过氧基异丙苯对细胞生长状态的影响
作者：杨瑞华 李瑞珍 海春旭
单位：第四军医大学军队卫生学教研室 (西安 710032)
关键词：
卫生毒理学杂志990216 正常生物体内的自由基产生和清除是处于平衡状态的，另一方面，外界环境中存在着多种形式的自由基，其性质活泼，易与体内多种物质发生化学反应，与内源性自由基一起影响着细胞的生长、分化及死亡过程。细胞生物学研究表明，肿瘤的各个发展阶段及其治疗等多方面都与自由基反应密切相关[1，2]。研究自由基与细胞生长状态的剂量-反应关系具有重要的意义。
过氧基异丙FDA3(cumene hydroperoxide, CHP)可与低浓度铁离子(80μmol/L以下)等金属元素构成脂质过氧化的激发对，可用来作为有机物激发自由基反应链的模型，进行过氧化剂的研究。我们报告了CHP对CEM白血病细胞生长状态及其生化机制的体外研究。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞培养及处理方法
选用CEM白血病细胞，RPMI 1640培养液，含10%小牛血清，37℃ 5%CO2孵箱培养，取对数生长期细胞离心，洗涤，以相同细胞数2×105接种于各培养皿中，低温培养法[3]取得同步化细胞，即分装的细胞37℃培养1小时后，立刻放入4℃冰箱中使细胞同时进入G1期，停止DNA继续合成，4小时后取出，分别加入CHP 1.5，5.0，10.0，20.0，40.0mmol/L(下文称为CHP-1至CHP-5组)；同时设空白对照组，5% CO2,37℃培养，72小时后收集细胞。
二、细胞计数[4]和活细胞计数[5] 细胞周期，DNA含量及凋亡状态测定(流式细胞技术[5])。
, 百拇医药
三、生化指标测定
1×106/ml细胞悬液超声粉碎1分，制备细胞粉碎液，进行下列生化指标测定。
1.总巯基(T-SH)和非蛋白巯基(NP-SH),DTNB显色法[6]；超氧化物歧化酶活性测定，NBT羟胺法[7]；过氧化氢酶活性测定，钼酸铵法[8]；丙二醛(MDA)含量测定，八木国夫荧光法[9]；细胞蛋白质含量测定，考马斯亮蓝法[10]。
结 果
一、细胞计数及台盼蓝染色结果(见表1)。
表1 CHP各剂量组细胞(×105)及活细胞率(%)(
±s)
, 百拇医药
对照
CHP-1
CHP-2
CHP-3
CHP-4
CHP-5
细胞总数
2.90±0.04
7.02±0.04**
2.63±0.24
2.75±0.21
2.64±0.31
, 百拇医药
2.08±0.06**
活细胞率
87.96
70.89
75.45
68.28
66.32
56.56
*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比，1组细胞生长迅速，2，3，4组细胞数与对照组差异无明显性，但活细胞率降低，5组细胞则比对照组减少，活细胞率也很低。
二、细胞周期，DNA含量及凋亡状态测定
, http://www.100md.com
从表2可以看出，CHP-1组细胞DNA合成旺盛，S期细胞比例增加，CHP-2组细胞增殖也较旺盛，同时出现了凋亡峰，CHP-3组凋亡增强，CHP各组均有S期细胞的增加，随剂量增大，凋亡增强，且G2/G1值较低，说明细胞同步化被破坏，CHP-5组细胞则出现了大量的细胞碎片。
表2 CHP各剂量组细胞在细胞周期中的分布情况
G1
G2
S
G2/G1
细胞凋亡
对照组
52.1
, http://www.100md.com 30.8
17.2
1.939
-
CHP-1
37.6
15.3
47.1
1.800
-
CHP-2
52.6
12.2
, http://www.100md.com
35.2
1.797
17.2
CHP-3
56.7
9.9
33.4
1.800
21.8
CHP-4
46.7
25.0
28.3
, 百拇医药
1.786
16.8
三、生化指标测定结果
各组细胞SOD和MDA含量与对照组相比显著增高，蛋白含量在较高剂量时增高，T-SH和NP-SH均低于对照组，CAT在2组和4组略有升高(表3)。
表3 CHP各剂量组生化指标测定结果(±s) 指标
CHP-1
CHP-2
CHP-3
CHP-4
, 百拇医药
CHP-5
对照
SOD(U)
0.67±0.03**
0.57±0.12**
0.52±0.09**
0.65±0.07**
0.74±0.02**
0.17±0.02
CAT(ng)
48.55±0.19*
