银杏愈伤组织和悬浮细胞培养及黄酮类化合物的产生
作者：张 辉 于荣敏 姚新生
单位：张辉 于荣敏 沈阳药科大学制药系；姚新生 中药系， 沈阳 110015
关键词：银杏；愈伤组织培养；细胞悬浮培养；黄酮类化合物；高效液相色谱
沈阳药科大学学报990214 摘 要 进行了银杏愈伤组织和悬浮细胞培养及其次生代谢产物——黄酮类化合物的研究.考察了不同理化因子对各种银杏外植体黄酮含量的影响.对银杏细胞培养物中的芦丁、槲皮素和山奈酚进行了HPLC的定量测定.
分类号 Q945
Studies on the Callus Culture and the Suspension Culture of Ginkgo biloba and the Formation of Flavonoids
, http://www.100md.com
Zhang Hui,Yu Rongmin,Yao Xinsheng
Department of Pharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract This paper reported firstly the callus culture & the suspension culture of Ginkgo biloba and the formation of its secondary metabolites-flavonoids.The effects of some physico-chemical factors on the induction,culture of callus and cells and the yield of flavonoids were also investigated.Finally,the quantitative determination by HPLC for rutin,quercetin and kaempferol in the cultures were showed in this study.
, 百拇医药
Key words Ginkgo biloba;callus culture;cell suspension culture;flavonoids;HPLC
银杏Ginkgo biloba L.是我国的特有树种之一，仅存一科一属一种.本世纪70年代，人们发现银杏叶提取物(EGB)对心脑血管疾病有很好的治疗作用〔1，2〕.一般认为，银杏叶中治疗心血管系统疾病的有效成分为黄酮类.银杏叶中含有20多种黄酮成分，包括3种双黄酮化合物.此外，还分离出异鼠李素等成分，它们可能以苷元或苷类状态存在.
作者曾报道了银杏愈伤组织和悬浮细胞培养及其代谢产物银杏内酯的研究情况〔3，4〕，本文为银杏系统研究的子课题，作者首次报道了银杏愈伤组织培养物和细胞悬浮培养物中黄酮类化合物的产生，考察了多种理化因子对黄酮类化合物产生的影响，并对实验结果进行了探索性的讨论.
, http://www.100md.com 1 实验仪器与药品
HH B11 500 电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；HYA恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)；立式培养架(自制)；CJJ808超净工作台(沈阳医疗器械二厂)；pHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)；DT-100A单盘天平(北京光学仪器厂)；甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；重蒸馏水(本校制药厂提供)；36%乙醇(分析纯，沈阳化学试剂厂)；芦丁(rutin,中国药品生物制品检定所产品)；槲皮素(quercetin,中国药品生物制品检定所产品)；山奈酚(kaempferol,中国药品生物制品检定所产品).
银杏根愈伤组织是由银杏种子萌发的无菌苗根诱导、经驯化得到的健康无性细胞系.茎、叶愈伤组织为银杏树茎皮和幼嫩的叶片诱导并驯化得到的无性细胞系.银杏外植体采自沈阳药科大学校园内.
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 培养方法
2.1.1 银杏根愈伤组织的继代培养
附有1.0 mg/L NAA(naphthaleneacetic acid)、0.1 mg/L KT(kinetin)及30 g/L 蔗糖的MS培养基经121℃、0.1 MPa消毒25～30 min，将愈伤组织接种于含 40 mL固体培养基的100 mL三角瓶中，置培养箱中暗培养或在自制培养架上(温度均为(25±1)℃) 24 h光照培养，二者均为20天继代一次.
2.1.2 银杏根细胞悬浮培养体系的建立
将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转入液体培养，接种量控制在2～3 g湿重，接种于装有80 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，进行悬浮细胞培养.所用培养基与培养愈伤组织的培养基相同，但不加琼脂，灭菌方法同上，暗培养或光照培养温度均为(25±1)℃，在摇床上振荡培养20天后收获细胞.
, 百拇医药
2.2 提取分离
2.2.1 样品来源
银杏根细胞悬浮培养物及愈伤组织培养物收获后，分别干燥而得.
