骨肉瘤微血管密度及其临床意义
作者：蔡宣松 梅炯 李日乐 郭荻萍
单位：上海铁道大学医学院附属甘泉医院骨科，上海 200065
关键词：骨肉瘤； 免疫组织化学； 微血管密度； 预后
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【摘要】 目的 探讨骨肉瘤组织中微血管密度(MVD)与骨肉瘤患者预后的关系。方法 应用免疫组化技术检测48例骨肉瘤组织标本中的MVD计数，并结合临床及随访资料综合分析患者年龄、发病时间、肿瘤大小、组织亚型、HDMTX化疗以及肿瘤转移与骨肉瘤MVD之间的关系。结果 MVD与患者年龄、发病时间、组织亚型及是否化疗无关，但HDMTX明显影响肿瘤微血管的发育成熟，且肿瘤发生转移者的MVD显著高于未发生转移者。结论 骨肉瘤组织中的MVD可能影响骨肉瘤患者的预后，HDMTX抑制肿瘤血管发育可能是其能控制肿瘤生长和转移的原因之一。
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【中图分类号】 R738.1
Clinical significance of microvessel density in osteosarcoma
Cai Xuansong，Mei Jiong，Li Rile，Guo Diping
(Department of Orthopaedics,Ganquan Hospital,Medical College of Shanghai Tiedao University，Shanghai 200065)
【Abstract】 Objective To investigate the prognostic value of microvessel density(MVD) in osteosarcoma. Methods Microvessel quantitation was detected by immunohistochemistry in histological sections from 48 patients with osteosarcoma,and the statistical significance was analysed between MVD and patients age,duration of symptoms,tumor size,pathologic subtype or chemotherapy. Results MVD was significantly higher in the metastatic group than that in non-metastatic group,and no association was observed between MVD and patients age,duration of symptoms,pathologic subtype or chemotherapy. Although the microvessel quantitation showed no significant difference between the patients with chemotherapy and those without, chemotherapy restrained microvessel from maturity. Conclusion High MVD in osteosarcoma was correlated with poor prognosis， and the microvessel maturity restrained by chemotherapy would be one reason of tumor metastasis.
, 百拇医药
【Key words】 osteosarcoma;immunohistochemistry;microvessel density; prognosis
实体肿瘤的生长要依靠肿瘤血管生成以形成自身的血管系统，肿瘤组织因此能得到充足的营养供给而迅速生长。同时，肿瘤细胞也凭借新生血管在结构上的缺陷，进入微循环而向远方转移〔1，2〕。目前有关肿瘤血管生成与肿瘤转移的关系以及抗血管生成在肿瘤治疗上的运用，为国内外较多学者所注目。本研究应用第Ⅷ因子(FⅧ)相关抗原多克隆抗体对48例骨肉瘤的微血管密度(MVD)进行免疫组化研究，以探讨骨肉瘤微血管密度的临床意义。
1 材料与方法
1.1 病例来源 按以下条件选择病例：(1) 我院1991～1995年间因骨肉瘤行保肢手术或截肢术的所有患者。(2)来我院前未经手术治疗或活检手术的时间不超过2周者。(3)病损部位在四肢，就诊时无转移并可根治切除。(4)手术由同一外科小组施行。(5)病理诊断由两位有经验的病理医师分别阅片后得出并作出组织亚型分类。(6)手术前后有完整的病案资料；随访时间：从术后到发现转移，无转移者随访36个月以上。(7)有肿瘤原发灶组织的蜡块保存。
