微波对大鼠脑突触小体膜的钙外排率影响
作者：徐洋 赵宗群 张孙曦
单位：徐 洋 赵宗群 (北京医科大学劳动卫生教研室 100083)； 张孙曦 (北京医科大学生物物理教研室)
关键词：
卫生毒理学杂志990210 微波是指频率范围在300MHz～300GHz的电磁波。某些研究显示低功率微波及超短波可对生物体的钙信使体系产生影响并可呈现频率窗和功率窗效应[1～3]。本研究采用体外实验，用微波调制和非调制场，不同功率密度，不同照射时间照射大鼠脑突触小体膜(spm)，观察spm钙跨膜外排率的改变、Ca2+-Mg2+-ATPase活性、膜脂流动性以及腺苷酸环化酶(AC)活性。以便探讨微波对spm钙跨膜外排产生的影响及其途径，并且说明所产生的效应与微波功率密度，调制频率，照射时间的关系。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、主要试剂
聚蔗糖，Sigma产品。考马斯亮蓝G250上海化学制剂采购供应站。
氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)碳酸氢钠(NaHCO3)，分析纯，均为上海化学试剂采购供应站提供。ATP(Adenosine-5-Triphasphate Disodium Salt)Sigma产品。钼酸铵，抗坏血酸，广东汕头新宁化工厂产品。三氯醋酸，余山化工厂产品。柠檬酸三钠，东中试剂厂产品。45CaCl2购于美国杜邦公司。PPO(2，5-Diphenyl-oxazol)，购于华美生化工程公司。DPH(1，6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien)，Sigma产品。cAMP试剂盒，中国科学院原子能所产品。主要试剂I.B液(0.32mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris,pH 7.4)。低渗液(10mmol/L Tris)。0.01%考马斯亮蓝乙醇溶液。生理盐水(135mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1.2mmol/L MgCl2,0.4mmol/L CaCl2,10mmol/L NaHCO3,10mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 蔗糖)。工作溶液(101mmol/L NaCl,3.75mmol/L KCl,0.9mmol/L MgCl2,0.2mmol/L CaCl2,10mmol/L NaHCO3,7.5mmol/L 葡萄糖，9mmol/L蔗糖配制，5μ Ci/ml CaCl2)(临用前配制)。无钙灌流溶液(135mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1.2mmol/L MgCl2,10mmol/L NaHCO3,10mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 蔗糖配制)。用电导率16～18兆欧的纯水配制。无钙灌流溶液钙离子主要来源于MgCl2中所含的杂质，但其浓度是细胞外钙浓度的10-4倍，远远低于细胞外钙浓度，故可认为是无钙溶液。
, 百拇医药
ATP缓冲体系(ATP 1mmol/L,30mmol/L Tris-HCl,0.1mmol/L Tris-EDTA,6mmol/L MgCl2,0.3mmol/L CaCl2,用10mmol/L Tris-HCl加至1L)
反应体系(10mmol/L 茶碱，8mmol/L MgSO4,0.6mmol/L EDTA,0.02%抗坏血酸，80mmol/L Tris-HCl,pH=7.4)
二、实验动物
Wistar成年雄性大鼠180～220g，由北京医科大学实验动物部提供。
三、主要仪器设备
XG26型超高频功率信号发生器(275MHz～2750MHz)。XD1信号发生器。横向电磁波小室(TEM Cell) (DC-500MHz)。DCHY 801型近区电磁场监测仪，北京电子管厂监制，实验前经过中国计量科学研究院标准场校正。恒温灌流装置，及灌流液收集器，均为本校仪器厂制作。注射器微动推进器。
, 百拇医药
四、spm制备及各指标测定方法
1.spm制备参考Rendon法[4]：采用聚蔗糖密度梯度超速离心方法。spm制备用6只成年雄性Wistar(180～220g)大鼠脑于4℃ IB液中匀浆1 100g离心10分，取上清17000g离心20分，取沉淀加低渗液20ml 17000g离心20分，2次，取沉淀置于(下层为13%上层为7.5%FiCOll-400)离心管最上层100000g离心后，从7.5%和13%界面间取出spm加低渗液20ml 30000g离心10分共3次，得纯净spm于-20℃保存，采用考马斯亮蓝法测定spm悬浊液的蛋白含量，用电镜观察spm纯度。