2.2.2 提取工艺
取细胞培养物(2 g)，置沙氏提取器中，用70%乙醇提取至无色，弃去残渣.提取液(褐色)抽滤，充去沉淀.滤液浓缩至小体积，与聚酰胺粉混匀，蒸干，装柱，行聚酰胺柱(1 g)层析.首先用蒸馏水洗至无色，再用70%乙醇洗脱.醇洗液减压回收乙醇，残渣真空干燥，甲醇溶解，过滤，定容至10 mL，即得HPLC分析用样品.
2.3 银杏根细胞培养物中黄酮类化合物HPLC含量测定〔5，6〕
2.3.1 色谱条件
, http://www.100md.com
色谱柱：lnertsil ODS column,4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：甲醇-水-乙醇(V∶V∶V=45∶46∶9，57∶39∶4)；流速：1.0 mL/min；灵敏度：0.5×10-4；保留值：30 min、18 min；进样量：10 μL、5 μL.
2.3.2 标准曲线制备
准确称取芦丁和槲皮素标准品各2 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，各进样4、8、12、16、20 μL.
用芦丁峰面积(A)对进样量(C g/L)进行线性回归，得回归方程：A=1.240×10-7 C-0.884，r=0.998；用槲皮素峰面积(A)对进样量(C g/L)进行线形回归，得回归方程：A=1.581×10-7 C+1.520,r=0.999.
, http://www.100md.com
2.3.3 样品测定
将样品供试液分别进样，记录色谱峰，测定芦丁峰面积，与标准品的峰面积相比较，计算芦丁和槲皮素、山奈酚的含量.
3 结果与讨论
3.1 不同外植体愈伤组织培养物光照与暗培养条件下黄酮类化合物含量比较(见表1)
Tab.1 The content of flavonoids in callus of G.biloba under light compared with the dark(%×10-3) Constituents
Stem
Leaves
, http://www.100md.com
Root
Petiole
Embryo
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
, http://www.100md.com
Rutin
7.40
0.86
2.80
1.40
0.80
0.76
-
-
-
-
Quercetin
1.70
, http://www.100md.com
5.50
2.00
3.00
6.30
3.60
-
-
-
-
Kampferol
-
-
-
, 百拇医药 -
-
-
-
-
-
-
3.2 银杏根细胞由光照转为暗培养后黄酮含量的变化
根细胞在N1.0K0.1MS(MS+NAA1.0 mg/L+0.1 mg/L KT，即对照培养基，下同)培养基上，由光照转为暗培养后黄酮含量变化的研究结果表明，根细胞由光照转为暗培养，第一代培养物中检出芦丁(0.21%×10-3)和槲皮素(3.73%×10-3)，且以槲皮素含量为高；第二、三代培养物中芦丁含量逐渐增加，分别达0.24%×10-3和0.36%×10-3，槲皮素含量渐次降低，至第三代则检测不到该成分，说明由光照转为暗培养后，随着培养代数的增加，槲皮素的苷化现象(产物为芦丁)更为明显.此外，各代愈伤组织均未测出山奈酚.
, 百拇医药
3.3 2，4-D对银杏根愈伤组织中黄酮含量的影响(培养20天)
由表2可知，培养时间为20天时，对照组愈伤组织中芦丁含量最高，随2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)浓度的增加，芦丁含量下降，至2 mg/L时降至最低，尔后又开始增加；槲皮素的含量变化情况与之相反.由实验可见，培养时间为20天时，2，4-D的存在抑制山奈酚的合成.Tab.2 The effect of 2,4-D on the content(%×10-3)of flavonoids in the callus(cultured 20d)of G.biloba 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, http://www.100md.com Kaempferol
Control
0.92
0.23
0.38
1
0.35
0.25
-
2
0.31
0.33
-
, 百拇医药
4
0.37
0.29
-
8
0.43
0.17
-
12
0.66
0.10
-
3.4 银杏根愈伤组织培养30天时不同2，4-D浓度对黄酮含量的影响
, 百拇医药
由表3可见，愈伤组织培养30天时，芦丁和槲皮素的最高含量均出现在2，4-D浓度为6 mg/L时，尤以后者含量为最高，达5.0%×10-3；另外，由该实验还可看出，不同的植物生物调节剂浓度、不同的培养时间对不同类型黄酮类化合物的产量均有不同程度影响.