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1.2 临床资料 符合以上条件者48例，其中男22例，女26例。年龄9～49岁。首诊到手术日病程1～11月，平均4.1个月。所有肿瘤均穿破骨皮质侵犯软组织，肿瘤最大径3～25 cm，平均9.89 cm。治疗方法：化疗采用MTX-VCR方案(剂量MTX 200 mg.kg-1，VCR 2 mg)，术前化疗1次后施行手术，术后化疗于术后2周开始，第1年每3～4周重复1次，剂量同前，每3个月间以ADM 30 mg.m-2。第2年每3个月进行1次，到术后2年化疗结束。48例患者中34例术前术后接受了完整的化疗，14例因经济困难或化疗反应未能坚持全程化疗，其中6例未行术前化疗。手术分截肢和保肢两类，一般尽可能采用保肢手术。截肢指征：(1)主要血管神经受侵；(2)肿瘤切除后骨缺损重建困难而又无经济能力支付假体费用。本组中截肢17例，肢体挽救31例。
本组中骨肉瘤的组织亚型包括骨母细胞型28例，软骨母细胞型10例，纤维母细胞型6例，毛细血管扩张型3例，小细胞型1例。
, 百拇医药
1.3 免疫组化技术(ABC法) 切片常规脱蜡，水化。用0.05%(体积分数，下同)胰蛋白酶消化约15 min，TBS洗涤，滴加1∶100的抗FⅧ相关抗原多克隆抗体(DAKO，兔抗)，4℃过夜。次日用TBS洗涤3次，再以3% H2O2阻断5 min，TBS洗涤后滴加1∶200的生物素化兔二抗(DAKO)，30 min后TBS洗涤3次滴加1∶100的ABC试剂(DAKO)，1 h后TBS洗涤3次，在0.03% H2O2-DAB中染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，风干，树胶封固。以上步骤均在室温下进行。
1.4 结果判断及微血管计数方法 微血管染色呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无血管腔(图1)。但如果血管腔直径大于8个红细胞或血管壁带有明显的肌层或纤维化以及炎症和坏死区的微血管则不计入总数〔3〕。计数时先用40倍镜寻找微血管最多的区域，然后用200倍镜(视野的面积为0.74 mm2)分别对3个视野进行计数，其平均值即为该肿瘤的微血管密度值。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用t检验。
图1 微血管染色呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无血管腔(免疫组化，ABC×200)
2 结果
2.1 微血管分布情况 微血管大多集中在肿瘤边缘，肿瘤之间的微血管数量差异较大。微血管在各肿瘤中分布的规则状况差异也较大，一些肿瘤的微血管分布比较规则，而另一些肿瘤的微血管分布则较为凌乱。
2.2 MVD与临床各指标间关系 MVD与患者年龄、发病时间、肿瘤大小、组织亚型(毛细血管型和小细胞型因例数较少未纳入统计)、化疗与否以及肿瘤转移之间的关系见表1。
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表1 MVD与临床各指标间的关系
指 标
n
±s
范围
年龄
>16岁
23
36.8±13.1
33～78
<16岁
, http://www.100md.com
25
39.7±14.7
11～106
发病时间
>4个月
20
38.1±14.2
11～72
<4个月
28
41.3±12.8
34～106
肿瘤大小
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>10 cm
23
37.2±15.0
11～106
<10 cm
25
37.7±14.7
21～98
组织亚型
骨母细胞型
28
42.1±14.5
11～96
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软骨母细胞型
10
36.8±13.8
26～106
纤维母细胞型
6
39.1±14.4
32～86
术前化疗
化疗
42
37.4±14.1
11～106
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无化疗
6
39.5±13.4
22～82
肿瘤转移
转移
29
44.8±13.2
36～106
无转移
19
36.6±13.1
11～82
, 百拇医药
与无转移比较：*P<0.05
2.3 MVD与化疗的关系 本组资料中，6例患者未行术前化疗，为探讨化疗对MVD的影响，我们将这6例骨肉瘤组织与42例行术前化疗者的MVD作了比较，两组间MVD经t检验差异无显著性。但未行化疗者的微血管发育明显较已行化疗者为好，前者微血管管腔丰富并密集成网络状(图2)，而后者则多为单个或成簇细胞，形成管腔者明显为少(图3)。
图2 未行化疗者微血管管腔丰富并密集成网络状
(免疫组化，ABC×200)
, 百拇医药
图3 化疗者见单个或成簇染色细胞，形成管腔者明显为少
(免疫组化，ABC×200)
3 讨论
