用16S rRNA基因诊断自发性腹膜炎23例
作者：徐 芸 冯百岁 郭伶俐
单位：徐 芸 冯百岁 河南医科大学第一附属医院消化科 河南省郑州市 450052； 郭伶俐 河南省桐柏县公疗医院
关键词：肝硬化；腹水；腹膜炎/诊断；基因诊断；16S rRNA基因
世界华人消化杂志990244 中国图书资料分类号 R575.2
Subject headings liver cirrhosis; peritonitis/diagnosis; gene diagnosis; 16S rRNA gene
1 材料和方法
1.1 材料 23例肝硬变失代偿期患者，男17例，女6例，平均年龄42.6岁，全部为近期河南医科大学一附院消化科住院的患者，均有中等量或大量腹水，利尿治疗效果不佳.
, 百拇医药
1.2 标本 腹穿取腹水10mL，6000r/min离心10min～15min，沉淀用生理盐水悬起，再离心6000r/min 10min～15min，去上清，沉淀置冰箱备用.
1.3 方法 参照[1].
1.3.1 核酸提取用碘化钠裂解，玻璃粉吸附，沉淀的临床标本用适量的生理盐水悬起，加等量的溶液1裂解和吸附5min，离心去上清，洗涤液洗涤后，用去粒子水洗脱吸附在玻璃粉上的DNA，离心后直接将上清用于DNA.
1.3.2 PCR 取2μL 1mmol/L dNTP，1μL 10mmol/L引物(自行设计：上游引物：5＇-AGAG(A)TTTGATCC(A)(T)TGGC(T)TC(T)AG-3＇、下游引物5＇-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)，1U TaqDNA聚合酶，5μL 10×反应缓冲液(15mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1%明胶，0.01%(V/V) Tween 20, 100mmol/L Tris-HCl pH 8.3)，加41μL 提取的模板，石蜡油封顶后，在DNA热循环仪上95℃预变性3min，94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸120s，35个循环后，于72℃再延伸5min以确保产物延伸完全，产物在含50μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，35V，30min后，紫外灯下观察结果.
, 百拇医药
1.3.3 Dot-Blot杂交 将扩增产物用氯仿抽提，95℃热变性5min，冰浴10min，点硝酸纤维膜，2mL/点，80℃烤2h，55℃下预杂交合杂交(预杂交液为2×SSPE，0.5% SDS，0.5%脱脂奶粉，5%硫酸葡聚糖，25μg/mL鲑鱼精DNA)；预杂交20min，杂交10min(探针浓度20μg/mL，用预杂交液配制)，(根据Greisen et al报道的序列合成：Gram阳性菌探针为：5＇-GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCA-3＇(RW-03)，Gram阴性菌探针为：5＇-GACGTAAGGGCCATGAG(T)GACTTGACGTAC-3＇(RW-04)，3＇端修饰生物素)，2×SSPE-0.1% SDS洗涤4次，2% BSA-PBS 55℃封闭20min，室温下用Avidin-HRP：3% BSA-2×SSPE(1∶250)作用，2×SSPE洗涤5遍，DAB(0.06% DAB-0.001% 9(V/V) H2O2 (30%)-0.05mmol/L Tris, Hp 7.6)避光显色10min，清水冲洗终止反应.
, 百拇医药
2 结果
2.1 临床表现 23例肝硬变失代偿期患者，根据临床表现均怀疑并发自发性腹膜炎，但是多数患者仅有腹膜炎部分临床表现，甚至无任何表现，实验室检查细胞数>0.5×109也只是一部分，细胞培养阳性或鲎试验阳性率均不高，具体情况如下：
表1 临床表现出现率 症 状
发热
腹痛
腹部压痛
和反跳痛
细胞数>
0.5×109
, 百拇医药
细胞数>
0.3×109
蛋白>
3g/L
培养
鲎试验
阳性(有)
13
11
16
10
18
11
, 百拇医药
8
7
阴性(无)
10
12
7
13
5
12
15
16
阳性率(%)
56.5
47.8
, 百拇医药
69.6
43.5
78.3
47.8
34.8
38.4
在这23例自发性腹膜炎的患者，同时有7项者2例，有6项、5项和4项的各4例，有3项的2例，2项的、1项的各1例，7项均无的5例.
