螨胺磷在大鼠体内的代谢动力学研究
作者：郑波 李龙 石年 宋瑞琨
单位：郑 波 (武汉同济医科大学医学分子生物研究室 430030)； 李 龙 石 年 宋瑞琨 (同济医科大学环境医学研究所环境毒理研究室)
关键词：有机磷农药；螨胺磷；毒代动力学；高效液相色谱；生物转化
卫生毒理学杂志990207 内容摘要 运用高效液相色谱法，研究了静脉注射时，螨胺磷在大鼠体内的代谢动力学特征、组织分布及排泄途径，并初步分离了胆汁中的代谢产物。结果显示：螨胺磷在体内全身分布，并有周室富集，消除较快，在10mg/kg静脉注射呈二室模型，t1/2α为3.40min，t1/2β为59.03min，全身清除率Cl(s)0.018ml.min-1；螨胺磷主要分布于血流量大的器官及脂肪组织；螨胺磷在体内不稳定，能被肝脏代谢转化成极性更高的化合物后经由胆汁排出，该成分可在同样的色谱条件下被分离，峰保留时间4.25min；粪尿中均未检出原药。
, 百拇医药
The study of fenamithion on toxicokinetinetics in rats
Zheng Bo Li Long Shi Nian Song Ruikun
(Laboratory of Environmental Toxicology of the Institute of Environmental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Toxicokinetic characteristics thissus.Distribution and excretion of Fenamithion in Rats were studied by iv administration as well as its metabolic product was separated from choler preliminary with HPLC.The results indicated that the pesticide could be distributed through the body and cumulated in peripheral compartment relatively,but it could be eliminated rapidly.With parameters such as t1/2α valued 3.40min,t1/2β 59.03min and Cl(s) 0.018ml.min-1,Its metabolism followed two-compartment open model after administration of 10 mg/kg.It was primary distributed to blood-riched organs and fat tissues and ready to be biotransformed.The metabolic product were detected in choler,which had stronger polarity with retention time 4.25min;and no parent compound was found in both urine and faeces.
, 百拇医药
Key words:Toxicokinetics;Fenamithion;Organophosphorus pesticide
螨胺磷，又名胺甲硫磷、苯胺硫磷，化学名：O-甲基-O-(3-甲基-4-甲硫苯基)硫代磷酰胺酯[O-methyl-O-(3-methyl-4-methylthiophenyl) thiophosphoramidiots],是国内新开发的高效杀虫、杀螨有机磷农药，性能稳定，具有在低温下仍保持高效的优点，因而具有较大的开发价值。已有一些对该农药的毒理学研究报道[1，2]。我室在建立了生物样品中螨胺磷残留量的高效液相色谱测定方法的基础上，对螨胺磷经静脉途径染毒后，在大鼠体内的代谢动力学特征、分布及其排泄途径进行了研究，并试图分离出代谢产物。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：SD大鼠，雌性，体重(300±25)g，同济医科大学实验动物学部提供。
