白血病患者治前骨髓塑料包埋切片c-myc原癌基因表达的初步研究
作者：浦权 杨梅如 刘薏芝 陶英 石军 蒋秦燕 常春康
单位：200233 上海市第六人民医院
关键词：白血病；塑料包埋；c-myc原癌基因表达
上海医学990211 【摘要】 目的 探讨急、慢性白血病治疗前骨髓塑料包埋切片内c-myc原癌基因表达的变化。 方法 使用冷丙酮固定结合简易三步塑包体系，观察了22例急、慢性白血病患者骨髓活检GMA包埋切片内白血病细胞c-myc表达的检测结果。 结果 急性髓系白血病(AML)时，19%～69%白血病细胞内含有c-myc蛋白，其含量在每例患者中多变。比较之下，治前的急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性髓系白血病(CML)慢性期中就罕有检出c-myc阳性细胞者。但2例CML加速期患者标本白血病细胞内c-myc蛋白表达增高。 结论 本研究建立的一种骨髓活检标本的简易塑包操作技术， 既可获卓越的抗原性保留，也能高质量地对白血病细胞内c-myc蛋白表达的形态学细节进行观察。
, http://www.100md.com
The preliminary study on the proto-oncogene c-myc expression in bone marrow biopsy sections with plastic embedded before treatment for leukemic patients.
PU Quan, YAN Meiru, LIU Yizhi, et al.
Department of Hematology, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai, 200233
【Abstract】 Objective The primary purpuse of this study was to explore the expression of the proto-oncogene c-myc in bone marrow sections with plastic embedded before treatment from leukevaic patients with acute and chronic. Methods Using cold acetone-fixation with a simplified three-step plastic embedding system were observated in 22 patients with acute and chronic lenkemia by glycol-methacrylate (GMA) embedding sections for bone marrow biopsies which results of assessment of c-myc expression in the leukemic cells. Results The percentage of leukemic cells with AML containing detectable c-myc protein ranges from 19% to 69% with a median value of 36%. C-myc protein levels amongst the leukemie cells of individual patients can vary. In contrast, before treatment in ALL and during the ehronic phase of CML cells Containing c-myc are rare. Further, specimens were obtained from two other CML patients at the time of accelerate phase contain high c-myc expression in the leukemic cells. Conclusion This study describe here a simplified plastic embedding technique for bone marrow biopsies which allows achieve excellent antigenic preservation. The data suggest that high quality observation of morphological details in the expression of c-myc protein with the leakemic cells.
, 百拇医药
【Key words】 Leukemia Plastic embedding Proto-oncogene c-myc expression
原癌基因c-myc与细胞增殖和分化的调节密切相关，白血病时此种细胞功能常表现明显的紊乱[1，2]。化疗过程中要想用外周血或骨髓涂片进行c-myc表达的检测常较困难，因为化疗不仅能诱使外周白细胞计数的减少，也能导致严重的骨髓增生减退，如能以骨髓切片去判定c-myc表达的动态变化，就能避免以上弊端[3]。