肿瘤血管系统的生成虽然是一个连续的过程，但仍可分为6个相对独立的步骤〔4〕：(1)肿瘤的各种成分释放多种血管生成因子；(2)血管内皮细胞因血管生成因子的作用而出现形态改变(如各种细胞器数目和大小的增加以及伪足的出现)；(3)血管内皮细胞和肿瘤细胞释放蛋白溶酶以降解毛细血管基底膜和周围的细胞外基质；(4)血管内皮细胞从毛细血管后微静脉迁出形成血管新芽；(5)血管内皮细胞增殖(也有人认为可不出现〔1〕)；(6)肿瘤微血管分化和成型。因此，测定肿瘤MVD是研究肿瘤血管生成的主要方法之一〔5〕。肿瘤血管生成之所以为当今学者所注目，除了其与患者预后密切相关外，抗肿瘤血管生成有可能成为治疗肿瘤的重要方法〔6〕。
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和其它研究结果相似，我们的结果显示骨肉瘤的微血管多分布在肿瘤边缘且不规则，数量悬殊也较大，这可能是肿瘤血管生成的一般规律。虽然有文献报道MVD随患者年龄升高而下降，但在我们的结果中，MVD则与年龄无关，这可能是由于骨肉瘤患者多为青少年之故。有关发病时间，组织亚型以及化疗等影响骨肉瘤患者预后的文献〔7〕不少，但结论各异。本实验对一些可能相关因素与MVD的关系也进行了探讨，其间并无显著相关，说明肿瘤血管生成是肿瘤自身生物行为的作用结果。
转移是肿瘤预后不良的主要原因，但转移的机制至今仍不明了。有关MVD与肿瘤转移的关系，不少学者〔3，5〕认为两者密切相关，本研究也得出相同的结果，即在发生转移的骨肉瘤病例中，其MVD明显高于未发生转移者。这一方面固然是由于在微血管丰富的肿瘤中，肿瘤细胞更易于进入血循环，另一方面，Lamoreaux等〔8〕的研究表明，主要促使肿瘤血管生成的血管内皮生长因子可以调节明胶酶以及金属蛋白酶及其组织抑制剂的活性，从而进一步助长了肿瘤的侵袭能力。
, 百拇医药
影响骨肉瘤预后的因素很多〔7，8〕，年龄、发病部位、组织亚型等均对其预后有一定的影响，但20多年来，对骨肉瘤预后影响最大的是辅助化疗的广泛运用，本资料中显示，在未用化疗的肿瘤中，其微血管发育明显较已用化疗者为好，而在用过化疗的肿瘤中，虽然较多肿瘤内亦可见丰富的染色细胞，却较少形成微血管，这提示辅助化疗改善骨肉瘤患者预后的基础，很可能与化疗药物抑制了肿瘤微血管形成有关。
作者简介：蔡宣松，男，43岁，副教授，硕士生导师，科主任。研究方向：骨肿瘤
参考文献
1 Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst，1990;82(1):4～6
2 Folkman J, Cole P, Zimmerman S. Tumor behavior in isolated perfused organs:In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment. Ann Surg，1996;164:491
, 百拇医药
3 Bosari S,Lee AK, DeLellis RA, et al. Microvessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma. Hum Pathol，1992;23(7):755～761
4 Fox SB, Gatter KC, Harris AL. Tumor angiogenesis. J Pathol，1996;179(3):232～237
5 Gasparini G,Weidner N,Bevilacqua P, et al. Tumor microvessel density,p53 expression,tumor size,and peritumoral lymphatic vessel invasion are relevant prognostic markers in node-negative breast carcinoma.J Clin Oncol，1994;12(3):454～466
, 百拇医药
6 Scott PA, Harris AL. Current approaches to targeting cancer using antiangiogenesis therapies. Cancer Treat Rev，1994;20(4):393～412
7 Pochanugool L,Subhadharaphandou T,Dhanachai M,et al.Prognostic factors among 130 patients with osteosarcoma. Clin Orthop，1997;(345):206～214
8 Lamoreaux WJ,Fitzgerald ME,Reiner A, et al. Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro.Microvasc Res，1998;55(1):29～42
1999-04-19收稿，1999-05-10修回, 百拇医药
单位：上海铁道大学医学院附属甘泉医院骨科，上海 200065
关键词：骨肉瘤； 免疫组织化学； 微血管密度； 预后