2.2 用PCR-Dot blot检测23份腹水的结果 PCR扩增后紫外灯下观测，阳性率91.4%，用Gram染色阴性菌探针杂交阳性率100%，Gram染色阳性菌探针杂交阳性率21.7%.表2 细菌培养与PCR-Dot Blot对照
n
, 百拇医药
PCR阳性
Gram+探针阳性
Gram-探针阳性
细菌培养阳性
8
8
8
2
细菌培养阴性
15
13
15
3
, http://www.100md.com
阳性率(%)
34.8
91.4
100
21.7
表3 鲎试验与PCR-Dot Blot对照
n
PCR阳性
Gram-探针阳性
鲎试验阳性
7
6
7
, 百拇医药
鲎试验阴性
16
15
16
阳性率(%)
38.4
91.4
100
表4 细菌培养与PCR-Dot Blot对照
n
PCR阳性
Gram+探针阳性
Gram-探针阳性
, http://www.100md.com
细胞数<0.3×109
5
5
0
5
两者之间
8
7
1
8
细胞数>0.5×109
10
9
, http://www.100md.com
4
10
细胞数>0.3×109率(%)
78.3
91.4
21.7
100
3 讨论
临床对肝硬变失代偿期并自发性腹膜炎的诊断，主要靠临床表现加腹水常规检查，有典型临床表现如发热、腹痛、腹部压痛反跳痛、腹水细胞数>0.5×109，蛋白>3g/L，诊断并不困难；但是由于肝硬变患者原有大量腹水，使腹痛、腹部压痛反跳痛等症状不甚明显，患者的免疫状况及反应性差，对感染后发热的发生率也低，本组患者23例，发热只占56.5%，腹痛占47.8%，腹部压痛反跳痛占69.6%，如仅靠临床表现来诊断，将有近半数的患者要漏诊. 如靠腹水常规检查，细胞数>0.5×109(阳性率43.5%)，可靠性并未增大. 同样由于大量腹水的稀释作用，使腹水常规常界于渗出液和漏出液之间. 而细菌培养和鲎试验的阳性率也不高，分别为34.8%和38.4%. 我们用16S rRNA基因作为靶基因，作PCR可检测出所有的腹膜感染的致病菌，PCR扩增紫外灯下观察，阳性率91.4%；扩增产物点膜，与Gram阴性菌的特异性探针杂交阳性率达100%，这32例患者正规应用抗生素治疗后，发热，腹痛消失，腹水明显减少，肝功能改善. 1wk至10d后PCR及探针Dot-blot杂交均全部转阴.
, http://www.100md.com
由于自发性腹膜炎的病原菌95%均来源于肠道的菌丛，以大肠杆菌、肠球菌及厌氧菌占了绝大多数，分类以阴性杆菌为主，本试验也证实了这一点，虽然鲎试验的阳性率只有38.4%，但是与Gram阴性菌的特异性探针杂交阳性率达100%，与Gram阳性菌的特异性探针杂交阳性率为21.7%，说明有部分患者合并Gram+和Gram-菌的多重感染，并且多重感染时腹水的细胞数为高. 利用真细菌域16S rRNA基因来检测临床病原菌，原理在于该基因同时具有保守性和特异性[2]，它在生物进化中比其他基因进化得慢，因其保守性而被冠以细菌“分子化石”之称，它可以识别所有的病原菌，这就是“撒网捕鱼”的效力. 同时加上PCR快速、简便、敏感和特异的特点，使自发性腹膜炎的诊断变得可靠和快捷.
用Dot Blot杂交鉴定PCR产物，主要目的是使PCR结果的判断更加客观化，它可以排除非特异扩增和引物二聚体的影响，同时利用16S rRNA基因的变异性对扩增产物进行鉴别，如从不同水平设计引物可将病原菌鉴定到种属或基因型，如能区分细菌为Gram染色阳性或为Gram染色阴性，对指导临床选择抗生素有重要意义，我们已对胸腹水、尿液、血液和脑脊液做过试验[3]；并对该方法进行了优化[4].
, 百拇医药
总之，用PCR-Dot Blot杂交法检测病原菌的16S rRNA基因来诊断自发性腹膜炎的方法是细菌学诊断的一个新尝试，我们还将进一步设计细菌的种属特异性引物，用微孔板夹心杂交的方法，将细菌的临床检测不断推向分子水平，不断推向现代化.