本文作者采用冷丙酮固定的塑包切片，以抗-c-myc多抗经APAAP免疫标记染色，检测了22例不同类型白血病患者骨髓切片白血性原细胞内c-myc表达的动态变化，现将初步结果报告如下。
对象与方法
一、对象
, 百拇医药
1997年1月～1998年10月共收集按国内惯用标准诊断的各型白血病22例，男13例，女9例；年龄36～78岁。包括：急性髓系白血病(AML)11例(M1 2例、M2 5例、M3 2例，M4和M6各1例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)3例，慢性髓系白血病(CML)6例(慢性期4例，加速期2例)，以及慢性淋巴细胞白血病(CLL)2例治疗前的骨髓活检标本。并以6例非恶性血液病患者的切片作对照，包括缺铁性贫血2例，溶血性贫血2例，感染性贫血和药源性粒细胞减少症各1例。各例均于治疗前以65-01型骨髓活检针于髂后上棘局麻后作一步法抽吸-活检双标本取材，活检块在2mm～3mm×10～15mm间。
二、改良GMA包埋剂配制
甲液：甲基丙烯酸二羟基乙基酯单体(HEMA)40ml，过氧化苯甲酰0.09g,N-N二甲基苯甲胺2.0ml，充分摇匀，全溶后置棕色玻瓶内4℃保存备用。乙液：聚乙二醇(PEG400)10ml,N-N二甲基苯甲胺1ml，混匀，4℃备用。全包埋液配制：甲液42份(本室特制模具84滴)，加乙液1份(8号针头3滴)。
, 百拇医药
三、包埋与切片操作步骤
骨髓块置于-20℃丙酮(100% ACS级)中，时时摇动固定1.5～2小时。之后活检块用针头挑入本室特制聚乙烯模具底部，用滴管吸取改良GMA单体甲液滴入模具底部，使满，置4℃冰箱中2小时。取出包埋模具用带8号针头之注射器吸取乙液约3滴加入模具中，用细竹签迅速将甲、乙两液搅匀后而成全包埋液，将活检块摆正于模具底部中央位置，静置于4℃冰箱内待其自聚过夜，包埋块修正后切割成3～4μm厚切片，移入事先滴加数滴浓氢氧化氨液之水浴上，使之平坦悬浮于水面，冷水浴中裱片，常规贴片。
四、切片免疫组化染色
用APAAP法。一抗为抗c-myc蛋白的兔多抗(Dako),经1∶50倍稀释，二抗为碱性磷酸酶结合的兔抗鼠IgG,三抗为APAAP酶标复合物。三者均于湿盒内室温下孵育30分钟，滴加碱性磷酸酶底物显色液20μl后于37℃下孵育显色20分钟，水洗后Mayer苏木素复染胞核4分钟，水洗，甘油明胶封片后镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。
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五、观察内容
为了便于对不同活检切片内的c-myc基因相对含量进行比较研究，必须确定含有c-myc蛋白的细胞分布模式，以及决定每个c-myc阳性细胞之染色强度。为此，应将骨髓切片分成小染旁区、间区和中央区等3个不同区域[4]；如果切片内含c-myc蛋白的阳性细胞大于或等于1%，则分区等分计数300个细胞；倘若小于1%时，就应分区计数1 000个细胞，判定c-myc阳性细胞所占比率(%)。并将c-myc阳性细胞之分布划分成单个细胞之“弥散”分布或大于或等于3个细胞之“簇状”分布两种模式。此外，每个细胞又按着色与否和着色强度的不同划分以下5级：
-：未着色之阴性细胞； ±：微量，隐约可见之粉红色或细粒状阳性物质； +：弱阳性，可见淡红色或粒状阳性物质； ++：阳性，红色； +++：强阳性，深红色。
进而对切片内c-myc蛋白之相对量经积分法计算出c-myc蛋白总量，也即c-myc蛋白指数，有助于各例间或某一病例治疗前、后进行比较研究。
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c-myc蛋白指数=(“±”阳性细胞%×0.5)+(“+”阳性细胞%×1)+(“++”阳性细胞%×2)+(“+++”阳性细胞%×3)
结果
表1内6例非恶性血液病患者骨髓塑包切片内各系血细胞之胞浆和胞核均呈c-myc阴性反应。
一、急性白血病时的c-myc表达
切片内白血病细胞之胞核均呈c-myc蛋白阴性。而胞浆内c-myc标记物表达结果见表1。11例AML患者治疗前切片白血病细胞内带c-myc蛋白的阳性细胞数在19%～69%间，中位值36%，c-myc蛋白指数介于30.45～121.50，中位值63.95。表1中例9(AML-M2)治疗前阳性细胞占27%，蛋白指数39.7，化疗诱导部份缓解(PR)后，阳性细胞和蛋白指数分别降至16%和18.85。本文AML患者阳性细胞分布模式呈单个弥散分布者6例，单个弥散结合簇状小灶分布者4例，以及呈簇状分布为主者1例。其中例5为MDS-RAEB转化为AML-M2的患者切片c-myc阳性细胞呈簇状分布为主。
, 百拇医药
在本组3例ALL患者中，2例之白血性原淋巴细胞呈c-myc阴性反应，另1例(ALL-L1)切片内可见5%单个分布的c-myc弱阳性细胞，蛋白指数为4.0。
表1 骨髓活检塑包切片c-myc标记物表达 例号
性别
年龄
诊断
病期
c-myc阳性细胞数(%)
c-myc蛋白指数
c-myc阳性细胞之分布
±
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+
++
+++
总计
1
女
43
AML-M3
治前
7.6
10.4
13.