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【摘要】 目的 探讨骨肉瘤组织中微血管密度(MVD)与骨肉瘤患者预后的关系。方法 应用免疫组化技术检测48例骨肉瘤组织标本中的MVD计数，并结合临床及随访资料综合分析患者年龄、发病时间、肿瘤大小、组织亚型、HDMTX化疗以及肿瘤转移与骨肉瘤MVD之间的关系。结果 MVD与患者年龄、发病时间、组织亚型及是否化疗无关，但HDMTX明显影响肿瘤微血管的发育成熟，且肿瘤发生转移者的MVD显著高于未发生转移者。结论 骨肉瘤组织中的MVD可能影响骨肉瘤患者的预后，HDMTX抑制肿瘤血管发育可能是其能控制肿瘤生长和转移的原因之一。
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【中图分类号】 R738.1
Clinical significance of microvessel density in osteosarcoma
Cai Xuansong，Mei Jiong，Li Rile，Guo Diping
(Department of Orthopaedics,Ganquan Hospital,Medical College of Shanghai Tiedao University，Shanghai 200065)
【Abstract】 Objective To investigate the prognostic value of microvessel density(MVD) in osteosarcoma. Methods Microvessel quantitation was detected by immunohistochemistry in histological sections from 48 patients with osteosarcoma,and the statistical significance was analysed between MVD and patients age,duration of symptoms,tumor size,pathologic subtype or chemotherapy. Results MVD was significantly higher in the metastatic group than that in non-metastatic group,and no association was observed between MVD and patients age,duration of symptoms,pathologic subtype or chemotherapy. Although the microvessel quantitation showed no significant difference between the patients with chemotherapy and those without, chemotherapy restrained microvessel from maturity. Conclusion High MVD in osteosarcoma was correlated with poor prognosis， and the microvessel maturity restrained by chemotherapy would be one reason of tumor metastasis.
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【Key words】 osteosarcoma;immunohistochemistry;microvessel density; prognosis
实体肿瘤的生长要依靠肿瘤血管生成以形成自身的血管系统，肿瘤组织因此能得到充足的营养供给而迅速生长。同时，肿瘤细胞也凭借新生血管在结构上的缺陷，进入微循环而向远方转移〔1，2〕。目前有关肿瘤血管生成与肿瘤转移的关系以及抗血管生成在肿瘤治疗上的运用，为国内外较多学者所注目。本研究应用第Ⅷ因子(FⅧ)相关抗原多克隆抗体对48例骨肉瘤的微血管密度(MVD)进行免疫组化研究，以探讨骨肉瘤微血管密度的临床意义。
1 材料与方法
1.1 病例来源 按以下条件选择病例：(1) 我院1991～1995年间因骨肉瘤行保肢手术或截肢术的所有患者。(2)来我院前未经手术治疗或活检手术的时间不超过2周者。(3)病损部位在四肢，就诊时无转移并可根治切除。(4)手术由同一外科小组施行。(5)病理诊断由两位有经验的病理医师分别阅片后得出并作出组织亚型分类。(6)手术前后有完整的病案资料；随访时间：从术后到发现转移，无转移者随访36个月以上。(7)有肿瘤原发灶组织的蜡块保存。
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1.2 临床资料 符合以上条件者48例，其中男22例，女26例。年龄9～49岁。首诊到手术日病程1～11月，平均4.1个月。所有肿瘤均穿破骨皮质侵犯软组织，肿瘤最大径3～25 cm，平均9.89 cm。治疗方法：化疗采用MTX-VCR方案(剂量MTX 200 mg.kg-1，VCR 2 mg)，术前化疗1次后施行手术，术后化疗于术后2周开始，第1年每3～4周重复1次，剂量同前，每3个月间以ADM 30 mg.m-2。第2年每3个月进行1次，到术后2年化疗结束。48例患者中34例术前术后接受了完整的化疗，14例因经济困难或化疗反应未能坚持全程化疗，其中6例未行术前化疗。手术分截肢和保肢两类，一般尽可能采用保肢手术。截肢指征：(1)主要血管神经受侵；(2)肿瘤切除后骨缺损重建困难而又无经济能力支付假体费用。本组中截肢17例，肢体挽救31例。