2.45Ca外排测定：参考Lin-Liu方法[3]，根据实验条件加以改进，方法如下：取0.5ml spm混悬液加0.25ml生理盐水置于室温5分，加0.25ml 45CaCl2 (5μCi/ml)室温放置15分，然后将孵育液全部装入过滤器滤膜上(滤膜事先用无钙灌流液2ml冲洗过)，用无钙灌流液4℃,9ml冲洗过滤器滤膜上未装载入spm的45CaCl2，将冲洗后载有spm的过滤器迅速装在连有微波发生器的恒温灌流系统上进行微波照射，照射结束的同时，开始以1ml/min速度在(31±0.5)℃恒温下，用无钙灌流液灌流15分，每分钟收集1管，然后取200μl于闪烁杯中加16ml闪烁液，用液闪法测定3分，得出钙外排时间变化曲线(详见北京医科大学学报1998；3：288)。
, 百拇医药
3.Ca2+-Mg2+-ATPase活性的测定：采用Reinila方法。取0.5ml spm混悬液((100±10)μg/ml)室温下放置15分，然后分别暴露于微波450MHz(F1 0.75mW/cm2+16Hz调制频率15分和F4 5分；F2 0.75mW/cm2未调制场15分；F3 0.1mW/cm2+16Hz调制频率15分)。同时以未受微波照射的为对照。对照射后的spm进行酶活性测定，步骤如下：spm加入400μl缓冲体系中(含1mmol/L ATP)，以不加spm为空白对照，反应以加入ATP后开始准确记时，37℃水浴15分取出置冰浴中，迅速加0.4ml 15%三氯醋酸，5 000r/min离心4分，取200μl上清液加钼磷比色显色剂4ml,37℃显色反应30分，后加入0.2ml 25%柠檬酸三钠终止反应。820nm比色得A值，根据A值查标准曲线得磷含量。通过酶促水解ATP生成磷的含量来说明酶的活性，用nmol(磷含量)/mg(蛋白).min-1表示酶活性单位。膜脂流动性的测定，参照林克椿法进行。取2ml spm混悬液[(100±10)μg/ml]放置室温15分复温，然后分别暴露微波450MHz,F1;F2;F3;F4同时以未受微波照射的为对照。膜脂流动性测定参照林克椿方法进行，spm加上等体积2ml DPH探剂37℃温育30分，然后测定荧光偏振度ρ值。腺苷酸环化酶(AC)活性的测定将约1ml spm混悬液((100±10)μg/ml)置于不同强度不同照射时间的微波场下照射，然后将spm加入反应体系(按10ml/L茶碱，8mmol/L MgSO4,0.6mmol/L EDTA,0.02%抗坏血酸，80mmol/L Tris-HCl pH=7.4配制)中，反应以加入100ml 2mmol/L ATP和50μmol/L GTP开始，35℃温育10分，置沸水中3分终止反应，10 000r/min离心10分，取上清液备用。取出适量上清液按照蛋白结合法测定cAMP含量(AC活性)。通过酶促反应生成的cAMP多少来反映spm上AC的活性，以cAMP的nmol.mg-1/min为单位。统计方法采用Possion分布和t检验。
, http://www.100md.com
结 果
一、微波对spm钙外排率的影响
用不同强度微波照射spm 15分，测定spm钙外排率，结果见表1、2。
表1 不同照射条件下spm钙外排率(%)
n
照射后时间(min)
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
C
11
49.90
72.17
85.58
89.68
91.96
92.49
92.68
93.01
, http://www.100md.com
90.89
F1
5
76.04*
87.82
92.47
94.08
94.58
95.15
95.75
95.85
94.14
F2
, 百拇医药
6
67.65
80.01
87.12
89.18
88.75
90.49
90.79
88.90
89.88
F3
5
57.89
, http://www.100md.com
74.02
83.42
85.38
89.26
88.30
90.78
90.95
90.61
F4
5
57.66
81.92
87.76
, 百拇医药
91.02
91.58
91.58
92.60
92.94
92.55
C=对照
F1=0.75mW/cm2 16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射15min
F2=0.75mW/cm2 非调制频率的微波场(450MHz)照射15min
F3=0.1mW/cm2 16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射15min
, http://www.100md.com
F4=0.75mW/cm2 16Hz,调制频率的微波场(450MHz)照射5min