4.0
, http://www.100md.com 35
52.20
单个弥散分布
2
男
59
AML-M4
治前
3.5
6.0
6.0
3.5
19
, 百拇医药 30.45
单个弥散分布、偶见“簇状”小灶
3
男
75
AML-M2
治前
2.5
8.5
14.0
7.0
33
58.75
, 百拇医药
单个弥散分布
4
男
60
AML-M2
治前
5.7
12.7
13.6
9.0
41
69.75
单个弥散分布，偶见小簇
, 百拇医药
5
男
70
AML-M2
治前
7.0
11.0
16.0
11.0
45
79.50
以簇状分布为主
6
, http://www.100md.com
男
65
AML-M6
治前
18.7
20.0
14.3
12.0
65
93.95
密集单个弥散分布，阳性强度高
7
男
, 百拇医药
50
AML-M1
治前
7.7
17.0
19.3
12.0
56
87.30
密集单个弥散分布，偶见小簇
8
男
57
, 百拇医药
AML-M2
治前
4.7
9.0
14.3
8.0
36
63.95
单个弥散分布
9
女
47
AML-M2
, 百拇医药
治前
5.3
11.0
6.0
4.7
27
39.70
单个弥散分布
PR
6.3
4.7
4.0
1.0
, 百拇医药
16
18.85
稀疏单个弥散分布
10
女
48
AML-M3
治前
11.0
19.0
20.0
19.0
69
, 百拇医药
121.50
密集单个弥散分布
11
女
59
AML-M1
治前
7.3
12.7
12.0
1.0
33
43.35
, 百拇医药
单个弥散分布，结合簇状小灶
12
男
50
ALL-L2
治前
-
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药 13
男
36
ALL-L2
治前
-
-
-
-
-
-
-
14
女
, http://www.100md.com
ALL-L1
治前
2.0
3.0
-
-
5
4.0
偶见单个弱阳性细胞
15
男
48
CML
, 百拇医药
慢性期
-
-
-
-
-
-
-
16
女
45
CML
慢性期
-
, 百拇医药
-
-
-
-
-
-
17
女
36
CML
慢性期
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
18
女
48
CML
慢性期
2.0
1.0
-
-
3
, 百拇医药
2.0
偶见单个弱阳性细胞
19
男
CML
加速期
2.7
9.3
8.7
2.0
23
34.0
单个弥散分布
, http://www.100md.com
20
女
51
CML
加速期
3.0
9.0
6.0
-
18
22.5
单个弥散分布
21
, 百拇医药 男
78
CLL
治前
-
-
-
-
-
-
-
22
男
42
, 百拇医药
CLL
治前
-
3.0
4.0
0.7
7.7
13.10
稀疏单个弥散分布
23
女
16
感染贫
, 百拇医药
治前
-
-
-
-
-
-
-
24
女
73
粒减
治前
-
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-
-
-
-
-
-
25
女
36
缺铁
治前
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
26
女
36
缺铁
治前
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
27
女
41
溶贫
治前
-
-
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
28
女
25
溶贫
治前
-
-
-
-
-
-
-
二、慢性白血病时的c-myc表达
, http://www.100md.com 在4例CML慢性期患者中，3例之切片内未查觉含c-myc蛋白之阳性细胞，另1例阳性细胞占3%，蛋白指数为2.0。CML加速期2例，切片内c-myc阳性细胞分别占23%和18%，而蛋白指数分别为34.0和22.5。本文检测CLL 2例，1例切片内白血性淋巴细胞呈c-myc阴性反应，另1例阳性细胞占7.7%，呈稀疏单个弥散分布，蛋白指数为13.10。讨论
为探讨AML及其它白血病患者白血病细胞的分化与增殖行为，本文作者设计了于骨髓塑料包埋切片内进行原癌基因表达的初步研究。已证明，c-myc不仅与诱致白血病的逆转录病毒密切相关，而且c-myc的表达也与调节细胞的增殖和分化密切相关[2，3，5]。因此，c-myc表达的异常，就能导致畸变细胞增殖和/或分化的高度障碍。此外，白血病细胞c-myc表达的消长，也是判断细胞毒化疗和生物活性制剂效果的一种有用指标[3]。