Tab.3 The effect of concentration of 2,4-D on the content(%×10-3)of
flavonoids in the callus(cultured 30d) of G.biloba 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, 百拇医药
Kaempferol
1
0.37
0.13
-
2
0.32
-
-
6
0.83
5.0
-
, 百拇医药 8
0.66
0.10
-
3.5 不同浓度KT对黄酮含量的影响
由表4可知，当KT浓度为3.0 mg/L时，芦丁和槲皮素的含量均达到最大值.但均未测得山奈酚的存在. Tab.4 The effect of concentration of KT on the content(%×10-3)of flavonoids KT/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, http://www.100md.com
Kaempferol
0
0.22
-
-
0.1
0.18
0.10
-
0.5
0.15
0.20
-
, 百拇医药
1.0
0.20
-
-
3.0
0.89
0.23
-
5.0
0.20
-
-
7.0
, 百拇医药 0.60
0.14
-
12.0
0.11
0.06
-
3.6 2，4-D+KT对黄酮含量的影响
MS培养基上附加KT(5 mg/L)时不同浓度2，4-D对黄酮含量的影响结果见表5.KT附加不同浓度的2，4-D时，芦丁含量随其浓度的增加而提高；此外，在2，4-D浓度为10 mg/L时尚检测出了山奈酚.Tab.5 The influence of 2，4-D+KT on the content (%×10-3)of flavonoids 2，4-D/mg.L-1
, http://www.100md.com
Rutin
Quercetin
Kaempferol
6
0.38
-
-
7
0.83
5.50
-
10
1.50
, 百拇医药
-
0.33
3.7 pH值对银杏培养物中黄酮含量的影响
一般来说，最有利于培养细胞生长的pH值为5～6.本实验结果(表6)表明在pH 4.5～6.4之间，细胞培养物中均可测得芦丁，且以pH 5.4时含量最高(0.88%×10-3)，而且在此pH值时尚测得槲皮素的存在.Tab.6 The effect of pH on the content (%×10-3)of flavonoids pH
Rutin
Quercetin
Kaempferol
4.5
, http://www.100md.com
0.12
-
-
5.0
0.25
-
-
5.4
0.88
0.32
-
5.7
0.16
, http://www.100md.com -
-
6.0
0.25
-
-
6.4
0.39
-
-
3.8 淀粉对银杏培养物中黄酮类成分的影响
淀粉作为植物细胞培养中常用碳源之一，有时对代谢产物的产生和含量会产生一定的影响，但在本实验中，由于已有足量蔗糖作为碳源，故淀粉的加入非但未能提高次级代谢产物的产量，相反，却抑制了黄酮类化合物的产生，这可能是淀粉的加入改变了培养液的渗透压，从而对代谢产物的生合成途径产生影响的缘故.
, 百拇医药
3.9 2，4-D对银杏液体培养物中黄酮类成分含量的影响
由表7可知，在银杏细胞悬浮培养中，加入4 mg/L的2，4-D对山奈酚的产生有利；加入10 mg/L的2，4-D时，槲皮素和芦丁的含量均有大幅度的提高；但山奈酚的含量随2，4-D浓度的增加而减少.
Tab.7 The effect of 2，4-D on the content(%×10-3) of flavonoids in the cell suspension cultures 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
Kaempferol
, http://www.100md.com
4
0.86
4.60
0.92
7
0.26
25.00
0.57
10
2.30
47.25
0.28
致谢 本校中成药分析教研室陈发奎教授、天然药化研究室裴月湖教授协助完成HPLC测定，谨致谢忱.
, 百拇医药
参考文献
1 游松,姚新生，陈英杰.银杏的化学及药理研究进展.沈阳药学院学报，1988，5(2)：142～148
2 史清文，刘素云，张文素，等.银杏叶的研究开发概况.天然产物研究与开发，1995，7(1)：71
3 于荣敏，赵鸿莲，郑玉果，等.银杏愈伤组织培养及其代谢产物银杏内酯的研究.生物工程学报，1999，15：(1)：59～65
4 于荣敏，赵鸿莲，姚新生，等.银杏悬浮细胞培养及其次生代谢产物银杏内酯的研究.生物工程学报，1999，15(2)：84～88
5 谢大年.银杏叶提取物中黄酮类成分的高效液相色谱分析.色谱，1984，12(5)：384
6 姚渭溪.银杏叶中活性成分的提取工艺、测定及其进展.中草药，1995，24(3)：157～159
收稿日期:1998-06-29, 百拇医药
单位：张辉 于荣敏 沈阳药科大学制药系；姚新生 中药系， 沈阳 110015
关键词：银杏；愈伤组织培养；细胞悬浮培养；黄酮类化合物；高效液相色谱
沈阳药科大学学报990214 摘 要 进行了银杏愈伤组织和悬浮细胞培养及其次生代谢产物——黄酮类化合物的研究.考察了不同理化因子对各种银杏外植体黄酮含量的影响.对银杏细胞培养物中的芦丁、槲皮素和山奈酚进行了HPLC的定量测定.