*P<0.05(与对照比较，Possion分布Z=2,3>1.96)
表2 不同照射条件下spm钙外排率的改变率
照射后时间(min)
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
F1-C
26.14
15.65
6.89
4.40
2.62
2.66
3.07
2.84
3.25
, 百拇医药
F2-C
17.75
7.84
1.54
-0.50
-3.21
-2.00
-1.89
-4.11
-1.01
F3-C
7.99
1.85
, 百拇医药
-2.16
-4.30
-2.70
-4.19
-1.90
-2.06
-0.28
F4-C
7.76
9.75
2.18
1.34
-0.38
, 百拇医药
-0.91
-0.08
-0.07
1.66
改变率=(照射-对照)的钙外排率
由表1、2可见0.75mW/cm2加16Hz调制微波(450MHz)照射spm 15分，其钙外排率与对照组比较，早期明显增加。而照射5分，其钙外排率与对照组比较未显示出明显改变。0.75mW/cm2非调制微波(450MHz)照射spm15分以及用0.1mW/cm2 16Hz调制频率的微波(450MHz)照射spm 15分其钙外排率与对照组比较未显示出明显改变。
二、微波对spm Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响
, 百拇医药
不同照射强度微波(450MHz)照射spm 15分或5分，测定spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性，结果如表3
表3 不同照射条件下spm Ca2+-Mg2+-ATPase活性(
±s)
n
Ca2+-Mg2+-ATPase活性
(nmol.mg-1/min)
增高
, 百拇医药 (%)
P值
对照
照射
F1
5
162.53±14.24
182.35±15.22
12.46
<0.05
F2
5
162.53±15.22
, 百拇医药
179.18±11.75
10.24
<0.05
F3
6
172.38±16.63
197.53±48.00
14.59
>0.05
F4
5
162.53±14.24
, 百拇医药
162.16±9.64
0
>0.05
由表3可见，0.75mW/cm2无论调制与非调制微波场(450MHz)照射15分均能使spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性分别增加12.46%和10.14%(P<0.05)，而调制场照射5分未显示出spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性增加。0.1mW/cm2加16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射spm 15分，其Ca2+-Mg2+-ATPase活性统计检验未显示出改变。
三、微波对spm膜脂流动性的影响
用不同微波(450MHz)强度照射spm 15分或5分，测定spm的膜脂流动性，结果F1、F2、F3、F4照射条件下(同表1～3注解)均未使spm的膜脂流动性发生改变。
, 百拇医药
四、微波对spm腺苷酸环化酶(AC)活性的影响
分别用0.75mW/cm2 16Hz调制频率和非调制频率微波(450MHz)及0.1mW/cm2加16Hz调制频率的微波(450MHz)照射spm 15分，测定spm的AC活性，结果见表4表4 不同照射强度下spm的AC活性(±s)
n
Ca2+-Mg2+-ATPase活性
(nmol.mg-1/min)
增高
, http://www.100md.com
(%)
P值
对照
照射
F1
6
27.03±10.35
35.35±11.75
30.78
>0.05
F2
7
27.03±10.35
, 百拇医药
42.38±9.89
56.78
<0.05
F3
6
27.03±10.35
19.63±9.61
-27.00
>0.05
结果表明照射强度为0.75mW/cm2的非调制微波(450MHz)照射spm使spm内AC活性增高56.78%(P<0.05)。
讨论
, 百拇医药
本研究参考Lin-Liu的实验条件，观察了调制(16Hz)及非调制微波场(450MHz)不同强度、不同时间所致的钙外排效应，其温度控制在(31±0.5)℃，观察到0.75mW/cm2，调制频率16Hz及照射15分时钙外排率增加，照射5分时无改变。此结果显示出一定的时间内，存在剂量-效应关系。相同强度及照射时间相同时，非调制的连续波及0.1mW/cm2调制频率16Hz时钙外排率与对照组比较无甚改变。