通讯作者 徐芸
4 参考文献
[1] Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR Primers and Probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol, 1994;32:335-352
[2] 徐芸. 16S rRNA基因在检测临床病原菌中的应用. 国外医学，微生物分册，1997；20：16-19
[3] 徐芸，杨瑞馥，郭兆标，李继昌. PCR-Dot blot杂交直接检测临床病原菌的报告. 中华医院感染杂志，1998；8：14-16
[4] 徐芸，张静，李继昌，郭兆标，张敏丽，汪小辉. 用16S rRNA基因检测临床病原菌的研究. 中华流行病杂志，1997；18(3-A)：180-182
收稿日期 1998-08-17, http://www.100md.com
单位：徐 芸 冯百岁 河南医科大学第一附属医院消化科 河南省郑州市 450052； 郭伶俐 河南省桐柏县公疗医院
关键词：肝硬化；腹水；腹膜炎/诊断；基因诊断；16S rRNA基因
世界华人消化杂志990244 中国图书资料分类号 R575.2
Subject headings liver cirrhosis; peritonitis/diagnosis; gene diagnosis; 16S rRNA gene
1 材料和方法
1.1 材料 23例肝硬变失代偿期患者，男17例，女6例，平均年龄42.6岁，全部为近期河南医科大学一附院消化科住院的患者，均有中等量或大量腹水，利尿治疗效果不佳.
, 百拇医药
1.2 标本 腹穿取腹水10mL，6000r/min离心10min～15min，沉淀用生理盐水悬起，再离心6000r/min 10min～15min，去上清，沉淀置冰箱备用.
1.3 方法 参照[1].
1.3.1 核酸提取用碘化钠裂解，玻璃粉吸附，沉淀的临床标本用适量的生理盐水悬起，加等量的溶液1裂解和吸附5min，离心去上清，洗涤液洗涤后，用去粒子水洗脱吸附在玻璃粉上的DNA，离心后直接将上清用于DNA.
1.3.2 PCR 取2μL 1mmol/L dNTP，1μL 10mmol/L引物(自行设计：上游引物：5＇-AGAG(A)TTTGATCC(A)(T)TGGC(T)TC(T)AG-3＇、下游引物5＇-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)，1U TaqDNA聚合酶，5μL 10×反应缓冲液(15mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1%明胶，0.01%(V/V) Tween 20, 100mmol/L Tris-HCl pH 8.3)，加41μL 提取的模板，石蜡油封顶后，在DNA热循环仪上95℃预变性3min，94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸120s，35个循环后，于72℃再延伸5min以确保产物延伸完全，产物在含50μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，35V，30min后，紫外灯下观察结果.
, 百拇医药
1.3.3 Dot-Blot杂交 将扩增产物用氯仿抽提，95℃热变性5min，冰浴10min，点硝酸纤维膜，2mL/点，80℃烤2h，55℃下预杂交合杂交(预杂交液为2×SSPE，0.5% SDS，0.5%脱脂奶粉，5%硫酸葡聚糖，25μg/mL鲑鱼精DNA)；预杂交20min，杂交10min(探针浓度20μg/mL，用预杂交液配制)，(根据Greisen et al报道的序列合成：Gram阳性菌探针为：5＇-GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCA-3＇(RW-03)，Gram阴性菌探针为：5＇-GACGTAAGGGCCATGAG(T)GACTTGACGTAC-3＇(RW-04)，3＇端修饰生物素)，2×SSPE-0.1% SDS洗涤4次，2% BSA-PBS 55℃封闭20min，室温下用Avidin-HRP：3% BSA-2×SSPE(1∶250)作用，2×SSPE洗涤5遍，DAB(0.06% DAB-0.001% 9(V/V) H2O2 (30%)-0.05mmol/L Tris, Hp 7.6)避光显色10min，清水冲洗终止反应.
, 百拇医药
2 结果
2.1 临床表现 23例肝硬变失代偿期患者，根据临床表现均怀疑并发自发性腹膜炎，但是多数患者仅有腹膜炎部分临床表现，甚至无任何表现，实验室检查细胞数>0.5×109也只是一部分，细胞培养阳性或鲎试验阳性率均不高，具体情况如下：
表1 临床表现出现率 症 状
发热
腹痛
腹部压痛
和反跳痛
细胞数>
0.5×109
, 百拇医药
细胞数>
0.3×109
蛋白>
3g/L
培养
鲎试验
阳性(有)
13
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阴性(无)
10
12
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阳性率(%)
56.5
47.8
, 百拇医药
69.6
43.5
78.3
47.8
34.8
38.4
在这23例自发性腹膜炎的患者，同时有7项者2例，有6项、5项和4项的各4例，有3项的2例，2项的、1项的各1例，7项均无的5例.