, 百拇医药
2.受试物：螨胺磷，纯度>99.7%，由华中师范大学农药研究所提供。用60%(v/v)乙醇水溶液配制浓度为6%的螨胺磷使用液。
3.试剂：甲醇，分析纯，上海振兴化工一厂产品(批号 940708)；乙腈，分析纯，武汉制药厂研究所产品(批号 920701)；乙酸乙酯，分析纯，武汉制胺厂产品(批号 920731)；石油醚(90～120)℃，分析纯，杭州炼油厂产品(批号 910104)，重蒸后使用；95%乙醇，分析纯，国产及新制双蒸水等。
4.仪器：638-50型高效液相色谱仪；紫外分光检测器，色谱柱(YWC-C18H37,10μmΦ,5mm×200mm)均为日本Hitachi公司产品；低速离心机，北京医用离心机厂；医用低温冰箱，日本SANYO公司产品。
二、方法
1.动物处理及取样：
, 百拇医药
(1)染毒及剂量：除特殊说明，均为尾静脉注入染毒，剂量10mg/kg。
(2)血样采集：动物3只，每只分别于染毒后2，3，10，15，30，45，60分时心脏采血，每次0.5ml。
(3)胆汁及尿液的收集：乌拉坦麻醉动物后，胆道插管，同时尿道插管，收集舌下静脉染毒前后的胆汁及尿液。
(4)粪便的收集：染毒后的动物饲养于代谢笼中，自由饮食，收集8小时粪便，自然风干后，-20℃保存。
(5)组织样品的采集：18只大鼠随机分配为6个时间组，分别于染毒后9，15，30，43，90分及8小时断头处死，快速取出所需脏器及组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后于-20℃保存。
(6)以上在处理动物前后均腹腔注射硫酸阿托品2mg/kg以保护动物。
, 百拇医药
2.样品制备及测定：样品的前处理及色谱测定采用本室建立的方法(生物样品中螨胺磷的HPLC测定法，待发表)：用乙腈/乙酸乙酯(1∶3)混合体系抽提样品，除血液和胆汁外，其它样品的抽提液用乙腈/石油醚萃取，以进一步去脂。然后，均于40℃水浴中，氮气吹干后，用甲醇溶解，高效液相色谱测定，色谱条件：固定相为YWG-C18H37,(5×200)mm,Φ10μm;流动相为甲醇/水(70∶30)，1ml/min;室温，进样量10μl，检测波长252nm;以保留时间定性，峰高、外标法定量。
3.结果处理及参数计算[3，4]：采用中国药理学会1987年版“3P87”药代动力学软件包对单只动物所得代谢数据进行运算，求出参数并作相应曲线拟合。部分结果以SAS软件包作相关分析及t检验。
结果与分析
一、静脉注入染毒的代谢动力学
, http://www.100md.com
3只大鼠分别经尾静脉注射受试物后，测得各时点血液中螨胺磷浓度见表1。以时间为横坐标，浓度为纵坐标作浓度-时间变化曲线，见图1。可以看出，曲线呈二室模型变化。经拟合以静脉注射二室开放模型最好，相关系数大于0.99。求得受试物在大鼠体内的代谢参数见表2。
表1 大鼠静脉染毒后各时点血液中螨胺磷的浓度(μg/ml) 时间(min)
1
2
3
±s
2.0
24.28
31.97
, 百拇医药
14.08
23.44±8.97
3.0
20.63
30.64
10.02
20.43±10.31
10.0
8.89
11.42
6.29
8.87±2.56
, 百拇医药 15.0
5.51
9.37
4.64
6.51±2.52
30.0
2.75
5.85
3.20
3.93±1.68
45.0
1.82
2.92
, http://www.100md.com
3.56
2.77±0.88
60.0
1.82
2.90
2.49
2.40±0.54
图1 大鼠静脉注射染毒后血液中螨胺磷浓度-时间曲线
表2 大鼠静注螨胺磷的毒代动力学参数 参数
单位
参数值±s
, 百拇医药
A
μg/ml
26.61±15.95
α
min-1
0.246±0.143
B
μg/ml
7.58±6.17
β
min-1
0.017±0.013
, http://www.100md.com
V(c)
ml/g
0.349±0.351
t1/2α
min
3.398±1.488
t1/2β
min
59.03±36.12