突触小体钙外排依据3个基本机制即膜键合钙的解离以及通过Ca-Ca和Na-Ca交换致细胞内钙外排。据Lin-Liu提示Na-Ca交换是快反应，它可能发生在灌流前几分钟，本实验的前几分钟内可能是经Na-Ca交换机制。通过用无钙灌流液减少了Ca-Ca交换过程，黄秀兰指出[8]，在无钙介质中，spm的Na-Ca双向交换机制可能转变为单向交换。采用无钙灌流技术，当开始无钙灌流后，spm外Ca2+浓度很低，spm内外原有的Ca2+浓度梯度发生变化；又由于无钙灌流液中含有[Na+]=145mmol/L为Na+-K+-ATPase维持的膜Na+梯度化学计量关系3 Na+:1 Ca2+提供了可能条件；从而导致Na/Ca双向交换变为单向交换，摄Na+排Ca+。因此在无钙灌流开始后，45Ca2+跨膜外排可能主要是由Na/Ca双向交换转变为单向交换引起。
, 百拇医药
16Hz微波调制场致spm钙外排增加是否是由于场引起膜表面性质改变而易释放紧密结合钙。本实验结果为膜脂流动性无改变，即钙外排增加不是由于膜键合钙的解离，由上推测，Na/Ca交换是其重要机制。
在胞内Ca2+浓度达到一定程度，钙与钙调素(CaM)结合激活钙泵(如Ca2+-Mg2+-ATPase)活性，使Ca2+逆浓度梯度排出胞外是耗能主动转运过程。
本研究发现用450MHz 0.75mW/cm2 16Hz调制频率和非调制频率的微波照射spm，其Ca2+-Mg2+-ATPase活性分别增高12.46%和10.24%，而用16Hz调制微波场(450MHz 0.75mW/cm2)照射spm 5分和用450MHz 0.1mW/cm2 16Hz调制频率微波场照射15分,则Ca2+-Mg2+-ATPase活性没有明显提高。此结果与Ca2+外排结果基本一致，说明钙泵活性增高是钙外排增加的原因之一。
, 百拇医药
AC-cAMP系统是细胞内另一个重要的信息通路，cAMP和(或)[Ca2+]可使神经递质释放，二者通过多种途径相互调节。本研究仅见450MHz 0.75mW/cm2非调制微波场照射15分，spm的AC活性增高56.78% AC活性升高导致cAMP含量增高致钙内流，Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高导致钙外排，这可能就是0.75mW/cm2非调制场照射15分后，钙外排率无改变的原因。
参考文献
1.Blackman CF,Elder JA,Weil CM,et al.Induction of calcium ion efflux from brain tissue by radio frequency radiation:Effects of modulation frequency and field strength.Radio SCi(supplement),1979，14:93～98.
, 百拇医药
2.Adey R and Bawin S.Binding and release of brain calcium by low-level electromagnetic fields:A review,Radio Sci,1982，17:149～157.
3.Lin-Liu S and Adey W R.Low frequency amplitude modulated microwave fields change calcium efflux rates from synaptosomes.Bioelectromagnetics,1982,3:309～322.
4.Rendon A, Masmoudi A.Purification of nonsynaptic and synaptic mitochondria and plasma membranes from rat brain by a rapid percoll gradient procedure.J.Neurosci.Methods,1985,14:41～51.
, 百拇医药
5.Reinila M,MacDonald E,Salem N Jr,et al.Standardized method for the determination of human erythrocyte membrane adenosine triphosphatase.Anal.Biochem,1982,124:19.
6.林克椿，聂松青，薄惠卿，等.用荧光探剂DPH研究腹水癌细胞膜脂流动性.生物化学与生物物理进展，1981，6，32～35.
7.Sano K,Noshiro O,Katsuda K,et al.Dopamine receptors and dopamines sensitive adenylate cyclase in canine caudate nucleus.Biochem.Pharmac,1979,28:3617～3628.
8.黄秀兰，薛春生.三氟拉嗪对鼠脑突触体内Ca水平和Ca2+-Mg2+-ATPase活性作用.中国药理学杂志，1996，10(3)：204～206.