2.2 用PCR-Dot blot检测23份腹水的结果 PCR扩增后紫外灯下观测，阳性率91.4%，用Gram染色阴性菌探针杂交阳性率100%，Gram染色阳性菌探针杂交阳性率21.7%.表2 细菌培养与PCR-Dot Blot对照
n
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PCR阳性
Gram+探针阳性
Gram-探针阳性
细菌培养阳性
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细菌培养阴性
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阳性率(%)
34.8
91.4
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21.7
表3 鲎试验与PCR-Dot Blot对照
n
PCR阳性
Gram-探针阳性
鲎试验阳性
7
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鲎试验阴性
16
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阳性率(%)
38.4
91.4
100
表4 细菌培养与PCR-Dot Blot对照
n
PCR阳性
Gram+探针阳性
Gram-探针阳性
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细胞数<0.3×109
5
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两者之间
8
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细胞数>0.5×109
10
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, http://www.100md.com
4
10
细胞数>0.3×109率(%)
78.3
91.4
21.7
100
3 讨论
临床对肝硬变失代偿期并自发性腹膜炎的诊断，主要靠临床表现加腹水常规检查，有典型临床表现如发热、腹痛、腹部压痛反跳痛、腹水细胞数>0.5×109，蛋白>3g/L，诊断并不困难；但是由于肝硬变患者原有大量腹水，使腹痛、腹部压痛反跳痛等症状不甚明显，患者的免疫状况及反应性差，对感染后发热的发生率也低，本组患者23例，发热只占56.5%，腹痛占47.8%，腹部压痛反跳痛占69.6%，如仅靠临床表现来诊断，将有近半数的患者要漏诊. 如靠腹水常规检查，细胞数>0.5×109(阳性率43.5%)，可靠性并未增大. 同样由于大量腹水的稀释作用，使腹水常规常界于渗出液和漏出液之间. 而细菌培养和鲎试验的阳性率也不高，分别为34.8%和38.4%. 我们用16S rRNA基因作为靶基因，作PCR可检测出所有的腹膜感染的致病菌，PCR扩增紫外灯下观察，阳性率91.4%；扩增产物点膜，与Gram阴性菌的特异性探针杂交阳性率达100%，这32例患者正规应用抗生素治疗后，发热，腹痛消失，腹水明显减少，肝功能改善. 1wk至10d后PCR及探针Dot-blot杂交均全部转阴.
, http://www.100md.com
由于自发性腹膜炎的病原菌95%均来源于肠道的菌丛，以大肠杆菌、肠球菌及厌氧菌占了绝大多数，分类以阴性杆菌为主，本试验也证实了这一点，虽然鲎试验的阳性率只有38.4%，但是与Gram阴性菌的特异性探针杂交阳性率达100%，与Gram阳性菌的特异性探针杂交阳性率为21.7%，说明有部分患者合并Gram+和Gram-菌的多重感染，并且多重感染时腹水的细胞数为高. 利用真细菌域16S rRNA基因来检测临床病原菌，原理在于该基因同时具有保守性和特异性[2]，它在生物进化中比其他基因进化得慢，因其保守性而被冠以细菌“分子化石”之称，它可以识别所有的病原菌，这就是“撒网捕鱼”的效力. 同时加上PCR快速、简便、敏感和特异的特点，使自发性腹膜炎的诊断变得可靠和快捷.
用Dot Blot杂交鉴定PCR产物，主要目的是使PCR结果的判断更加客观化，它可以排除非特异扩增和引物二聚体的影响，同时利用16S rRNA基因的变异性对扩增产物进行鉴别，如从不同水平设计引物可将病原菌鉴定到种属或基因型，如能区分细菌为Gram染色阳性或为Gram染色阴性，对指导临床选择抗生素有重要意义，我们已对胸腹水、尿液、血液和脑脊液做过试验[3]；并对该方法进行了优化[4].
, 百拇医药
总之，用PCR-Dot Blot杂交法检测病原菌的16S rRNA基因来诊断自发性腹膜炎的方法是细菌学诊断的一个新尝试，我们还将进一步设计细菌的种属特异性引物，用微孔板夹心杂交的方法，将细菌的临床检测不断推向分子水平，不断推向现代化.
通讯作者 徐芸
4 参考文献
[1] Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR Primers and Probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol, 1994;32:335-352
[2] 徐芸. 16S rRNA基因在检测临床病原菌中的应用. 国外医学，微生物分册，1997；20：16-19
[3] 徐芸，杨瑞馥，郭兆标，李继昌. PCR-Dot blot杂交直接检测临床病原菌的报告. 中华医院感染杂志，1998；8：14-16
[4] 徐芸，张静，李继昌，郭兆标，张敏丽，汪小辉. 用16S rRNA基因检测临床病原菌的研究. 中华流行病杂志，1997；18(3-A)：180-182
收稿日期 1998-08-17, http://www.100md.com