氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的体内研究
作者：熊树民 贾培敏 阎骅 韩韬 范立权 张敏 陈国强
单位：200025 上海市第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所
关键词：
上海医学990215 细胞凋亡已成为当前肿瘤研究的热点之一[1]，氧化砷和硫化砷等砷化合物治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)为促进凋亡治疗恶性肿瘤这一新的治疗途径提供了成功的范例[2]。我院自1994年12月起应用三氧化二砷(As2O3)治疗了36例APL复发的患者，其中32例达到完全缓解(CR)，CR率占88.9%。本文对本组患者用氧化砷治疗过程中骨髓细胞形态和外周血象变化以及染色体检查进行动态观察，结合我们以往体外培养研究结果，对氧化砷治疗APL的机制进行探讨，并对氧化砷治疗无效的复发病例作了分析。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、病例
36例APL复发患者均系本院住院病例，在初发时经细胞形态学、细胞化学染色、核型分析[染色体易位t(15;17)]和PML-RARα mRNA检测证实的APL患者。男性22例、女性14例，年龄4～54岁，中位年龄33岁。治疗均采用0.1% As2O3注射液(哈医大一附院提供)加入5%葡萄糖溶液500ml中缓缓静脉滴注，持续28～56天。部分病例因出现高白细胞血症(WBC>20×109/L)加用小剂量化疗。
二、骨髓细胞学检查
瑞氏染色的骨髓涂片和血涂片进行细胞形态学观察，并在治疗过程中每1～2周复查，作动态分析。同时记录外周血白细胞数的变化。
三、细胞遗传学检查
, 百拇医药
大部分患者复查了染色体检查。
四、PML-RAR α蛋白的免疫荧光染色
在每日持续静滴As2O3过程中定期抽取骨髓液，涂片作免疫荧光染色[3]。抗PML蛋白N端抗血清由日本Naoe教授提供。
结 果
一、骨髓象改变
在氧化砷治疗过程早幼粒细胞形态上出现两种改变。其一为治疗10～20天早幼粒细胞核浆比例减小，胞浆量较丰富，色蓝，嗜苯胺蓝颗粒显著减少、甚至消失，核染质增粗，核仁明显或隐匿；早幼粒细胞另一种形态改变为核膜向内凹陷，致使核形呈现各种不规则形。早幼粒细胞比例在氧化砷治疗的第10～20天左右明显减低。随着早幼粒细胞的减少，骨髓及外周血的中幼粒细胞比例显著增多，治疗后20～25天达高峰。中幼粒细胞胞体小，胞浆色略红，可见中性颗粒，核染质致密，固缩成块，偶见核碎裂。与此同时骨髓有核细胞增生也显著活跃，一般持续10天左右。涂片中易见比例分布不均匀的“退化细胞”，这种表现可持续至CR。氧化砷治疗20天左右，晚幼粒细胞比例仅轻度增高，约占6%～12%。
, 百拇医药
二、外周血白细胞计数改变
氧化砷治疗后多数病例外周血白细胞数逐渐上升，通常10～22天达高峰。本组有21例白细胞计数上升至10×109/L，最高达167×109/L。除白细胞数>20×109/L用小剂量化疗外，一般病例白细胞数持续5～21天降至正常范围。
三、36例APL在初诊时均证实t(15;17)染色体易位及PML-RAR α3融合基因转录本存在。复发后有3例复查时消失了此种APL特异性核型及融合基因，而其中1例出现染色体t(8;21)易位及AML1-ETO融合基因，细胞形态上亦发现20%的异常中幼粒细胞。另1例转变为急性髓细胞白血病(AML)的M5a型。第3例白血病细胞浆中颗粒明显减少。这3例患者均属用As2O3治疗无效的病例。
, 百拇医药
四、骨髓细胞PML-RAR α/PML蛋白的免疫荧光染色
在治疗前，骨髓细胞内由于PML-RAR α融合蛋白的存在，抗PML染色(POD结构)解体，出现数百个微小颗粒弥漫分布，经AS2O3治疗1～2周后，核内抗PML染色显著减少，直至完全消失。
讨 论
随着细胞分子生物学的迅猛发展，细胞凋亡在正常生命活动和某些疾病，尤其是恶性肿瘤发病学上的重要性越来越为人们所重视。诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的又一途径。哈尔滨医科大学附属第一医院首先报道应用砷剂治疗APL获得显效。我们曾以存在染色体t(15;17)易位和表达PML-RAR α蛋白的APL细胞株NB4细胞和新鲜APL细胞为模型进行研究，发现氧化砷对APL细胞具有剂量依赖性诱导细胞凋亡和部分分化双重效应[4，5]，表现为相对高浓度(1～2μmol/L)的氧化砷快速诱导细胞凋亡，相对低浓度(0.1～0.25μmol/L)的氧化砷体外作用10天后在一定程度上诱导细胞部分分化，0.05μmol/L的氧化砷兼有这两种效应。本文发现在持续每日静脉滴注氧化砷的过程中，治疗10天后异常早幼粒细胞逐渐减少。与此同时，伴随另外两种骨髓象的明显改变：其一，中幼粒样细胞明显增加。在形态学上表现为胞体小，染色质固缩、胞浆嗜天青颗粒消失等，然而，晚幼粒和杆状、分叶核细胞并无明显增加。其二，“退化”细胞明显增加，这些细胞明显失去胞浆成分，而胞核呈现染色质致密和疏松两种变化。这些结果支持我们的体外研究，即氧化砷可能通过诱导凋亡伴细胞部分分化而达到治疗APL的效果。此外，部分病人在用药过程中出现高白细胞血症，也可能支持氧化砷在某种程度上具有部分诱导分化效应。