k10
min-1
, 百拇医药
0.071±0.053
k21
min-1
0.062±0.039
k12
min-1
0.129±0.074
AUC
(μg/ml)min
561.9±81.4
Cl(s)
, http://www.100md.com
ml/min
0.018±0.002
螨胺磷在大鼠体内的拟合代谢方程为：Cp=26.61e-0.246t+7.58e-0.017t。结果表明，螨胺磷在大鼠体内分布快,t1/2α不到5分，V(c)大于血容量，表明在体内呈周身分布，周室富集；螨胺磷自体内的消除亦较快，t1/2β为1个小时左右，Cl(s)达0.018ml/min。
二、静脉注射染毒后螨胺磷在组织中的动态分布
每个时点样由3只大鼠组织混合得来，实测值用螨胺磷在相应组织中的回收率加以校正[5]。各脏器组织中不同时点农药残留量如表3。由表3可见，在染毒后90分时，除了脂肪组织外，农药残留都已经很低。8小时后，螨胺磷在几乎所有被检的组织均难以被检测出了。螨胺磷在肝、脑、心等组织中消除较快，在脂肪组织中消除最慢。肺、卵巢及子宫组织在43分有一峰，表明农药在这些组织中有一定蓄积。螨胺磷在骨骼肌和平滑肌中的残留及消除过程都极其相似。由于在脂肪组织中相对高的蓄积，可以取脂肪作为代表组织用于对螨胺磷的生物监测。表3 螨胺磷在不同组织器官中的动态分布(μg/g) 时间(min)
, 百拇医药
9
15
30
43
90
8h
肝
10.16
8.65
3.38
1.80
1.14
-
, http://www.100md.com 肺
6.92
2.73
2.74
5.14
1.85
-
脑
6.94
4.52
1.81
1.19
0.60
, 百拇医药
+
肾
5.06
4.19
1.95
1.49
1.32
+
脾
3.43
2.77
0.66
-
, http://www.100md.com
-
-
心
6.65
5.63
4.08
1.81
0.89
-
贮备脂*
12.48
9.59
10.80
, 百拇医药
10.93
10.95
-
卵巢+子宫
3.00
1.33
1.64
2.46
1.43
-
骨骼肌
3.76
2.98
, 百拇医药
1.93
1.93
0.51
-
肠平滑肌
3.87
2.80
1.96
1.96
0.82
-
-:未检出 +：不能定量 *取自大网膜
三、代谢产物的分离
, 百拇医药
以相同的条件，对胆汁提取物进行色谱分析，其结果见图2。比较染毒前后的色谱图，可以看后者出现一新的色谱峰。该峰与相邻峰的分离度较高，保留时间为4.25分，比母体化合物(保留时间4.63分)更易于被极性流动相洗脱。这很可能是螨胺磷在肝脏被代谢转化后，随胆汁一起排泄的产物。其结构及详细代谢机制需要进一步研究。
图2 螨胺磷代谢产物HPLC谱图
固定相：YWG-C18，5×200mm,Φ10μm;流动相：甲醇/水(70∶30)，1ml/min,室温，进样量10μl a.染毒前胆汁样 b.静脉注射螨胺磷后3小时胆汁样 Mp—代谢产物峰 各峰保留时间：1，2.27min;2，2.95min;3,3.15min;Mp,4.25min
四、尿液与粪便提取物的色谱分析
, http://www.100md.com
尿液与粪便提取物的色谱图见图3。两者都没有螨胺磷原药组分，但在粪便有一成分与胆汁中代谢产物一致，可能来自胆汁，尿液中没有发现这一物质。
图3 尿液及粪便提取液HPLC谱图
固定相：YWG-C18,5×200mm,Φ10μm,流动相：甲醇/水(70∶30)1ml/min;室温，进样量10μl a.尿样 b.粪便样Mp-代谢产物峰，各峰保留时间：1，2.27min;2,2.95min;3,3.15min;4,3.67min;Mp,4.25min
可以推测：螨胺磷主要从肝脏经胆汁排泄，这种排泄并非以母体形式，而是经转化成极性更强的物质后排泄。
参考文献
, http://www.100md.com
1.石 年，等.胺甲硫磷对大鼠毒作用机理初探-胺甲硫磷急染毒后血，脑，肝等组织生化改变.卫生毒理学杂志，1994，(4)：277～279.
2.石 年，赖志伟，郭 威，等.胺甲硫磷对大鼠血及脑乙酰胆碱酯酶的抑制作用.同济医科大学学报，1997，26(1)：33～36.