(修回日期 1999年1月), 百拇医药
单位：徐 洋 赵宗群 (北京医科大学劳动卫生教研室 100083)； 张孙曦 (北京医科大学生物物理教研室)
关键词：
卫生毒理学杂志990210 微波是指频率范围在300MHz～300GHz的电磁波。某些研究显示低功率微波及超短波可对生物体的钙信使体系产生影响并可呈现频率窗和功率窗效应[1～3]。本研究采用体外实验，用微波调制和非调制场，不同功率密度，不同照射时间照射大鼠脑突触小体膜(spm)，观察spm钙跨膜外排率的改变、Ca2+-Mg2+-ATPase活性、膜脂流动性以及腺苷酸环化酶(AC)活性。以便探讨微波对spm钙跨膜外排产生的影响及其途径，并且说明所产生的效应与微波功率密度，调制频率，照射时间的关系。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、主要试剂
聚蔗糖，Sigma产品。考马斯亮蓝G250上海化学制剂采购供应站。
氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)碳酸氢钠(NaHCO3)，分析纯，均为上海化学试剂采购供应站提供。ATP(Adenosine-5-Triphasphate Disodium Salt)Sigma产品。钼酸铵，抗坏血酸，广东汕头新宁化工厂产品。三氯醋酸，余山化工厂产品。柠檬酸三钠，东中试剂厂产品。45CaCl2购于美国杜邦公司。PPO(2，5-Diphenyl-oxazol)，购于华美生化工程公司。DPH(1，6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien)，Sigma产品。cAMP试剂盒，中国科学院原子能所产品。主要试剂I.B液(0.32mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris,pH 7.4)。低渗液(10mmol/L Tris)。0.01%考马斯亮蓝乙醇溶液。生理盐水(135mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1.2mmol/L MgCl2,0.4mmol/L CaCl2,10mmol/L NaHCO3,10mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 蔗糖)。工作溶液(101mmol/L NaCl,3.75mmol/L KCl,0.9mmol/L MgCl2,0.2mmol/L CaCl2,10mmol/L NaHCO3,7.5mmol/L 葡萄糖，9mmol/L蔗糖配制，5μ Ci/ml CaCl2)(临用前配制)。无钙灌流溶液(135mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1.2mmol/L MgCl2,10mmol/L NaHCO3,10mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 蔗糖配制)。用电导率16～18兆欧的纯水配制。无钙灌流溶液钙离子主要来源于MgCl2中所含的杂质，但其浓度是细胞外钙浓度的10-4倍，远远低于细胞外钙浓度，故可认为是无钙溶液。
, 百拇医药
ATP缓冲体系(ATP 1mmol/L,30mmol/L Tris-HCl,0.1mmol/L Tris-EDTA,6mmol/L MgCl2,0.3mmol/L CaCl2,用10mmol/L Tris-HCl加至1L)
反应体系(10mmol/L 茶碱，8mmol/L MgSO4,0.6mmol/L EDTA,0.02%抗坏血酸，80mmol/L Tris-HCl,pH=7.4)
二、实验动物
Wistar成年雄性大鼠180～220g，由北京医科大学实验动物部提供。
三、主要仪器设备
XG26型超高频功率信号发生器(275MHz～2750MHz)。XD1信号发生器。横向电磁波小室(TEM Cell) (DC-500MHz)。DCHY 801型近区电磁场监测仪，北京电子管厂监制，实验前经过中国计量科学研究院标准场校正。恒温灌流装置，及灌流液收集器，均为本校仪器厂制作。注射器微动推进器。
, 百拇医药
四、spm制备及各指标测定方法
1.spm制备参考Rendon法[4]：采用聚蔗糖密度梯度超速离心方法。spm制备用6只成年雄性Wistar(180～220g)大鼠脑于4℃ IB液中匀浆1 100g离心10分，取上清17000g离心20分，取沉淀加低渗液20ml 17000g离心20分，2次，取沉淀置于(下层为13%上层为7.5%FiCOll-400)离心管最上层100000g离心后，从7.5%和13%界面间取出spm加低渗液20ml 30000g离心10分共3次，得纯净spm于-20℃保存，采用考马斯亮蓝法测定spm悬浊液的蛋白含量，用电镜观察spm纯度。