本文11例AML患者治疗前骨髓切片白血病细胞内c-myc水平明显增高，这与髓内存在高比率的白血性原始细胞有关，表明此类患者的白血病细胞伴有非常高的增殖潜力。已知，c-myc的高表达能阻抑髓内造血细胞的分化[2]，故而必然会导致白血病细胞的蓄积。AML患者切片内原癌基因c-myc的高表达，可能反映了c-myc基因本身结构的畸变，或者与基因表达调节机能的异常有关。
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本文例9(AML-M2)治疗前骨髓切片c-myc阳性细胞占27%，蛋白指数为39.7。化疗诱导PR后，阳性细胞和蛋白指数分别降至16%和18.85，较之治疗前明显为低，与文献报道类似[2]。Preisler等的研究证明，在蛋白水平上c-myc表达的判断可为AML患者提供预后信息。倘若化疗过程中白血病细胞c-myc高表达的持续存在，常是出现耐药细胞群的预兆，患者难以进入完全缓解。而有效的联合化疗常能伴随以c-myc表达的降低甚或转阴。
在本文观察的4例慢性期CML患者中，3例骨髓切片内未查出c-myc阳性细胞，另1例阳性细胞占3%。2例加速期CML切片内c-myc阳性细胞分别为23%和18%，相应蛋白指数为34.0和22.5。本组1例CLL切片c-myc呈阴性反应，另1例阳性细胞占7.7%。以上结果提示，多数慢性期CML切片内白血病细胞不表达c-myc，一旦慢性期病例检出含c-myc蛋白的阳性细胞时，常预示该例已处于向加速期甚或原始细胞转形之早期。随着疾病进入加速期，切片内即可检出含c-myc表达之阳性细胞，并随疾病的进展阳性细胞数和蛋白指数均将逐步上升。可见，CML患者病程中定期检测骨髓切片内c-myc原癌基因表达的动态变化，将有助于病程进展阶段的判定。
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目前，国内、外广为应用的乙二醇-甲基丙烯酸酯(GMA)类包埋剂均于室温下聚合，反应期间强烈放热，不仅损伤了骨髓组织构形，也使髓内细胞中的各种酶活性及众多已分化的髓性和淋巴性抗原遭至破坏。其次，水溶性GMA于聚合过程中可明显地与蛋白质氨基终端位结合，由此而遮蔽了细胞表面的抗原决定簇，使得免疫组化染色出现假阴性反应。本文作者以5%甲基苯甲酸盐加入GMA单体浸渍液中，此物可保护GMA聚合过程中细胞抗原不被遮蔽[6]，加之以冷丙酮固定的骨髓活检块中血细胞的抗原性保留优良，如果改用其它固定剂或在丙酮中加入甲醇等其它固定剂，反应就会转阴。本文结果进一步证明，经特殊处理的塑包切片亦可同时进行常染色和c-myc标记物表达等酶标显示的同步联检与研究，从而大大提高了骨髓活检塑料包埋新技术在恶性血液病临床诊断中的应用价值。
参考文献
[1] Preisler HD,Kinniburgh AJ,Wei-Durg G,et al.Expression of the proto-oncogenes c-mye,c-fos and c-fms in acute myelocytic leukemia at diagnosis and in remission.Cancer Res,1987,47:784-880.
, 百拇医药
[2] Preisler HD,Sato H,Yang P,et al.Assessment of c-myc expression in individual leukenic cells.Leuk Res,1988,12:507-516
[3] Banavali SD,Pancoast JR,Tricot G,et al.The serial study of c-myc expression in bone marrow biopsy specimens during treatment for acute myelogenous leukaemia.Eur J Cancer,1993,29:1162-1167.
[4] 浦权编著.血液病骨髓组织病理学彩色图谱.天津：天津科学技术出版社，1990.5-8.
[5] Jones DJ,Gosh AK,Moore M,et al.A critical appraisal of the immunohistochemical detection of the c-myc oncogene product in co-lorectal cancer.Br J cancer,1987,56:779-783.
[6] Casey TT,Cousar J,Collins R.A simplified plastic embedding and immunohistologic technizue for immunophenotypic analysis of human hematopoietic and lymphoid tissues.Am J Pathol,1988,13:183-189.