3.刘昌孝，刘定远.药物动力学概论.第1版.北京：中国科学出版社，1984，86～138.
4.曾衍霖.药物代谢动力学中二个计算问题—原始数据的权重与线性模型中房室数的确定.药学学报，1980，15：132.
5.宋春艳，张宝真.血和尿中微量甲胺磷的气相色谱分离测定法.军事医学科学院院刊，1992，16(3)：222～225.
(修回日期 1998年11月), 百拇医药
单位：郑 波 (武汉同济医科大学医学分子生物研究室 430030)； 李 龙 石 年 宋瑞琨 (同济医科大学环境医学研究所环境毒理研究室)
关键词：有机磷农药；螨胺磷；毒代动力学；高效液相色谱；生物转化
卫生毒理学杂志990207 内容摘要 运用高效液相色谱法，研究了静脉注射时，螨胺磷在大鼠体内的代谢动力学特征、组织分布及排泄途径，并初步分离了胆汁中的代谢产物。结果显示：螨胺磷在体内全身分布，并有周室富集，消除较快，在10mg/kg静脉注射呈二室模型，t1/2α为3.40min，t1/2β为59.03min，全身清除率Cl(s)0.018ml.min-1；螨胺磷主要分布于血流量大的器官及脂肪组织；螨胺磷在体内不稳定，能被肝脏代谢转化成极性更高的化合物后经由胆汁排出，该成分可在同样的色谱条件下被分离，峰保留时间4.25min；粪尿中均未检出原药。
, 百拇医药
The study of fenamithion on toxicokinetinetics in rats
Zheng Bo Li Long Shi Nian Song Ruikun
(Laboratory of Environmental Toxicology of the Institute of Environmental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Toxicokinetic characteristics thissus.Distribution and excretion of Fenamithion in Rats were studied by iv administration as well as its metabolic product was separated from choler preliminary with HPLC.The results indicated that the pesticide could be distributed through the body and cumulated in peripheral compartment relatively,but it could be eliminated rapidly.With parameters such as t1/2α valued 3.40min,t1/2β 59.03min and Cl(s) 0.018ml.min-1,Its metabolism followed two-compartment open model after administration of 10 mg/kg.It was primary distributed to blood-riched organs and fat tissues and ready to be biotransformed.The metabolic product were detected in choler,which had stronger polarity with retention time 4.25min;and no parent compound was found in both urine and faeces.
, 百拇医药
Key words:Toxicokinetics;Fenamithion;Organophosphorus pesticide
螨胺磷，又名胺甲硫磷、苯胺硫磷，化学名：O-甲基-O-(3-甲基-4-甲硫苯基)硫代磷酰胺酯[O-methyl-O-(3-methyl-4-methylthiophenyl) thiophosphoramidiots],是国内新开发的高效杀虫、杀螨有机磷农药，性能稳定，具有在低温下仍保持高效的优点，因而具有较大的开发价值。已有一些对该农药的毒理学研究报道[1，2]。我室在建立了生物样品中螨胺磷残留量的高效液相色谱测定方法的基础上，对螨胺磷经静脉途径染毒后，在大鼠体内的代谢动力学特征、分布及其排泄途径进行了研究，并试图分离出代谢产物。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：SD大鼠，雌性，体重(300±25)g，同济医科大学实验动物学部提供。