本组中骨肉瘤的组织亚型包括骨母细胞型28例，软骨母细胞型10例，纤维母细胞型6例，毛细血管扩张型3例，小细胞型1例。
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1.3 免疫组化技术(ABC法) 切片常规脱蜡，水化。用0.05%(体积分数，下同)胰蛋白酶消化约15 min，TBS洗涤，滴加1∶100的抗FⅧ相关抗原多克隆抗体(DAKO，兔抗)，4℃过夜。次日用TBS洗涤3次，再以3% H2O2阻断5 min，TBS洗涤后滴加1∶200的生物素化兔二抗(DAKO)，30 min后TBS洗涤3次滴加1∶100的ABC试剂(DAKO)，1 h后TBS洗涤3次，在0.03% H2O2-DAB中染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，风干，树胶封固。以上步骤均在室温下进行。
1.4 结果判断及微血管计数方法 微血管染色呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无血管腔(图1)。但如果血管腔直径大于8个红细胞或血管壁带有明显的肌层或纤维化以及炎症和坏死区的微血管则不计入总数〔3〕。计数时先用40倍镜寻找微血管最多的区域，然后用200倍镜(视野的面积为0.74 mm2)分别对3个视野进行计数，其平均值即为该肿瘤的微血管密度值。
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1.5 统计学处理 采用t检验。
图1 微血管染色呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无血管腔(免疫组化，ABC×200)
2 结果
2.1 微血管分布情况 微血管大多集中在肿瘤边缘，肿瘤之间的微血管数量差异较大。微血管在各肿瘤中分布的规则状况差异也较大，一些肿瘤的微血管分布比较规则，而另一些肿瘤的微血管分布则较为凌乱。
2.2 MVD与临床各指标间关系 MVD与患者年龄、发病时间、肿瘤大小、组织亚型(毛细血管型和小细胞型因例数较少未纳入统计)、化疗与否以及肿瘤转移之间的关系见表1。
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表1 MVD与临床各指标间的关系
指 标
n
±s范围
年龄
>16岁
23
36.8±13.1
33～78
<16岁
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25
39.7±14.7
11～106
发病时间
>4个月
20
38.1±14.2
11～72
<4个月
28
41.3±12.8
34～106
肿瘤大小
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>10 cm
23
37.2±15.0
11～106
<10 cm
25
37.7±14.7
21～98
组织亚型
骨母细胞型
28
42.1±14.5
11～96
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软骨母细胞型
10
36.8±13.8
26～106
纤维母细胞型
6
39.1±14.4
32～86
术前化疗
化疗
42
37.4±14.1
11～106
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无化疗
6
39.5±13.4
22～82
肿瘤转移
转移
29
44.8±13.2
36～106
无转移
19
36.6±13.1
11～82
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与无转移比较：*P<0.05
2.3 MVD与化疗的关系 本组资料中，6例患者未行术前化疗，为探讨化疗对MVD的影响，我们将这6例骨肉瘤组织与42例行术前化疗者的MVD作了比较，两组间MVD经t检验差异无显著性。但未行化疗者的微血管发育明显较已行化疗者为好，前者微血管管腔丰富并密集成网络状(图2)，而后者则多为单个或成簇细胞，形成管腔者明显为少(图3)。
图2 未行化疗者微血管管腔丰富并密集成网络状
(免疫组化，ABC×200)
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图3 化疗者见单个或成簇染色细胞，形成管腔者明显为少
(免疫组化，ABC×200)
3 讨论