(收稿：1998-12-10), http://www.100md.com
单位：200233 上海市第六人民医院
关键词：白血病；塑料包埋；c-myc原癌基因表达
上海医学990211 【摘要】 目的 探讨急、慢性白血病治疗前骨髓塑料包埋切片内c-myc原癌基因表达的变化。 方法 使用冷丙酮固定结合简易三步塑包体系，观察了22例急、慢性白血病患者骨髓活检GMA包埋切片内白血病细胞c-myc表达的检测结果。 结果 急性髓系白血病(AML)时，19%～69%白血病细胞内含有c-myc蛋白，其含量在每例患者中多变。比较之下，治前的急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性髓系白血病(CML)慢性期中就罕有检出c-myc阳性细胞者。但2例CML加速期患者标本白血病细胞内c-myc蛋白表达增高。 结论 本研究建立的一种骨髓活检标本的简易塑包操作技术， 既可获卓越的抗原性保留，也能高质量地对白血病细胞内c-myc蛋白表达的形态学细节进行观察。
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The preliminary study on the proto-oncogene c-myc expression in bone marrow biopsy sections with plastic embedded before treatment for leukemic patients.
PU Quan, YAN Meiru, LIU Yizhi, et al.
Department of Hematology, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai, 200233
【Abstract】 Objective The primary purpuse of this study was to explore the expression of the proto-oncogene c-myc in bone marrow sections with plastic embedded before treatment from leukevaic patients with acute and chronic. Methods Using cold acetone-fixation with a simplified three-step plastic embedding system were observated in 22 patients with acute and chronic lenkemia by glycol-methacrylate (GMA) embedding sections for bone marrow biopsies which results of assessment of c-myc expression in the leukemic cells. Results The percentage of leukemic cells with AML containing detectable c-myc protein ranges from 19% to 69% with a median value of 36%. C-myc protein levels amongst the leukemie cells of individual patients can vary. In contrast, before treatment in ALL and during the ehronic phase of CML cells Containing c-myc are rare. Further, specimens were obtained from two other CML patients at the time of accelerate phase contain high c-myc expression in the leukemic cells. Conclusion This study describe here a simplified plastic embedding technique for bone marrow biopsies which allows achieve excellent antigenic preservation. The data suggest that high quality observation of morphological details in the expression of c-myc protein with the leakemic cells.
, 百拇医药
【Key words】 Leukemia Plastic embedding Proto-oncogene c-myc expression
原癌基因c-myc与细胞增殖和分化的调节密切相关，白血病时此种细胞功能常表现明显的紊乱[1，2]。化疗过程中要想用外周血或骨髓涂片进行c-myc表达的检测常较困难，因为化疗不仅能诱使外周白细胞计数的减少，也能导致严重的骨髓增生减退，如能以骨髓切片去判定c-myc表达的动态变化，就能避免以上弊端[3]。