分类号 Q945
Studies on the Callus Culture and the Suspension Culture of Ginkgo biloba and the Formation of Flavonoids
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Zhang Hui,Yu Rongmin,Yao Xinsheng
Department of Pharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract This paper reported firstly the callus culture & the suspension culture of Ginkgo biloba and the formation of its secondary metabolites-flavonoids.The effects of some physico-chemical factors on the induction,culture of callus and cells and the yield of flavonoids were also investigated.Finally,the quantitative determination by HPLC for rutin,quercetin and kaempferol in the cultures were showed in this study.
, 百拇医药
Key words Ginkgo biloba;callus culture;cell suspension culture;flavonoids;HPLC
银杏Ginkgo biloba L.是我国的特有树种之一，仅存一科一属一种.本世纪70年代，人们发现银杏叶提取物(EGB)对心脑血管疾病有很好的治疗作用〔1，2〕.一般认为，银杏叶中治疗心血管系统疾病的有效成分为黄酮类.银杏叶中含有20多种黄酮成分，包括3种双黄酮化合物.此外，还分离出异鼠李素等成分，它们可能以苷元或苷类状态存在.
作者曾报道了银杏愈伤组织和悬浮细胞培养及其代谢产物银杏内酯的研究情况〔3，4〕，本文为银杏系统研究的子课题，作者首次报道了银杏愈伤组织培养物和细胞悬浮培养物中黄酮类化合物的产生，考察了多种理化因子对黄酮类化合物产生的影响，并对实验结果进行了探索性的讨论.
, http://www.100md.com 1 实验仪器与药品
HH B11 500 电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；HYA恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)；立式培养架(自制)；CJJ808超净工作台(沈阳医疗器械二厂)；pHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)；DT-100A单盘天平(北京光学仪器厂)；甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；重蒸馏水(本校制药厂提供)；36%乙醇(分析纯，沈阳化学试剂厂)；芦丁(rutin,中国药品生物制品检定所产品)；槲皮素(quercetin,中国药品生物制品检定所产品)；山奈酚(kaempferol,中国药品生物制品检定所产品).
银杏根愈伤组织是由银杏种子萌发的无菌苗根诱导、经驯化得到的健康无性细胞系.茎、叶愈伤组织为银杏树茎皮和幼嫩的叶片诱导并驯化得到的无性细胞系.银杏外植体采自沈阳药科大学校园内.
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 培养方法
2.1.1 银杏根愈伤组织的继代培养
附有1.0 mg/L NAA(naphthaleneacetic acid)、0.1 mg/L KT(kinetin)及30 g/L 蔗糖的MS培养基经121℃、0.1 MPa消毒25～30 min，将愈伤组织接种于含 40 mL固体培养基的100 mL三角瓶中，置培养箱中暗培养或在自制培养架上(温度均为(25±1)℃) 24 h光照培养，二者均为20天继代一次.
2.1.2 银杏根细胞悬浮培养体系的建立
将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转入液体培养，接种量控制在2～3 g湿重，接种于装有80 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，进行悬浮细胞培养.所用培养基与培养愈伤组织的培养基相同，但不加琼脂，灭菌方法同上，暗培养或光照培养温度均为(25±1)℃，在摇床上振荡培养20天后收获细胞.
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2.2 提取分离
2.2.1 样品来源
银杏根细胞悬浮培养物及愈伤组织培养物收获后，分别干燥而得.