, http://www.100md.com
49.77±0.56*
49.13±0.38
49.56±0.46*
48.88±0.22
48.31±0.16
MDA(nmol)
121.32±7.10**
118.59±5.59**
143.64±5.26**
142.93±6.47**
, http://www.100md.com
147.90±0.87**
86.90±1.05
Pro(μg)
7.53±0.32*
8.12±0.14
8.29±0.03*
8.38±0.01**
8.40±0.01**
7.75±0.06
T-SH(μg)
, 百拇医药 123.27±2.87**
152.48±6.57**
114.21±1.53**
135.36±4.97**
144.45±5.39**
181.94±5.41
NP-SH(μg)
99.67±2.35**
105.06±1.96**
, 百拇医药
118.41±1.33**
113.70±6.28**
123.63±1.65**
159.54±4.29
*P<0.05 **P<0.01
讨 论
一、CHP作用与细胞生长状态的剂量-反应关系
本实验表明：1.低浓度CHP(1.5mol/L)作用可刺激细胞增殖，培养72小时后，CHP-1组细胞数明显高于对照组；流式细胞仪测定发现CHP低剂量组DNA合成旺盛，S期细胞比例增加，G2/G1值为1.800，说明细胞同步化较差。2.适量CHP可诱导细胞凋亡：CHP各组随剂量增大，凋亡增强，CHP-3组的活细胞率降低，细胞碎片增加，说明在较大剂量时已有细胞毒性的表现。3.大剂量CHP对细胞具有毒性作用：随CHP剂量增大，凋亡逐渐增强，并表现出细胞毒性作用，当浓度达到40.0mmol/L时，细胞数已明显少于对照组。
, 百拇医药
二、自由基影响细胞生长状态的生化机制
反映自由基对膜损伤作用的脂质过氧化产物MDA随CHP剂量增高而增高，说明过氧化物攻击细胞脂质从而使膜结构遭到破坏，通透性增强可能是活性氧细胞毒性作用的机制之一。SOD是正常组织细胞内重要的清除自由基的酶，也是一种可诱导酶，在过氧化物刺激时，SOD水平升高清除超氧阴离子自由基，是细胞的一种保护性反应；实验各组SOD随剂量而增高，T-SH和NP-SH含量降低，说明CHP作用破坏了巯基酶的活性，使细胞内还原性巯基减少。
以上实验结果初步说明，CHP对细胞生长状态的影响存在一定的剂量-反应关系。在一定剂量范围内，CHP作用于细胞只是引起细胞损伤，使这些细胞获得了激活内在程序性自杀机制的能力，最终导致细胞凋亡，较高剂量的自由基作用可引起细胞坏死。
参考文献
1.Oberley LW, Oberley TD. free radicals, cancer, and aging In:Johnson Jr JE, Walford R, Harmon D et al. free radicals, aging and degenerative diseases New York:Alan R Liss, 1986,325～371.
, 百拇医药
2.Trevoe F Slater. Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochem J.1984,222(1):1～15.
3.杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990，118～119；388.
4.鄂 征.主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1982，112～113.
5.鄂征.主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994，158.
6.Frank C Ayers, Garvin L Warner, Anal Biochem, 1986,154:186～193.
7.王成莲.羟胺法超氧化物歧化酶的测定.生物化学与生物物理学报，1989；16(6)：473～475.
8.董泗建，刘昌霖，孙曼霁.一种测定过氧化氢酶的新方法.军事医学科学院院刊，1995，19(2)：130～132.
9.Yagi K. Clinical Pathology (in Japanese), 1981,29:221～224.
10.司徒镇强，吴军正主编.细胞培养基本技术.第四军医大学口腔医学院，1994；92.