本文作者采用冷丙酮固定的塑包切片，以抗-c-myc多抗经APAAP免疫标记染色，检测了22例不同类型白血病患者骨髓切片白血性原细胞内c-myc表达的动态变化，现将初步结果报告如下。
对象与方法
一、对象
, 百拇医药
1997年1月～1998年10月共收集按国内惯用标准诊断的各型白血病22例，男13例，女9例；年龄36～78岁。包括：急性髓系白血病(AML)11例(M1 2例、M2 5例、M3 2例，M4和M6各1例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)3例，慢性髓系白血病(CML)6例(慢性期4例，加速期2例)，以及慢性淋巴细胞白血病(CLL)2例治疗前的骨髓活检标本。并以6例非恶性血液病患者的切片作对照，包括缺铁性贫血2例，溶血性贫血2例，感染性贫血和药源性粒细胞减少症各1例。各例均于治疗前以65-01型骨髓活检针于髂后上棘局麻后作一步法抽吸-活检双标本取材，活检块在2mm～3mm×10～15mm间。
二、改良GMA包埋剂配制
甲液：甲基丙烯酸二羟基乙基酯单体(HEMA)40ml，过氧化苯甲酰0.09g,N-N二甲基苯甲胺2.0ml，充分摇匀，全溶后置棕色玻瓶内4℃保存备用。乙液：聚乙二醇(PEG400)10ml,N-N二甲基苯甲胺1ml，混匀，4℃备用。全包埋液配制：甲液42份(本室特制模具84滴)，加乙液1份(8号针头3滴)。
, 百拇医药
三、包埋与切片操作步骤
骨髓块置于-20℃丙酮(100% ACS级)中，时时摇动固定1.5～2小时。之后活检块用针头挑入本室特制聚乙烯模具底部，用滴管吸取改良GMA单体甲液滴入模具底部，使满，置4℃冰箱中2小时。取出包埋模具用带8号针头之注射器吸取乙液约3滴加入模具中，用细竹签迅速将甲、乙两液搅匀后而成全包埋液，将活检块摆正于模具底部中央位置，静置于4℃冰箱内待其自聚过夜，包埋块修正后切割成3～4μm厚切片，移入事先滴加数滴浓氢氧化氨液之水浴上，使之平坦悬浮于水面，冷水浴中裱片，常规贴片。
四、切片免疫组化染色
用APAAP法。一抗为抗c-myc蛋白的兔多抗(Dako),经1∶50倍稀释，二抗为碱性磷酸酶结合的兔抗鼠IgG,三抗为APAAP酶标复合物。三者均于湿盒内室温下孵育30分钟，滴加碱性磷酸酶底物显色液20μl后于37℃下孵育显色20分钟，水洗后Mayer苏木素复染胞核4分钟，水洗，甘油明胶封片后镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。
, http://www.100md.com
五、观察内容
为了便于对不同活检切片内的c-myc基因相对含量进行比较研究，必须确定含有c-myc蛋白的细胞分布模式，以及决定每个c-myc阳性细胞之染色强度。为此，应将骨髓切片分成小染旁区、间区和中央区等3个不同区域[4]；如果切片内含c-myc蛋白的阳性细胞大于或等于1%，则分区等分计数300个细胞；倘若小于1%时，就应分区计数1 000个细胞，判定c-myc阳性细胞所占比率(%)。并将c-myc阳性细胞之分布划分成单个细胞之“弥散”分布或大于或等于3个细胞之“簇状”分布两种模式。此外，每个细胞又按着色与否和着色强度的不同划分以下5级：
-：未着色之阴性细胞； ±：微量，隐约可见之粉红色或细粒状阳性物质； +：弱阳性，可见淡红色或粒状阳性物质； ++：阳性，红色； +++：强阳性，深红色。
进而对切片内c-myc蛋白之相对量经积分法计算出c-myc蛋白总量，也即c-myc蛋白指数，有助于各例间或某一病例治疗前、后进行比较研究。
, http://www.100md.com
c-myc蛋白指数=(“±”阳性细胞%×0.5)+(“+”阳性细胞%×1)+(“++”阳性细胞%×2)+(“+++”阳性细胞%×3)
结果
表1内6例非恶性血液病患者骨髓塑包切片内各系血细胞之胞浆和胞核均呈c-myc阴性反应。
一、急性白血病时的c-myc表达
切片内白血病细胞之胞核均呈c-myc蛋白阴性。而胞浆内c-myc标记物表达结果见表1。11例AML患者治疗前切片白血病细胞内带c-myc蛋白的阳性细胞数在19%～69%间，中位值36%，c-myc蛋白指数介于30.45～121.50，中位值63.95。表1中例9(AML-M2)治疗前阳性细胞占27%，蛋白指数39.7，化疗诱导部份缓解(PR)后，阳性细胞和蛋白指数分别降至16%和18.85。本文AML患者阳性细胞分布模式呈单个弥散分布者6例，单个弥散结合簇状小灶分布者4例，以及呈簇状分布为主者1例。其中例5为MDS-RAEB转化为AML-M2的患者切片c-myc阳性细胞呈簇状分布为主。
, 百拇医药
在本组3例ALL患者中，2例之白血性原淋巴细胞呈c-myc阴性反应，另1例(ALL-L1)切片内可见5%单个分布的c-myc弱阳性细胞，蛋白指数为4.0。
表1 骨髓活检塑包切片c-myc标记物表达 例号
性别
年龄
诊断
病期
c-myc阳性细胞数(%)
c-myc蛋白指数
c-myc阳性细胞之分布
±
, http://www.100md.com
+
++
+++
总计
1
女
43
AML-M3
治前
7.6
10.4
13.