2.2.2 提取工艺
取细胞培养物(2 g)，置沙氏提取器中，用70%乙醇提取至无色，弃去残渣.提取液(褐色)抽滤，充去沉淀.滤液浓缩至小体积，与聚酰胺粉混匀，蒸干，装柱，行聚酰胺柱(1 g)层析.首先用蒸馏水洗至无色，再用70%乙醇洗脱.醇洗液减压回收乙醇，残渣真空干燥，甲醇溶解，过滤，定容至10 mL，即得HPLC分析用样品.
2.3 银杏根细胞培养物中黄酮类化合物HPLC含量测定〔5，6〕
2.3.1 色谱条件
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色谱柱：lnertsil ODS column,4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：甲醇-水-乙醇(V∶V∶V=45∶46∶9，57∶39∶4)；流速：1.0 mL/min；灵敏度：0.5×10-4；保留值：30 min、18 min；进样量：10 μL、5 μL.
2.3.2 标准曲线制备
准确称取芦丁和槲皮素标准品各2 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，各进样4、8、12、16、20 μL.
用芦丁峰面积(A)对进样量(C g/L)进行线性回归，得回归方程：A=1.240×10-7 C-0.884，r=0.998；用槲皮素峰面积(A)对进样量(C g/L)进行线形回归，得回归方程：A=1.581×10-7 C+1.520,r=0.999.
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2.3.3 样品测定
将样品供试液分别进样，记录色谱峰，测定芦丁峰面积，与标准品的峰面积相比较，计算芦丁和槲皮素、山奈酚的含量.
3 结果与讨论
3.1 不同外植体愈伤组织培养物光照与暗培养条件下黄酮类化合物含量比较(见表1)
Tab.1 The content of flavonoids in callus of G.biloba under light compared with the dark(%×10-3) Constituents
Stem
Leaves
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Root
Petiole
Embryo
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
Light
Dark
, http://www.100md.com
Rutin
7.40
0.86
2.80
1.40
0.80
0.76
-
-
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-
Quercetin
1.70
, http://www.100md.com
5.50
2.00
3.00
6.30
3.60
-
-
-
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Kampferol
-
-
-
, 百拇医药 -
-
-
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-
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3.2 银杏根细胞由光照转为暗培养后黄酮含量的变化
根细胞在N1.0K0.1MS(MS+NAA1.0 mg/L+0.1 mg/L KT，即对照培养基，下同)培养基上，由光照转为暗培养后黄酮含量变化的研究结果表明，根细胞由光照转为暗培养，第一代培养物中检出芦丁(0.21%×10-3)和槲皮素(3.73%×10-3)，且以槲皮素含量为高；第二、三代培养物中芦丁含量逐渐增加，分别达0.24%×10-3和0.36%×10-3，槲皮素含量渐次降低，至第三代则检测不到该成分，说明由光照转为暗培养后，随着培养代数的增加，槲皮素的苷化现象(产物为芦丁)更为明显.此外，各代愈伤组织均未测出山奈酚.
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3.3 2，4-D对银杏根愈伤组织中黄酮含量的影响(培养20天)
由表2可知，培养时间为20天时，对照组愈伤组织中芦丁含量最高，随2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)浓度的增加，芦丁含量下降，至2 mg/L时降至最低，尔后又开始增加；槲皮素的含量变化情况与之相反.由实验可见，培养时间为20天时，2，4-D的存在抑制山奈酚的合成.Tab.2 The effect of 2,4-D on the content(%×10-3)of flavonoids in the callus(cultured 20d)of G.biloba 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, http://www.100md.com Kaempferol
Control
0.92
0.23
0.38
1
0.35
0.25
-
2
0.31
0.33
-
, 百拇医药
4
0.37
0.29
-
8
0.43
0.17
-
12
0.66
0.10
-
3.4 银杏根愈伤组织培养30天时不同2，4-D浓度对黄酮含量的影响
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由表3可见，愈伤组织培养30天时，芦丁和槲皮素的最高含量均出现在2，4-D浓度为6 mg/L时，尤以后者含量为最高，达5.0%×10-3；另外，由该实验还可看出，不同的植物生物调节剂浓度、不同的培养时间对不同类型黄酮类化合物的产量均有不同程度影响.
