理条件下人类红系细胞的生长、发育和分化状况，代表体内发育过程中由于珠蛋白基因表达开关的作用，而引起的珠蛋白肽链合成的改变[9]。采用这一系统，我们检测了反义载体和对照载体处理后的细胞活力，未见载体转染对细胞的发育和分化有任何副作用(数据未显示)，提示反义处理对靶细胞毒性很小。
反义RNA纠正剪接缺陷并不局限于β654突变。据报道，遗传病的点突变中有将近15%导致剪接缺陷[12]，因此这一技术有广泛的潜在应用价值。
本课题由国家自然科学基金(No.39392903,39780019)和上海生命科学研究中心研究基金(No.95JC14009)资助参考文献
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(收稿：1998-07-01), 百拇医药