4.0
, http://www.100md.com 35
52.20
单个弥散分布
2
男
59
AML-M4
治前
3.5
6.0
6.0
3.5
19
, 百拇医药 30.45
单个弥散分布、偶见“簇状”小灶
3
男
75
AML-M2
治前
2.5
8.5
14.0
7.0
33
58.75
, 百拇医药
单个弥散分布
4
男
60
AML-M2
治前
5.7
12.7
13.6
9.0
41
69.75
单个弥散分布，偶见小簇
, 百拇医药
5
男
70
AML-M2
治前
7.0
11.0
16.0
11.0
45
79.50
以簇状分布为主
6
, http://www.100md.com
男
65
AML-M6
治前
18.7
20.0
14.3
12.0
65
93.95
密集单个弥散分布，阳性强度高
7
男
, 百拇医药
50
AML-M1
治前
7.7
17.0
19.3
12.0
56
87.30
密集单个弥散分布，偶见小簇
8
男
57
, 百拇医药
AML-M2
治前
4.7
9.0
14.3
8.0
36
63.95
单个弥散分布
9
女
47
AML-M2
, 百拇医药
治前
5.3
11.0
6.0
4.7
27
39.70
单个弥散分布
PR
6.3
4.7
4.0
1.0
, 百拇医药
16
18.85
稀疏单个弥散分布
10
女
48
AML-M3
治前
11.0
19.0
20.0
19.0
69
, 百拇医药
121.50
密集单个弥散分布
11
女
59
AML-M1
治前
7.3
12.7
12.0
1.0
33
43.35
, 百拇医药
单个弥散分布，结合簇状小灶
12
男
50
ALL-L2
治前
-
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药 13
男
36
ALL-L2
治前
-
-
-
-
-
-
-
14
女
, http://www.100md.com
ALL-L1
治前
2.0
3.0
-
-
5
4.0
偶见单个弱阳性细胞
15
男
48
CML
, 百拇医药
慢性期
-
-
-
-
-
-
-
16
女
45
CML
慢性期
-
, 百拇医药
-
-
-
-
-
-
17
女
36
CML
慢性期
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
18
女
48
CML
慢性期
2.0
1.0
-
-
3
, 百拇医药
2.0
偶见单个弱阳性细胞
19
男
CML
加速期
2.7
9.3
8.7
2.0
23
34.0
单个弥散分布
, http://www.100md.com
20
女
51
CML
加速期
3.0
9.0
6.0
-
18
22.5
单个弥散分布
21
, 百拇医药 男
78
CLL
治前
-
-
-
-
-
-
-
22
男
42
, 百拇医药
CLL
治前
-
3.0
4.0
0.7
7.7
13.10
稀疏单个弥散分布
23
女
16
感染贫
, 百拇医药
治前
-
-
-
-
-
-
-
24
女
73
粒减
治前
-
, http://www.100md.com
-
-
-
-
-
-
25
女
36
缺铁
治前
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
26
女
36
缺铁
治前
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
27
女
41
溶贫
治前
-
-
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
28
女
25
溶贫
治前
-
-
-
-
-
-
-
二、慢性白血病时的c-myc表达
, http://www.100md.com 在4例CML慢性期患者中，3例之切片内未查觉含c-myc蛋白之阳性细胞，另1例阳性细胞占3%，蛋白指数为2.0。CML加速期2例，切片内c-myc阳性细胞分别占23%和18%，而蛋白指数分别为34.0和22.5。本文检测CLL 2例，1例切片内白血性淋巴细胞呈c-myc阴性反应，另1例阳性细胞占7.7%，呈稀疏单个弥散分布，蛋白指数为13.10。讨论
为探讨AML及其它白血病患者白血病细胞的分化与增殖行为，本文作者设计了于骨髓塑料包埋切片内进行原癌基因表达的初步研究。已证明，c-myc不仅与诱致白血病的逆转录病毒密切相关，而且c-myc的表达也与调节细胞的增殖和分化密切相关[2，3，5]。因此，c-myc表达的异常，就能导致畸变细胞增殖和/或分化的高度障碍。此外，白血病细胞c-myc表达的消长，也是判断细胞毒化疗和生物活性制剂效果的一种有用指标[3]。