, 百拇医药
已知APL存在的特异染色体t(15;17)易位产物——PML-RAR α蛋白是APL发生的重要分子基础。体外研究发现，该蛋白既能阻止某些造血细胞分化，也能阻止细胞的凋亡。我们已经发现氧化砷(0.1～2μmol/L)能快速有效调节和降解PML-RAR α/PML蛋白。本文结果也发现在治疗过程中，骨髓白血病细胞核内PML-RAR α/PML蛋白明显减少甚至消失。这些结果提示PML-RAR α蛋白也可能作为一个“靶子”参与氧化砷对APL的效应。在本组治疗无效的4例中，有3例复发时染色体及RT-PCR检查已无APL特异的t(15;17)易位及PML-RAR α融合基因，而转变为AML的其他类型，这也可解释这些患者为什么用氧化砷治疗无效的原因。AML治疗后细胞类型的转化进一步提示其克隆性起源具有异质性。推测这类病例在发病时存在二种异常克隆，初发时APL克隆占优势，经全反式维甲酸和化疗达CR后但未能根除；另一种处于白血病前期克隆，因此，该类型白血病细胞增殖后发病，表现出细胞类型的转化，化疗后骨髓中另一种造血干细胞重建也是原因之一。
, http://www.100md.com 参考文献
[1] 王振义.开展砷剂治疗白血病的临床和机制研究.中华血液学杂志，1996，17：57.
[2] 张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.
[3] Zhu J, Shi XG, Chu HY, et al. Effect of retinoic acid isomers on proliferation, differentiation and PML relocalization in the APL cell line NB4. Leukemia, 1995,9:302-309.
[4] Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARα/PML proteins. Blood,1996,88:1052-1061.
[5] Chen GQ, Shi XG, Tang W, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL):I As2O3 exerts dose-dependent dual effects on APL cells. Blood,1997,89:3345-3353.
(收稿：1998-11-08), 百拇医药
单位：200025 上海市第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所
关键词：
上海医学990215 细胞凋亡已成为当前肿瘤研究的热点之一[1]，氧化砷和硫化砷等砷化合物治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)为促进凋亡治疗恶性肿瘤这一新的治疗途径提供了成功的范例[2]。我院自1994年12月起应用三氧化二砷(As2O3)治疗了36例APL复发的患者，其中32例达到完全缓解(CR)，CR率占88.9%。本文对本组患者用氧化砷治疗过程中骨髓细胞形态和外周血象变化以及染色体检查进行动态观察，结合我们以往体外培养研究结果，对氧化砷治疗APL的机制进行探讨，并对氧化砷治疗无效的复发病例作了分析。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、病例
36例APL复发患者均系本院住院病例，在初发时经细胞形态学、细胞化学染色、核型分析[染色体易位t(15;17)]和PML-RARα mRNA检测证实的APL患者。男性22例、女性14例，年龄4～54岁，中位年龄33岁。治疗均采用0.1% As2O3注射液(哈医大一附院提供)加入5%葡萄糖溶液500ml中缓缓静脉滴注，持续28～56天。部分病例因出现高白细胞血症(WBC>20×109/L)加用小剂量化疗。
二、骨髓细胞学检查
瑞氏染色的骨髓涂片和血涂片进行细胞形态学观察，并在治疗过程中每1～2周复查，作动态分析。同时记录外周血白细胞数的变化。
三、细胞遗传学检查
, 百拇医药
大部分患者复查了染色体检查。
四、PML-RAR α蛋白的免疫荧光染色
在每日持续静滴As2O3过程中定期抽取骨髓液，涂片作免疫荧光染色[3]。抗PML蛋白N端抗血清由日本Naoe教授提供。
结 果
一、骨髓象改变
在氧化砷治疗过程早幼粒细胞形态上出现两种改变。其一为治疗10～20天早幼粒细胞核浆比例减小，胞浆量较丰富，色蓝，嗜苯胺蓝颗粒显著减少、甚至消失，核染质增粗，核仁明显或隐匿；早幼粒细胞另一种形态改变为核膜向内凹陷，致使核形呈现各种不规则形。早幼粒细胞比例在氧化砷治疗的第10～20天左右明显减低。随着早幼粒细胞的减少，骨髓及外周血的中幼粒细胞比例显著增多，治疗后20～25天达高峰。中幼粒细胞胞体小，胞浆色略红，可见中性颗粒，核染质致密，固缩成块，偶见核碎裂。与此同时骨髓有核细胞增生也显著活跃，一般持续10天左右。涂片中易见比例分布不均匀的“退化细胞”，这种表现可持续至CR。氧化砷治疗20天左右，晚幼粒细胞比例仅轻度增高，约占6%～12%。