, 百拇医药
2.受试物：螨胺磷，纯度>99.7%，由华中师范大学农药研究所提供。用60%(v/v)乙醇水溶液配制浓度为6%的螨胺磷使用液。
3.试剂：甲醇，分析纯，上海振兴化工一厂产品(批号 940708)；乙腈，分析纯，武汉制药厂研究所产品(批号 920701)；乙酸乙酯，分析纯，武汉制胺厂产品(批号 920731)；石油醚(90～120)℃，分析纯，杭州炼油厂产品(批号 910104)，重蒸后使用；95%乙醇，分析纯，国产及新制双蒸水等。
4.仪器：638-50型高效液相色谱仪；紫外分光检测器，色谱柱(YWC-C18H37,10μmΦ,5mm×200mm)均为日本Hitachi公司产品；低速离心机，北京医用离心机厂；医用低温冰箱，日本SANYO公司产品。
二、方法
1.动物处理及取样：
, 百拇医药
(1)染毒及剂量：除特殊说明，均为尾静脉注入染毒，剂量10mg/kg。
(2)血样采集：动物3只，每只分别于染毒后2，3，10，15，30，45，60分时心脏采血，每次0.5ml。
(3)胆汁及尿液的收集：乌拉坦麻醉动物后，胆道插管，同时尿道插管，收集舌下静脉染毒前后的胆汁及尿液。
(4)粪便的收集：染毒后的动物饲养于代谢笼中，自由饮食，收集8小时粪便，自然风干后，-20℃保存。
(5)组织样品的采集：18只大鼠随机分配为6个时间组，分别于染毒后9，15，30，43，90分及8小时断头处死，快速取出所需脏器及组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后于-20℃保存。
(6)以上在处理动物前后均腹腔注射硫酸阿托品2mg/kg以保护动物。
, 百拇医药
2.样品制备及测定：样品的前处理及色谱测定采用本室建立的方法(生物样品中螨胺磷的HPLC测定法，待发表)：用乙腈/乙酸乙酯(1∶3)混合体系抽提样品，除血液和胆汁外，其它样品的抽提液用乙腈/石油醚萃取，以进一步去脂。然后，均于40℃水浴中，氮气吹干后，用甲醇溶解，高效液相色谱测定，色谱条件：固定相为YWG-C18H37,(5×200)mm,Φ10μm;流动相为甲醇/水(70∶30)，1ml/min;室温，进样量10μl，检测波长252nm;以保留时间定性，峰高、外标法定量。
3.结果处理及参数计算[3，4]：采用中国药理学会1987年版“3P87”药代动力学软件包对单只动物所得代谢数据进行运算，求出参数并作相应曲线拟合。部分结果以SAS软件包作相关分析及t检验。
结果与分析
一、静脉注入染毒的代谢动力学
, http://www.100md.com
3只大鼠分别经尾静脉注射受试物后，测得各时点血液中螨胺磷浓度见表1。以时间为横坐标，浓度为纵坐标作浓度-时间变化曲线，见图1。可以看出，曲线呈二室模型变化。经拟合以静脉注射二室开放模型最好，相关系数大于0.99。求得受试物在大鼠体内的代谢参数见表2。
表1 大鼠静脉染毒后各时点血液中螨胺磷的浓度(μg/ml) 时间(min)
1
2
3
±s2.0
24.28
31.97
, 百拇医药
14.08
23.44±8.97
3.0
20.63
30.64
10.02
20.43±10.31
10.0
8.89
11.42
6.29
8.87±2.56
, 百拇医药 15.0
5.51
9.37
4.64
6.51±2.52
30.0
2.75
5.85
3.20
3.93±1.68
45.0
1.82
2.92
, http://www.100md.com
3.56
2.77±0.88
60.0
1.82
2.90
2.49
2.40±0.54
图1 大鼠静脉注射染毒后血液中螨胺磷浓度-时间曲线
表2 大鼠静注螨胺磷的毒代动力学参数 参数
单位
参数值±s
, 百拇医药
A
μg/ml
26.61±15.95
α
min-1
0.246±0.143
B
μg/ml
7.58±6.17
β
min-1
0.017±0.013
, http://www.100md.com
V(c)
ml/g