Tab.3 The effect of concentration of 2,4-D on the content(%×10-3)of
flavonoids in the callus(cultured 30d) of G.biloba 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, 百拇医药
Kaempferol
1
0.37
0.13
-
2
0.32
-
-
6
0.83
5.0
-
, 百拇医药 8
0.66
0.10
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3.5 不同浓度KT对黄酮含量的影响
由表4可知，当KT浓度为3.0 mg/L时，芦丁和槲皮素的含量均达到最大值.但均未测得山奈酚的存在. Tab.4 The effect of concentration of KT on the content(%×10-3)of flavonoids KT/mg.L-1
Rutin
Quercetin
, http://www.100md.com
Kaempferol
0
0.22
-
-
0.1
0.18
0.10
-
0.5
0.15
0.20
-
, 百拇医药
1.0
0.20
-
-
3.0
0.89
0.23
-
5.0
0.20
-
-
7.0
, 百拇医药 0.60
0.14
-
12.0
0.11
0.06
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3.6 2，4-D+KT对黄酮含量的影响
MS培养基上附加KT(5 mg/L)时不同浓度2，4-D对黄酮含量的影响结果见表5.KT附加不同浓度的2，4-D时，芦丁含量随其浓度的增加而提高；此外，在2，4-D浓度为10 mg/L时尚检测出了山奈酚.Tab.5 The influence of 2，4-D+KT on the content (%×10-3)of flavonoids 2，4-D/mg.L-1
, http://www.100md.com
Rutin
Quercetin
Kaempferol
6
0.38
-
-
7
0.83
5.50
-
10
1.50
, 百拇医药
-
0.33
3.7 pH值对银杏培养物中黄酮含量的影响
一般来说，最有利于培养细胞生长的pH值为5～6.本实验结果(表6)表明在pH 4.5～6.4之间，细胞培养物中均可测得芦丁，且以pH 5.4时含量最高(0.88%×10-3)，而且在此pH值时尚测得槲皮素的存在.Tab.6 The effect of pH on the content (%×10-3)of flavonoids pH
Rutin
Quercetin
Kaempferol
4.5
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0.12
-
-
5.0
0.25
-
-
5.4
0.88
0.32
-
5.7
0.16
, http://www.100md.com -
-
6.0
0.25
-
-
6.4
0.39
-
-
3.8 淀粉对银杏培养物中黄酮类成分的影响
淀粉作为植物细胞培养中常用碳源之一，有时对代谢产物的产生和含量会产生一定的影响，但在本实验中，由于已有足量蔗糖作为碳源，故淀粉的加入非但未能提高次级代谢产物的产量，相反，却抑制了黄酮类化合物的产生，这可能是淀粉的加入改变了培养液的渗透压，从而对代谢产物的生合成途径产生影响的缘故.
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3.9 2，4-D对银杏液体培养物中黄酮类成分含量的影响
由表7可知，在银杏细胞悬浮培养中，加入4 mg/L的2，4-D对山奈酚的产生有利；加入10 mg/L的2，4-D时，槲皮素和芦丁的含量均有大幅度的提高；但山奈酚的含量随2，4-D浓度的增加而减少.
Tab.7 The effect of 2，4-D on the content(%×10-3) of flavonoids in the cell suspension cultures 2，4-D/mg.L-1
Rutin
Quercetin
Kaempferol
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4
0.86
4.60
0.92
7
0.26
25.00
0.57
10
2.30
47.25
0.28
致谢 本校中成药分析教研室陈发奎教授、天然药化研究室裴月湖教授协助完成HPLC测定，谨致谢忱.
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参考文献
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2 史清文，刘素云，张文素，等.银杏叶的研究开发概况.天然产物研究与开发，1995，7(1)：71
3 于荣敏，赵鸿莲，郑玉果，等.银杏愈伤组织培养及其代谢产物银杏内酯的研究.生物工程学报，1999，15：(1)：59～65
4 于荣敏，赵鸿莲，姚新生，等.银杏悬浮细胞培养及其次生代谢产物银杏内酯的研究.生物工程学报，1999，15(2)：84～88
5 谢大年.银杏叶提取物中黄酮类成分的高效液相色谱分析.色谱，1984，12(5)：384
6 姚渭溪.银杏叶中活性成分的提取工艺、测定及其进展.中草药，1995，24(3)：157～159
收稿日期:1998-06-29, 百拇医药