(修回日期 1998年9月), http://www.100md.com
单位：第四军医大学军队卫生学教研室 (西安 710032)
关键词：
卫生毒理学杂志990216 正常生物体内的自由基产生和清除是处于平衡状态的，另一方面，外界环境中存在着多种形式的自由基，其性质活泼，易与体内多种物质发生化学反应，与内源性自由基一起影响着细胞的生长、分化及死亡过程。细胞生物学研究表明，肿瘤的各个发展阶段及其治疗等多方面都与自由基反应密切相关[1，2]。研究自由基与细胞生长状态的剂量-反应关系具有重要的意义。
过氧基异丙FDA3(cumene hydroperoxide, CHP)可与低浓度铁离子(80μmol/L以下)等金属元素构成脂质过氧化的激发对，可用来作为有机物激发自由基反应链的模型，进行过氧化剂的研究。我们报告了CHP对CEM白血病细胞生长状态及其生化机制的体外研究。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞培养及处理方法
选用CEM白血病细胞，RPMI 1640培养液，含10%小牛血清，37℃ 5%CO2孵箱培养，取对数生长期细胞离心，洗涤，以相同细胞数2×105接种于各培养皿中，低温培养法[3]取得同步化细胞，即分装的细胞37℃培养1小时后，立刻放入4℃冰箱中使细胞同时进入G1期，停止DNA继续合成，4小时后取出，分别加入CHP 1.5，5.0，10.0，20.0，40.0mmol/L(下文称为CHP-1至CHP-5组)；同时设空白对照组，5% CO2,37℃培养，72小时后收集细胞。
二、细胞计数[4]和活细胞计数[5] 细胞周期，DNA含量及凋亡状态测定(流式细胞技术[5])。
, 百拇医药
三、生化指标测定
1×106/ml细胞悬液超声粉碎1分，制备细胞粉碎液，进行下列生化指标测定。
1.总巯基(T-SH)和非蛋白巯基(NP-SH),DTNB显色法[6]；超氧化物歧化酶活性测定，NBT羟胺法[7]；过氧化氢酶活性测定，钼酸铵法[8]；丙二醛(MDA)含量测定，八木国夫荧光法[9]；细胞蛋白质含量测定，考马斯亮蓝法[10]。
结 果
一、细胞计数及台盼蓝染色结果(见表1)。
表1 CHP各剂量组细胞(×105)及活细胞率(%)(
±s), 百拇医药
对照
CHP-1
CHP-2
CHP-3
CHP-4
CHP-5
细胞总数
2.90±0.04
7.02±0.04**
2.63±0.24
2.75±0.21
2.64±0.31
, 百拇医药
2.08±0.06**
活细胞率
87.96
70.89
75.45
68.28
66.32
56.56
*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比，1组细胞生长迅速，2，3，4组细胞数与对照组差异无明显性，但活细胞率降低，5组细胞则比对照组减少，活细胞率也很低。
二、细胞周期，DNA含量及凋亡状态测定
, http://www.100md.com
从表2可以看出，CHP-1组细胞DNA合成旺盛，S期细胞比例增加，CHP-2组细胞增殖也较旺盛，同时出现了凋亡峰，CHP-3组凋亡增强，CHP各组均有S期细胞的增加，随剂量增大，凋亡增强，且G2/G1值较低，说明细胞同步化被破坏，CHP-5组细胞则出现了大量的细胞碎片。
表2 CHP各剂量组细胞在细胞周期中的分布情况
G1
G2
S
G2/G1
细胞凋亡
对照组
52.1
, http://www.100md.com 30.8
17.2
1.939
-
CHP-1
37.6
15.3
47.1
1.800
-
CHP-2
52.6
12.2
, http://www.100md.com
35.2
1.797
17.2
CHP-3
56.7
9.9
33.4
1.800
21.8
CHP-4
46.7
25.0
28.3
, 百拇医药
1.786
16.8
三、生化指标测定结果
各组细胞SOD和MDA含量与对照组相比显著增高，蛋白含量在较高剂量时增高，T-SH和NP-SH均低于对照组，CAT在2组和4组略有升高(表3)。
表3 CHP各剂量组生化指标测定结果(
±s) 指标CHP-1
CHP-2
CHP-3
CHP-4
, 百拇医药
CHP-5
对照
SOD(U)
0.67±0.03**
0.57±0.12**
0.52±0.09**
0.65±0.07**
0.74±0.02**
0.17±0.02
CAT(ng)
48.55±0.19*
, http://www.100md.com
