高脂血症大鼠肾脏一氧化氮变化及其意义
作者：刘红燕 贾汝汉 丁国华 黄从新
单位：湖北医科大学附属第一医院内科，武汉 430060
关键词：高脂血症；蛋白尿；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶；凋亡
同济医科大学学报990211 摘要 为探讨高脂饲料对大鼠肾脏的损害及其一氧化氮的变化，用含4 %胆固醇及1 %胆酸钠的饲料饲喂大鼠建立高脂模型，观察大鼠尿蛋白排泄量，测定血清脂质及肾皮质、尿一氧化氮含量，并测肾组织诱生型一氧化氮合酶的表达及肾组织中细胞凋亡情况。结果显示8周后大鼠肾皮质及尿中一氧化氮含量增多，24 h尿蛋白排泄增加，肾小管诱生型一氧化氮合酶表达增强，其表达强度与肾组织中细胞凋亡数量正相关。揭示在高脂饮食导致的肾损害中诱生型一氧化氮合酶可能通过诱导细胞凋亡参与肾小管间质损害。
中图法分类号 R539.2， R696
, 百拇医药
The Change of Nitric Oxide in Hypercholesterilemia rats
and Its effect on Lipid-renal Damage
Liu Hongyan, Jia Ruhan, Ding Guohua et al
Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060
Abstract In order to investigate the role of nitric oxide (NO) in renal damage by lipid, the NO contents in cortex renis and urine in rats supplementded with 4 % cholesterol and 1 % cholic acid for 8 weeks were measured and the
was determined by the expression of a measure of NO content. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) on kidney tissue was studied by using immunohistochemistry methods. The apoptosis cells in the glomeruli, tubules and interstitium in the animals of two groups were identified by in situ nick end-labeling of fragmented DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase and biotinylated deoxyuridine. Cortex renis-NO content in hypercholesterolemia rats (CHR) was higher than in normal rats(NR) (P<0.05). The production in 24-h urine in CHR was increased as compared with that in NR (P<0.01), and iNOS expression in CHR was stronger than in NR. The index of TdT positive cells within glomeruli and tubules in CHR was higher than in NR (P<0.01 for both). The iNOS expression was significantly correlated with TdT positive cell index in CHR group (P<0.01). The NO product in cortex renis was correlated with 24-h urine protein in CHR (r=0.51, P<0.05). It was concluded that expression of iNOS caused the NO increase in CHR. NO might play an important role in renal tubulointerstitium injury by cell apoptosis.
, 百拇医药
Key words hypercholesterolemia; nitric oxide; inducible NO synthase; apoptosis
高脂血症作为慢性肾衰的一种代谢紊乱现象早已被人们所认识，近年来在动物实验中发现脂质可引起肾损害，并加重已有肾损害，但关于脂质引起肾损害的机制尚未完全清楚。一氧化氮作为一种自由基在许多疾病中起着重要作用。在动脉粥样硬化中研究甚多，本文就高脂血症大鼠肾脏中一氧化氮(NO)变化及其在肾损害中的作用进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，随机分为2组，每组10只，由湖北省老年病研究所动物室提供。
1.2 实验分组
, 百拇医药
将大鼠随机分为2组，正常对照组喂普通鼠料，高脂组饲以由4 %胆固醇与1 %胆酸钠组成的高脂饲料，饲料由湖北省医科院动物中心提供。饲养8周后留取血标本及24 h尿，然后处死大鼠取其肾脏分别做肾皮质匀浆及肾组织病理切片。
1.3 检测指标
①收集24 h尿液用磺基水杨酸法测尿蛋白定量，硝酸还原酶法及Griess试剂测尿NO量，尿一氧化氮以NO-x量表示。
②经大鼠心脏取血测血清脂质。