本文11例AML患者治疗前骨髓切片白血病细胞内c-myc水平明显增高，这与髓内存在高比率的白血性原始细胞有关，表明此类患者的白血病细胞伴有非常高的增殖潜力。已知，c-myc的高表达能阻抑髓内造血细胞的分化[2]，故而必然会导致白血病细胞的蓄积。AML患者切片内原癌基因c-myc的高表达，可能反映了c-myc基因本身结构的畸变，或者与基因表达调节机能的异常有关。
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本文例9(AML-M2)治疗前骨髓切片c-myc阳性细胞占27%，蛋白指数为39.7。化疗诱导PR后，阳性细胞和蛋白指数分别降至16%和18.85，较之治疗前明显为低，与文献报道类似[2]。Preisler等的研究证明，在蛋白水平上c-myc表达的判断可为AML患者提供预后信息。倘若化疗过程中白血病细胞c-myc高表达的持续存在，常是出现耐药细胞群的预兆，患者难以进入完全缓解。而有效的联合化疗常能伴随以c-myc表达的降低甚或转阴。
在本文观察的4例慢性期CML患者中，3例骨髓切片内未查出c-myc阳性细胞，另1例阳性细胞占3%。2例加速期CML切片内c-myc阳性细胞分别为23%和18%，相应蛋白指数为34.0和22.5。本组1例CLL切片c-myc呈阴性反应，另1例阳性细胞占7.7%。以上结果提示，多数慢性期CML切片内白血病细胞不表达c-myc，一旦慢性期病例检出含c-myc蛋白的阳性细胞时，常预示该例已处于向加速期甚或原始细胞转形之早期。随着疾病进入加速期，切片内即可检出含c-myc表达之阳性细胞，并随疾病的进展阳性细胞数和蛋白指数均将逐步上升。可见，CML患者病程中定期检测骨髓切片内c-myc原癌基因表达的动态变化，将有助于病程进展阶段的判定。
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目前，国内、外广为应用的乙二醇-甲基丙烯酸酯(GMA)类包埋剂均于室温下聚合，反应期间强烈放热，不仅损伤了骨髓组织构形，也使髓内细胞中的各种酶活性及众多已分化的髓性和淋巴性抗原遭至破坏。其次，水溶性GMA于聚合过程中可明显地与蛋白质氨基终端位结合，由此而遮蔽了细胞表面的抗原决定簇，使得免疫组化染色出现假阴性反应。本文作者以5%甲基苯甲酸盐加入GMA单体浸渍液中，此物可保护GMA聚合过程中细胞抗原不被遮蔽[6]，加之以冷丙酮固定的骨髓活检块中血细胞的抗原性保留优良，如果改用其它固定剂或在丙酮中加入甲醇等其它固定剂，反应就会转阴。本文结果进一步证明，经特殊处理的塑包切片亦可同时进行常染色和c-myc标记物表达等酶标显示的同步联检与研究，从而大大提高了骨髓活检塑料包埋新技术在恶性血液病临床诊断中的应用价值。
参考文献
[1] Preisler HD,Kinniburgh AJ,Wei-Durg G,et al.Expression of the proto-oncogenes c-mye,c-fos and c-fms in acute myelocytic leukemia at diagnosis and in remission.Cancer Res,1987,47:784-880.
, 百拇医药
[2] Preisler HD,Sato H,Yang P,et al.Assessment of c-myc expression in individual leukenic cells.Leuk Res,1988,12:507-516
[3] Banavali SD,Pancoast JR,Tricot G,et al.The serial study of c-myc expression in bone marrow biopsy specimens during treatment for acute myelogenous leukaemia.Eur J Cancer,1993,29:1162-1167.
[4] 浦权编著.血液病骨髓组织病理学彩色图谱.天津：天津科学技术出版社，1990.5-8.
[5] Jones DJ,Gosh AK,Moore M,et al.A critical appraisal of the immunohistochemical detection of the c-myc oncogene product in co-lorectal cancer.Br J cancer,1987,56:779-783.
[6] Casey TT,Cousar J,Collins R.A simplified plastic embedding and immunohistologic technizue for immunophenotypic analysis of human hematopoietic and lymphoid tissues.Am J Pathol,1988,13:183-189.
(收稿：1998-12-10), http://www.100md.com