2.45Ca外排测定：参考Lin-Liu方法[3]，根据实验条件加以改进，方法如下：取0.5ml spm混悬液加0.25ml生理盐水置于室温5分，加0.25ml 45CaCl2 (5μCi/ml)室温放置15分，然后将孵育液全部装入过滤器滤膜上(滤膜事先用无钙灌流液2ml冲洗过)，用无钙灌流液4℃,9ml冲洗过滤器滤膜上未装载入spm的45CaCl2，将冲洗后载有spm的过滤器迅速装在连有微波发生器的恒温灌流系统上进行微波照射，照射结束的同时，开始以1ml/min速度在(31±0.5)℃恒温下，用无钙灌流液灌流15分，每分钟收集1管，然后取200μl于闪烁杯中加16ml闪烁液，用液闪法测定3分，得出钙外排时间变化曲线(详见北京医科大学学报1998；3：288)。
, 百拇医药
3.Ca2+-Mg2+-ATPase活性的测定：采用Reinila方法。取0.5ml spm混悬液((100±10)μg/ml)室温下放置15分，然后分别暴露于微波450MHz(F1 0.75mW/cm2+16Hz调制频率15分和F4 5分；F2 0.75mW/cm2未调制场15分；F3 0.1mW/cm2+16Hz调制频率15分)。同时以未受微波照射的为对照。对照射后的spm进行酶活性测定，步骤如下：spm加入400μl缓冲体系中(含1mmol/L ATP)，以不加spm为空白对照，反应以加入ATP后开始准确记时，37℃水浴15分取出置冰浴中，迅速加0.4ml 15%三氯醋酸，5 000r/min离心4分，取200μl上清液加钼磷比色显色剂4ml,37℃显色反应30分，后加入0.2ml 25%柠檬酸三钠终止反应。820nm比色得A值，根据A值查标准曲线得磷含量。通过酶促水解ATP生成磷的含量来说明酶的活性，用nmol(磷含量)/mg(蛋白).min-1表示酶活性单位。膜脂流动性的测定，参照林克椿法进行。取2ml spm混悬液[(100±10)μg/ml]放置室温15分复温，然后分别暴露微波450MHz,F1;F2;F3;F4同时以未受微波照射的为对照。膜脂流动性测定参照林克椿方法进行，spm加上等体积2ml DPH探剂37℃温育30分，然后测定荧光偏振度ρ值。腺苷酸环化酶(AC)活性的测定将约1ml spm混悬液((100±10)μg/ml)置于不同强度不同照射时间的微波场下照射，然后将spm加入反应体系(按10ml/L茶碱，8mmol/L MgSO4,0.6mmol/L EDTA,0.02%抗坏血酸，80mmol/L Tris-HCl pH=7.4配制)中，反应以加入100ml 2mmol/L ATP和50μmol/L GTP开始，35℃温育10分，置沸水中3分终止反应，10 000r/min离心10分，取上清液备用。取出适量上清液按照蛋白结合法测定cAMP含量(AC活性)。通过酶促反应生成的cAMP多少来反映spm上AC的活性，以cAMP的nmol.mg-1/min为单位。统计方法采用Possion分布和t检验。
, http://www.100md.com
结 果
一、微波对spm钙外排率的影响
用不同强度微波照射spm 15分，测定spm钙外排率，结果见表1、2。
表1 不同照射条件下spm钙外排率(%)
n
照射后时间(min)
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
C
11
49.90
72.17
85.58
89.68
91.96
92.49
92.68
93.01
, http://www.100md.com
90.89
F1
5
76.04*
87.82
92.47
94.08
94.58
95.15
95.75
95.85
94.14
F2
, 百拇医药
6
67.65
80.01
87.12
89.18
88.75
90.49
90.79
88.90
89.88
F3
5
57.89
, http://www.100md.com
74.02
83.42
85.38
89.26
88.30
90.78
90.95
90.61
F4
5
57.66
81.92
87.76
, 百拇医药
91.02
91.58
91.58
92.60
92.94
92.55
C=对照
F1=0.75mW/cm2 16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射15min
F2=0.75mW/cm2 非调制频率的微波场(450MHz)照射15min
F3=0.1mW/cm2 16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射15min
, http://www.100md.com
F4=0.75mW/cm2 16Hz,调制频率的微波场(450MHz)照射5min