③麻醉处死大鼠取肾皮质测定NO含量，留取肾组织用100 ml/L福尔马林固定做石蜡切片，切片脱蜡入水然后加兔抗诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体(1∶100)依次加羊抗兔IgG及SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，观察iNOS在肾脏中的表达。
, 百拇医药
④原位末端脱氧核苷酸转移酶法检测肾组织凋亡细胞，切片脱蜡入水，蛋白酶K消化15 min，蒸馏水洗3次，然后在新鲜配制的30 g/L H2O2水中浸泡10 min，蒸馏水洗3次，加末端脱氧核苷酸转移酶及地高辛标记的dUTP在37 ℃下孵育2 h，TBS洗，然后依次加封闭液，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体、SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片，胞核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。具体程序见试剂盒说明，同时作阴性对照片。
⑤药品与试剂：胆固醇购自华美生物工程公司，胆酸钠由北京化学试剂公司提供。NO检测试剂购自南京建成生物有限公司。血脂检测试剂购自上海长征化学试剂公司。细胞凋亡试剂盒、兔抗iNOS及SABC试剂盒、DAB试剂购自武汉博士德公司。
1.4 统计学处理
所有资料均用t检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 血尿检测结果
两组大鼠24 h尿蛋白、尿NO、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的结果见表1。8周后高脂组大鼠尿蛋白明显增加，血清TC、LDL-C增高，两组TG、HDL-C水平无明显差异。高脂组尿NO量增多。
表1 两组大鼠血脂、24 h尿蛋白、尿NO定量结果 组别
n
血清TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
, 百拇医药
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
24h尿蛋白
(mg/24h)
尿NO
(μmol/24h)
正常对照组
10
1.33±0.18
0.96±0.21
, 百拇医药
1.17±0.17
0.96±0.25
14.53±4.07
6.96±3.02
高脂组
10
11.54±0.85**
0.81±0.33
1.23±0.45
8.85±1.92**
34.30±14.69*
, 百拇医药
16.56±6.30*
与正常对照组比较 *P<0.05 **P<0.012.2 肾皮质匀浆及肾组织免疫组化结果
8周后高脂大鼠肾脏皮质匀浆NO量明显增多(P<0.05)，肾小管iNOS表达增强，每个标本选取30个视野，利用IBAS图像分析仪对其显色强度进行分析，结果见表2。
表2 两组大鼠肾皮质匀浆NO及肾组织iNO组化结果分析 组别
n
皮质匀浆NO
(mmol/g.protein)
iNOS灰度
, 百拇医药
正常对照组
10
3.88±2.06
0.326±0.011
高脂组
10
7.69±2.78*
0.393±0.016***
与正常对照组比较 *P<0.05 ***P<0.001
肾皮质匀浆NO含量与24 h尿蛋白定量呈正相关，相关系数为0.51(P<0.05)
, http://www.100md.com
2.3 细胞中凋亡细胞指数
切片中凋亡细胞计数方法为×400高倍视野下每个标本数400个肾小管中的阳性细胞数，数20个肾小管间质视野中的阳性细胞数，数30个肾小球中的阳性细胞数，分别作为肾小管、肾小管间质及肾小球中的凋亡细胞指数。
在高脂组中肾小管iNOS的灰度与肾小管细胞凋亡指数呈正相关(r=0.974)，与肾小管间质细胞凋亡指数呈正相关(r=0.986)，与肾小球细胞凋亡指数呈正相关(r=0.975)，均为P<0.01(见表3)。
表3 两组大鼠肾组织中凋亡细胞指数分析 组别
n
肾小管细胞凋亡指数
肾小管间质细胞凋亡指数
, 百拇医药
肾小球细胞凋亡指数
正常对照组
6
0.19±0.03
0.28±0.03
0
高脂组
6
1.36±0.93*
0.88±0.49*
0.306±0.22
与正常对照组比较 *P<0.053 讨 论
, 百拇医药
高脂饮食对病变肾脏的进行性发展有促进作用，近年来通过动物实验发现高脂饮食可引起健康肾脏受损。本文中大鼠饲以高脂饮食8周即出现尿蛋白量明显增加，血脂增高，尤其是血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇增高，但高脂血症引起肾损害的机制目前尚不清楚。本研究发现饲以高脂饮食后随着血脂的升高，大鼠尿中
排泄量增加(P<0.05)，肾脏中iNOS表达增强，说明NO的升高与iNOS表达增强有关。在抗胸腺细胞血清诱导的肾小球肾炎模型中，发生补体依赖性肾小球系膜细胞溶解，L-NMMA(NO合成抑制剂)可防止肾小球系膜细胞溶解，阻止蛋白尿并降低肾小球转化生长因子β的表达和胞外基质的积聚，防止肾小球硬化[1]。在动物残余肾模型及人类肾小球肾炎中发现细胞凋亡与肾小球硬化指数显著相关，提示细胞凋亡参与了肾小球硬化[2]。在抗髓过氧化物酶相关的实验性新月体形成的肾小球肾炎模型中发现iNOS表达增强，过氧亚硝酸修饰的蛋白增多，双重染色显示硝基化的酪氨酸阳性细胞既产生超氧离子(
)也表达iNOS，高脂动物体内的超氧离子增加[3，4]，肾脏中的O2-也增加[5]，NO与反应可生成对细胞具有毒性作用的ONOO-。本实验中的iNOS表达增强与肾组织凋亡细胞数量正相关，其可能机制就是iNOS产生NO与肾组织中的反应生成ONOO-，从而造成细胞凋亡。NO增多与蛋白尿有关，iNOS表达增强及NO的增多可能通过细胞凋亡导致肾小球硬化及肾小管间质损害。特异地阻止iNOS表达有可能减轻脂质肾损害。后者有待进一步的实验证实。
, 百拇医药