0.349±0.351
t1/2α
min
3.398±1.488
t1/2β
min
59.03±36.12
k10
min-1
, 百拇医药
0.071±0.053
k21
min-1
0.062±0.039
k12
min-1
0.129±0.074
AUC
(μg/ml)min
561.9±81.4
Cl(s)
, http://www.100md.com
ml/min
0.018±0.002
螨胺磷在大鼠体内的拟合代谢方程为：Cp=26.61e-0.246t+7.58e-0.017t。结果表明，螨胺磷在大鼠体内分布快,t1/2α不到5分，V(c)大于血容量，表明在体内呈周身分布，周室富集；螨胺磷自体内的消除亦较快，t1/2β为1个小时左右，Cl(s)达0.018ml/min。
二、静脉注射染毒后螨胺磷在组织中的动态分布
每个时点样由3只大鼠组织混合得来，实测值用螨胺磷在相应组织中的回收率加以校正[5]。各脏器组织中不同时点农药残留量如表3。由表3可见，在染毒后90分时，除了脂肪组织外，农药残留都已经很低。8小时后，螨胺磷在几乎所有被检的组织均难以被检测出了。螨胺磷在肝、脑、心等组织中消除较快，在脂肪组织中消除最慢。肺、卵巢及子宫组织在43分有一峰，表明农药在这些组织中有一定蓄积。螨胺磷在骨骼肌和平滑肌中的残留及消除过程都极其相似。由于在脂肪组织中相对高的蓄积，可以取脂肪作为代表组织用于对螨胺磷的生物监测。表3 螨胺磷在不同组织器官中的动态分布(μg/g) 时间(min)
, 百拇医药
9
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30
43
90
8h
肝
10.16
8.65
3.38
1.80
1.14
-
, http://www.100md.com 肺
6.92
2.73
2.74
5.14
1.85
-
脑
6.94
4.52
1.81
1.19
0.60
, 百拇医药
+
肾
5.06
4.19
1.95
1.49
1.32
+
脾
3.43
2.77
0.66
-
, http://www.100md.com
-
-
心
6.65
5.63
4.08
1.81
0.89
-
贮备脂*
12.48
9.59
10.80
, 百拇医药
10.93
10.95
-
卵巢+子宫
3.00
1.33
1.64
2.46
1.43
-
骨骼肌
3.76
2.98
, 百拇医药
1.93
1.93
0.51
-
肠平滑肌
3.87
2.80
1.96
1.96
0.82
-
-:未检出 +：不能定量 *取自大网膜
三、代谢产物的分离
, 百拇医药
以相同的条件，对胆汁提取物进行色谱分析，其结果见图2。比较染毒前后的色谱图，可以看后者出现一新的色谱峰。该峰与相邻峰的分离度较高，保留时间为4.25分，比母体化合物(保留时间4.63分)更易于被极性流动相洗脱。这很可能是螨胺磷在肝脏被代谢转化后，随胆汁一起排泄的产物。其结构及详细代谢机制需要进一步研究。
图2 螨胺磷代谢产物HPLC谱图
固定相：YWG-C18，5×200mm,Φ10μm;流动相：甲醇/水(70∶30)，1ml/min,室温，进样量10μl a.染毒前胆汁样 b.静脉注射螨胺磷后3小时胆汁样 Mp—代谢产物峰 各峰保留时间：1，2.27min;2，2.95min;3,3.15min;Mp,4.25min
四、尿液与粪便提取物的色谱分析
, http://www.100md.com
尿液与粪便提取物的色谱图见图3。两者都没有螨胺磷原药组分，但在粪便有一成分与胆汁中代谢产物一致，可能来自胆汁，尿液中没有发现这一物质。
图3 尿液及粪便提取液HPLC谱图
固定相：YWG-C18,5×200mm,Φ10μm,流动相：甲醇/水(70∶30)1ml/min;室温，进样量10μl a.尿样 b.粪便样Mp-代谢产物峰，各峰保留时间：1，2.27min;2,2.95min;3,3.15min;4,3.67min;Mp,4.25min
可以推测：螨胺磷主要从肝脏经胆汁排泄，这种排泄并非以母体形式，而是经转化成极性更强的物质后排泄。
参考文献
, http://www.100md.com
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(修回日期 1998年11月), 百拇医药