*P<0.05(与对照比较，Possion分布Z=2,3>1.96)
表2 不同照射条件下spm钙外排率的改变率
照射后时间(min)
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
F1-C
26.14
15.65
6.89
4.40
2.62
2.66
3.07
2.84
3.25
, 百拇医药
F2-C
17.75
7.84
1.54
-0.50
-3.21
-2.00
-1.89
-4.11
-1.01
F3-C
7.99
1.85
, 百拇医药
-2.16
-4.30
-2.70
-4.19
-1.90
-2.06
-0.28
F4-C
7.76
9.75
2.18
1.34
-0.38
, 百拇医药
-0.91
-0.08
-0.07
1.66
改变率=(照射-对照)的钙外排率
由表1、2可见0.75mW/cm2加16Hz调制微波(450MHz)照射spm 15分，其钙外排率与对照组比较，早期明显增加。而照射5分，其钙外排率与对照组比较未显示出明显改变。0.75mW/cm2非调制微波(450MHz)照射spm15分以及用0.1mW/cm2 16Hz调制频率的微波(450MHz)照射spm 15分其钙外排率与对照组比较未显示出明显改变。
二、微波对spm Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响
, 百拇医药
不同照射强度微波(450MHz)照射spm 15分或5分，测定spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性，结果如表3
表3 不同照射条件下spm Ca2+-Mg2+-ATPase活性(
±s)n
Ca2+-Mg2+-ATPase活性
(nmol.mg-1/min)
增高
, 百拇医药 (%)
P值
对照
照射
F1
5
162.53±14.24
182.35±15.22
12.46
<0.05
F2
5
162.53±15.22
, 百拇医药
179.18±11.75
10.24
<0.05
F3
6
172.38±16.63
197.53±48.00
14.59
>0.05
F4
5
162.53±14.24
, 百拇医药
162.16±9.64
0
>0.05
由表3可见，0.75mW/cm2无论调制与非调制微波场(450MHz)照射15分均能使spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性分别增加12.46%和10.14%(P<0.05)，而调制场照射5分未显示出spm的Ca2+-Mg2+-ATPase活性增加。0.1mW/cm2加16Hz调制频率的微波场(450MHz)照射spm 15分，其Ca2+-Mg2+-ATPase活性统计检验未显示出改变。
三、微波对spm膜脂流动性的影响
用不同微波(450MHz)强度照射spm 15分或5分，测定spm的膜脂流动性，结果F1、F2、F3、F4照射条件下(同表1～3注解)均未使spm的膜脂流动性发生改变。
, 百拇医药
四、微波对spm腺苷酸环化酶(AC)活性的影响
分别用0.75mW/cm2 16Hz调制频率和非调制频率微波(450MHz)及0.1mW/cm2加16Hz调制频率的微波(450MHz)照射spm 15分，测定spm的AC活性，结果见表4表4 不同照射强度下spm的AC活性(
±s)n
Ca2+-Mg2+-ATPase活性
(nmol.mg-1/min)
增高
, http://www.100md.com
(%)
P值
对照
照射
F1
6
27.03±10.35
35.35±11.75
30.78
>0.05
F2
7
27.03±10.35
, 百拇医药
42.38±9.89
56.78
<0.05
F3
6
27.03±10.35
19.63±9.61
-27.00
>0.05
结果表明照射强度为0.75mW/cm2的非调制微波(450MHz)照射spm使spm内AC活性增高56.78%(P<0.05)。
讨论
, 百拇医药
本研究参考Lin-Liu的实验条件，观察了调制(16Hz)及非调制微波场(450MHz)不同强度、不同时间所致的钙外排效应，其温度控制在(31±0.5)℃，观察到0.75mW/cm2，调制频率16Hz及照射15分时钙外排率增加，照射5分时无改变。此结果显示出一定的时间内，存在剂量-效应关系。相同强度及照射时间相同时，非调制的连续波及0.1mW/cm2调制频率16Hz时钙外排率与对照组比较无甚改变。