49.77±0.56*
49.13±0.38
49.56±0.46*
48.88±0.22
48.31±0.16
MDA(nmol)
121.32±7.10**
118.59±5.59**
143.64±5.26**
142.93±6.47**
, http://www.100md.com
147.90±0.87**
86.90±1.05
Pro(μg)
7.53±0.32*
8.12±0.14
8.29±0.03*
8.38±0.01**
8.40±0.01**
7.75±0.06
T-SH(μg)
, 百拇医药 123.27±2.87**
152.48±6.57**
114.21±1.53**
135.36±4.97**
144.45±5.39**
181.94±5.41
NP-SH(μg)
99.67±2.35**
105.06±1.96**
, 百拇医药
118.41±1.33**
113.70±6.28**
123.63±1.65**
159.54±4.29
*P<0.05 **P<0.01
讨 论
一、CHP作用与细胞生长状态的剂量-反应关系
本实验表明：1.低浓度CHP(1.5mol/L)作用可刺激细胞增殖，培养72小时后，CHP-1组细胞数明显高于对照组；流式细胞仪测定发现CHP低剂量组DNA合成旺盛，S期细胞比例增加，G2/G1值为1.800，说明细胞同步化较差。2.适量CHP可诱导细胞凋亡：CHP各组随剂量增大，凋亡增强，CHP-3组的活细胞率降低，细胞碎片增加，说明在较大剂量时已有细胞毒性的表现。3.大剂量CHP对细胞具有毒性作用：随CHP剂量增大，凋亡逐渐增强，并表现出细胞毒性作用，当浓度达到40.0mmol/L时，细胞数已明显少于对照组。
, 百拇医药
二、自由基影响细胞生长状态的生化机制
反映自由基对膜损伤作用的脂质过氧化产物MDA随CHP剂量增高而增高，说明过氧化物攻击细胞脂质从而使膜结构遭到破坏，通透性增强可能是活性氧细胞毒性作用的机制之一。SOD是正常组织细胞内重要的清除自由基的酶，也是一种可诱导酶，在过氧化物刺激时，SOD水平升高清除超氧阴离子自由基，是细胞的一种保护性反应；实验各组SOD随剂量而增高，T-SH和NP-SH含量降低，说明CHP作用破坏了巯基酶的活性，使细胞内还原性巯基减少。
以上实验结果初步说明，CHP对细胞生长状态的影响存在一定的剂量-反应关系。在一定剂量范围内，CHP作用于细胞只是引起细胞损伤，使这些细胞获得了激活内在程序性自杀机制的能力，最终导致细胞凋亡，较高剂量的自由基作用可引起细胞坏死。
参考文献
1.Oberley LW, Oberley TD. free radicals, cancer, and aging In:Johnson Jr JE, Walford R, Harmon D et al. free radicals, aging and degenerative diseases New York:Alan R Liss, 1986,325～371.
, 百拇医药
2.Trevoe F Slater. Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochem J.1984,222(1):1～15.
3.杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990，118～119；388.
4.鄂 征.主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1982，112～113.
5.鄂征.主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994，158.
6.Frank C Ayers, Garvin L Warner, Anal Biochem, 1986,154:186～193.
7.王成莲.羟胺法超氧化物歧化酶的测定.生物化学与生物物理学报，1989；16(6)：473～475.
8.董泗建，刘昌霖，孙曼霁.一种测定过氧化氢酶的新方法.军事医学科学院院刊，1995，19(2)：130～132.
9.Yagi K. Clinical Pathology (in Japanese), 1981,29:221～224.
10.司徒镇强，吴军正主编.细胞培养基本技术.第四军医大学口腔医学院，1994；92.
(修回日期 1998年9月), http://www.100md.com