作者简介：刘红燕，女，1968年生，博士研究生
参考文献
1 Nartta I, Border W A, Ketteler M et al. Nitric oxide mediates immunologic injury to kidney mesangium in experimental glomerulonephritis. Lab Invest,1995, 72:12
2 Hitoshi Sugiyama, Naoki Kasihara. Apoptosis in glomerular sclerosis. Kidney Int,1996,49:103
3 Yuichi Ohara,Peterson T E, Harrison D G. Hypercholesterilemia increases endothelian superoxide anion production.J Clin Invest,1993, 91:2 546
, http://www.100md.com
4 Rainer H B, stefanie M, Bode Boger et al. Supplementation of hypercholesterolaemic rabbits with L-arginine reduces the vascular release of supreoxide anions and restores NO production. Atherosclerosis,1995,117:273
5 Jan Galle.Impact of nitric oxicle on renal hemodynamics and glomerular function:modulation by atherogenic lipoproteins? Kidney Blood Press Res, 1996,19:2
收稿日期：1998-11-01, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第一医院内科，武汉 430060
关键词：高脂血症；蛋白尿；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶；凋亡
同济医科大学学报990211 摘要 为探讨高脂饲料对大鼠肾脏的损害及其一氧化氮的变化，用含4 %胆固醇及1 %胆酸钠的饲料饲喂大鼠建立高脂模型，观察大鼠尿蛋白排泄量，测定血清脂质及肾皮质、尿一氧化氮含量，并测肾组织诱生型一氧化氮合酶的表达及肾组织中细胞凋亡情况。结果显示8周后大鼠肾皮质及尿中一氧化氮含量增多，24 h尿蛋白排泄增加，肾小管诱生型一氧化氮合酶表达增强，其表达强度与肾组织中细胞凋亡数量正相关。揭示在高脂饮食导致的肾损害中诱生型一氧化氮合酶可能通过诱导细胞凋亡参与肾小管间质损害。
中图法分类号 R539.2， R696
, 百拇医药
The Change of Nitric Oxide in Hypercholesterilemia rats
and Its effect on Lipid-renal Damage
Liu Hongyan, Jia Ruhan, Ding Guohua et al
Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060
Abstract In order to investigate the role of nitric oxide (NO) in renal damage by lipid, the NO contents in cortex renis and urine in rats supplementded with 4 % cholesterol and 1 % cholic acid for 8 weeks were measured and the
was determined by the expression of a measure of NO content. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) on kidney tissue was studied by using immunohistochemistry methods. The apoptosis cells in the glomeruli, tubules and interstitium in the animals of two groups were identified by in situ nick end-labeling of fragmented DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase and biotinylated deoxyuridine. Cortex renis-NO content in hypercholesterolemia rats (CHR) was higher than in normal rats(NR) (P<0.05). The production in 24-h urine in CHR was increased as compared with that in NR (P<0.01), and iNOS expression in CHR was stronger than in NR. The index of TdT positive cells within glomeruli and tubules in CHR was higher than in NR (P<0.01 for both). The iNOS expression was significantly correlated with TdT positive cell index in CHR group (P<0.01). The NO product in cortex renis was correlated with 24-h urine protein in CHR (r=0.51, P<0.05). It was concluded that expression of iNOS caused the NO increase in CHR. NO might play an important role in renal tubulointerstitium injury by cell apoptosis., 百拇医药