肿瘤血管系统的生成虽然是一个连续的过程，但仍可分为6个相对独立的步骤〔4〕：(1)肿瘤的各种成分释放多种血管生成因子；(2)血管内皮细胞因血管生成因子的作用而出现形态改变(如各种细胞器数目和大小的增加以及伪足的出现)；(3)血管内皮细胞和肿瘤细胞释放蛋白溶酶以降解毛细血管基底膜和周围的细胞外基质；(4)血管内皮细胞从毛细血管后微静脉迁出形成血管新芽；(5)血管内皮细胞增殖(也有人认为可不出现〔1〕)；(6)肿瘤微血管分化和成型。因此，测定肿瘤MVD是研究肿瘤血管生成的主要方法之一〔5〕。肿瘤血管生成之所以为当今学者所注目，除了其与患者预后密切相关外，抗肿瘤血管生成有可能成为治疗肿瘤的重要方法〔6〕。
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和其它研究结果相似，我们的结果显示骨肉瘤的微血管多分布在肿瘤边缘且不规则，数量悬殊也较大，这可能是肿瘤血管生成的一般规律。虽然有文献报道MVD随患者年龄升高而下降，但在我们的结果中，MVD则与年龄无关，这可能是由于骨肉瘤患者多为青少年之故。有关发病时间，组织亚型以及化疗等影响骨肉瘤患者预后的文献〔7〕不少，但结论各异。本实验对一些可能相关因素与MVD的关系也进行了探讨，其间并无显著相关，说明肿瘤血管生成是肿瘤自身生物行为的作用结果。
转移是肿瘤预后不良的主要原因，但转移的机制至今仍不明了。有关MVD与肿瘤转移的关系，不少学者〔3，5〕认为两者密切相关，本研究也得出相同的结果，即在发生转移的骨肉瘤病例中，其MVD明显高于未发生转移者。这一方面固然是由于在微血管丰富的肿瘤中，肿瘤细胞更易于进入血循环，另一方面，Lamoreaux等〔8〕的研究表明，主要促使肿瘤血管生成的血管内皮生长因子可以调节明胶酶以及金属蛋白酶及其组织抑制剂的活性，从而进一步助长了肿瘤的侵袭能力。
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影响骨肉瘤预后的因素很多〔7，8〕，年龄、发病部位、组织亚型等均对其预后有一定的影响，但20多年来，对骨肉瘤预后影响最大的是辅助化疗的广泛运用，本资料中显示，在未用化疗的肿瘤中，其微血管发育明显较已用化疗者为好，而在用过化疗的肿瘤中，虽然较多肿瘤内亦可见丰富的染色细胞，却较少形成微血管，这提示辅助化疗改善骨肉瘤患者预后的基础，很可能与化疗药物抑制了肿瘤微血管形成有关。
作者简介：蔡宣松，男，43岁，副教授，硕士生导师，科主任。研究方向：骨肿瘤
参考文献
1 Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst，1990;82(1):4～6
2 Folkman J, Cole P, Zimmerman S. Tumor behavior in isolated perfused organs:In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment. Ann Surg，1996;164:491
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3 Bosari S,Lee AK, DeLellis RA, et al. Microvessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma. Hum Pathol，1992;23(7):755～761
4 Fox SB, Gatter KC, Harris AL. Tumor angiogenesis. J Pathol，1996;179(3):232～237
5 Gasparini G,Weidner N,Bevilacqua P, et al. Tumor microvessel density,p53 expression,tumor size,and peritumoral lymphatic vessel invasion are relevant prognostic markers in node-negative breast carcinoma.J Clin Oncol，1994;12(3):454～466
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6 Scott PA, Harris AL. Current approaches to targeting cancer using antiangiogenesis therapies. Cancer Treat Rev，1994;20(4):393～412
7 Pochanugool L,Subhadharaphandou T,Dhanachai M,et al.Prognostic factors among 130 patients with osteosarcoma. Clin Orthop，1997;(345):206～214
8 Lamoreaux WJ,Fitzgerald ME,Reiner A, et al. Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro.Microvasc Res，1998;55(1):29～42
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