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二、外周血白细胞计数改变
氧化砷治疗后多数病例外周血白细胞数逐渐上升，通常10～22天达高峰。本组有21例白细胞计数上升至10×109/L，最高达167×109/L。除白细胞数>20×109/L用小剂量化疗外，一般病例白细胞数持续5～21天降至正常范围。
三、36例APL在初诊时均证实t(15;17)染色体易位及PML-RAR α3融合基因转录本存在。复发后有3例复查时消失了此种APL特异性核型及融合基因，而其中1例出现染色体t(8;21)易位及AML1-ETO融合基因，细胞形态上亦发现20%的异常中幼粒细胞。另1例转变为急性髓细胞白血病(AML)的M5a型。第3例白血病细胞浆中颗粒明显减少。这3例患者均属用As2O3治疗无效的病例。
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四、骨髓细胞PML-RAR α/PML蛋白的免疫荧光染色
在治疗前，骨髓细胞内由于PML-RAR α融合蛋白的存在，抗PML染色(POD结构)解体，出现数百个微小颗粒弥漫分布，经AS2O3治疗1～2周后，核内抗PML染色显著减少，直至完全消失。
讨 论
随着细胞分子生物学的迅猛发展，细胞凋亡在正常生命活动和某些疾病，尤其是恶性肿瘤发病学上的重要性越来越为人们所重视。诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的又一途径。哈尔滨医科大学附属第一医院首先报道应用砷剂治疗APL获得显效。我们曾以存在染色体t(15;17)易位和表达PML-RAR α蛋白的APL细胞株NB4细胞和新鲜APL细胞为模型进行研究，发现氧化砷对APL细胞具有剂量依赖性诱导细胞凋亡和部分分化双重效应[4，5]，表现为相对高浓度(1～2μmol/L)的氧化砷快速诱导细胞凋亡，相对低浓度(0.1～0.25μmol/L)的氧化砷体外作用10天后在一定程度上诱导细胞部分分化，0.05μmol/L的氧化砷兼有这两种效应。本文发现在持续每日静脉滴注氧化砷的过程中，治疗10天后异常早幼粒细胞逐渐减少。与此同时，伴随另外两种骨髓象的明显改变：其一，中幼粒样细胞明显增加。在形态学上表现为胞体小，染色质固缩、胞浆嗜天青颗粒消失等，然而，晚幼粒和杆状、分叶核细胞并无明显增加。其二，“退化”细胞明显增加，这些细胞明显失去胞浆成分，而胞核呈现染色质致密和疏松两种变化。这些结果支持我们的体外研究，即氧化砷可能通过诱导凋亡伴细胞部分分化而达到治疗APL的效果。此外，部分病人在用药过程中出现高白细胞血症，也可能支持氧化砷在某种程度上具有部分诱导分化效应。
, 百拇医药
已知APL存在的特异染色体t(15;17)易位产物——PML-RAR α蛋白是APL发生的重要分子基础。体外研究发现，该蛋白既能阻止某些造血细胞分化，也能阻止细胞的凋亡。我们已经发现氧化砷(0.1～2μmol/L)能快速有效调节和降解PML-RAR α/PML蛋白。本文结果也发现在治疗过程中，骨髓白血病细胞核内PML-RAR α/PML蛋白明显减少甚至消失。这些结果提示PML-RAR α蛋白也可能作为一个“靶子”参与氧化砷对APL的效应。在本组治疗无效的4例中，有3例复发时染色体及RT-PCR检查已无APL特异的t(15;17)易位及PML-RAR α融合基因，而转变为AML的其他类型，这也可解释这些患者为什么用氧化砷治疗无效的原因。AML治疗后细胞类型的转化进一步提示其克隆性起源具有异质性。推测这类病例在发病时存在二种异常克隆，初发时APL克隆占优势，经全反式维甲酸和化疗达CR后但未能根除；另一种处于白血病前期克隆，因此，该类型白血病细胞增殖后发病，表现出细胞类型的转化，化疗后骨髓中另一种造血干细胞重建也是原因之一。
, http://www.100md.com 参考文献
[1] 王振义.开展砷剂治疗白血病的临床和机制研究.中华血液学杂志，1996，17：57.
[2] 张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.
[3] Zhu J, Shi XG, Chu HY, et al. Effect of retinoic acid isomers on proliferation, differentiation and PML relocalization in the APL cell line NB4. Leukemia, 1995,9:302-309.
[4] Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARα/PML proteins. Blood,1996,88:1052-1061.
[5] Chen GQ, Shi XG, Tang W, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL):I As2O3 exerts dose-dependent dual effects on APL cells. Blood,1997,89:3345-3353.
(收稿：1998-11-08), 百拇医药