突触小体钙外排依据3个基本机制即膜键合钙的解离以及通过Ca-Ca和Na-Ca交换致细胞内钙外排。据Lin-Liu提示Na-Ca交换是快反应，它可能发生在灌流前几分钟，本实验的前几分钟内可能是经Na-Ca交换机制。通过用无钙灌流液减少了Ca-Ca交换过程，黄秀兰指出[8]，在无钙介质中，spm的Na-Ca双向交换机制可能转变为单向交换。采用无钙灌流技术，当开始无钙灌流后，spm外Ca2+浓度很低，spm内外原有的Ca2+浓度梯度发生变化；又由于无钙灌流液中含有[Na+]=145mmol/L为Na+-K+-ATPase维持的膜Na+梯度化学计量关系3 Na+:1 Ca2+提供了可能条件；从而导致Na/Ca双向交换变为单向交换，摄Na+排Ca+。因此在无钙灌流开始后，45Ca2+跨膜外排可能主要是由Na/Ca双向交换转变为单向交换引起。
, 百拇医药
16Hz微波调制场致spm钙外排增加是否是由于场引起膜表面性质改变而易释放紧密结合钙。本实验结果为膜脂流动性无改变，即钙外排增加不是由于膜键合钙的解离，由上推测，Na/Ca交换是其重要机制。
在胞内Ca2+浓度达到一定程度，钙与钙调素(CaM)结合激活钙泵(如Ca2+-Mg2+-ATPase)活性，使Ca2+逆浓度梯度排出胞外是耗能主动转运过程。
本研究发现用450MHz 0.75mW/cm2 16Hz调制频率和非调制频率的微波照射spm，其Ca2+-Mg2+-ATPase活性分别增高12.46%和10.24%，而用16Hz调制微波场(450MHz 0.75mW/cm2)照射spm 5分和用450MHz 0.1mW/cm2 16Hz调制频率微波场照射15分,则Ca2+-Mg2+-ATPase活性没有明显提高。此结果与Ca2+外排结果基本一致，说明钙泵活性增高是钙外排增加的原因之一。
, 百拇医药
AC-cAMP系统是细胞内另一个重要的信息通路，cAMP和(或)[Ca2+]可使神经递质释放，二者通过多种途径相互调节。本研究仅见450MHz 0.75mW/cm2非调制微波场照射15分，spm的AC活性增高56.78% AC活性升高导致cAMP含量增高致钙内流，Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高导致钙外排，这可能就是0.75mW/cm2非调制场照射15分后，钙外排率无改变的原因。
参考文献
1.Blackman CF,Elder JA,Weil CM,et al.Induction of calcium ion efflux from brain tissue by radio frequency radiation:Effects of modulation frequency and field strength.Radio SCi(supplement),1979，14:93～98.
, 百拇医药
2.Adey R and Bawin S.Binding and release of brain calcium by low-level electromagnetic fields:A review,Radio Sci,1982，17:149～157.
3.Lin-Liu S and Adey W R.Low frequency amplitude modulated microwave fields change calcium efflux rates from synaptosomes.Bioelectromagnetics,1982,3:309～322.
4.Rendon A, Masmoudi A.Purification of nonsynaptic and synaptic mitochondria and plasma membranes from rat brain by a rapid percoll gradient procedure.J.Neurosci.Methods,1985,14:41～51.
, 百拇医药
5.Reinila M,MacDonald E,Salem N Jr,et al.Standardized method for the determination of human erythrocyte membrane adenosine triphosphatase.Anal.Biochem,1982,124:19.
6.林克椿，聂松青，薄惠卿，等.用荧光探剂DPH研究腹水癌细胞膜脂流动性.生物化学与生物物理进展，1981，6，32～35.
7.Sano K,Noshiro O,Katsuda K,et al.Dopamine receptors and dopamines sensitive adenylate cyclase in canine caudate nucleus.Biochem.Pharmac,1979,28:3617～3628.
8.黄秀兰，薛春生.三氟拉嗪对鼠脑突触体内Ca水平和Ca2+-Mg2+-ATPase活性作用.中国药理学杂志，1996，10(3)：204～206.
(修回日期 1999年1月), 百拇医药