Key words hypercholesterolemia; nitric oxide; inducible NO synthase; apoptosis
高脂血症作为慢性肾衰的一种代谢紊乱现象早已被人们所认识，近年来在动物实验中发现脂质可引起肾损害，并加重已有肾损害，但关于脂质引起肾损害的机制尚未完全清楚。一氧化氮作为一种自由基在许多疾病中起着重要作用。在动脉粥样硬化中研究甚多，本文就高脂血症大鼠肾脏中一氧化氮(NO)变化及其在肾损害中的作用进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，随机分为2组，每组10只，由湖北省老年病研究所动物室提供。
1.2 实验分组
, 百拇医药
将大鼠随机分为2组，正常对照组喂普通鼠料，高脂组饲以由4 %胆固醇与1 %胆酸钠组成的高脂饲料，饲料由湖北省医科院动物中心提供。饲养8周后留取血标本及24 h尿，然后处死大鼠取其肾脏分别做肾皮质匀浆及肾组织病理切片。
1.3 检测指标
①收集24 h尿液用磺基水杨酸法测尿蛋白定量，硝酸还原酶法及Griess试剂测尿NO量，尿一氧化氮以NO-x量表示。
②经大鼠心脏取血测血清脂质。
③麻醉处死大鼠取肾皮质测定NO含量，留取肾组织用100 ml/L福尔马林固定做石蜡切片，切片脱蜡入水然后加兔抗诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体(1∶100)依次加羊抗兔IgG及SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，观察iNOS在肾脏中的表达。
, 百拇医药
④原位末端脱氧核苷酸转移酶法检测肾组织凋亡细胞，切片脱蜡入水，蛋白酶K消化15 min，蒸馏水洗3次，然后在新鲜配制的30 g/L H2O2水中浸泡10 min，蒸馏水洗3次，加末端脱氧核苷酸转移酶及地高辛标记的dUTP在37 ℃下孵育2 h，TBS洗，然后依次加封闭液，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体、SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片，胞核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。具体程序见试剂盒说明，同时作阴性对照片。
⑤药品与试剂：胆固醇购自华美生物工程公司，胆酸钠由北京化学试剂公司提供。NO检测试剂购自南京建成生物有限公司。血脂检测试剂购自上海长征化学试剂公司。细胞凋亡试剂盒、兔抗iNOS及SABC试剂盒、DAB试剂购自武汉博士德公司。
1.4 统计学处理
所有资料均用t检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 血尿检测结果
两组大鼠24 h尿蛋白、尿NO、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的结果见表1。8周后高脂组大鼠尿蛋白明显增加，血清TC、LDL-C增高，两组TG、HDL-C水平无明显差异。高脂组尿NO量增多。
表1 两组大鼠血脂、24 h尿蛋白、尿NO定量结果 组别
n
血清TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
, 百拇医药
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
24h尿蛋白
(mg/24h)
尿NO
(μmol/24h)
正常对照组
10
1.33±0.18
0.96±0.21
, 百拇医药
1.17±0.17
0.96±0.25
14.53±4.07
6.96±3.02
高脂组
10
11.54±0.85**
0.81±0.33
1.23±0.45
8.85±1.92**
34.30±14.69*
, 百拇医药
16.56±6.30*
与正常对照组比较 *P<0.05 **P<0.012.2 肾皮质匀浆及肾组织免疫组化结果
8周后高脂大鼠肾脏皮质匀浆NO量明显增多(P<0.05)，肾小管iNOS表达增强，每个标本选取30个视野，利用IBAS图像分析仪对其显色强度进行分析，结果见表2。
表2 两组大鼠肾皮质匀浆NO及肾组织iNO组化结果分析 组别
n
皮质匀浆NO
(mmol/g.protein)
iNOS灰度
, 百拇医药
正常对照组
10
3.88±2.06
0.326±0.011
高脂组
10
7.69±2.78*
0.393±0.016***
与正常对照组比较 *P<0.05 ***P<0.001
肾皮质匀浆NO含量与24 h尿蛋白定量呈正相关，相关系数为0.51(P<0.05)
, http://www.100md.com
2.3 细胞中凋亡细胞指数
切片中凋亡细胞计数方法为×400高倍视野下每个标本数400个肾小管中的阳性细胞数，数20个肾小管间质视野中的阳性细胞数，数30个肾小球中的阳性细胞数，分别作为肾小管、肾小管间质及肾小球中的凋亡细胞指数。
在高脂组中肾小管iNOS的灰度与肾小管细胞凋亡指数呈正相关(r=0.974)，与肾小管间质细胞凋亡指数呈正相关(r=0.986)，与肾小球细胞凋亡指数呈正相关(r=0.975)，均为P<0.01(见表3)。
表3 两组大鼠肾组织中凋亡细胞指数分析 组别
n
肾小管细胞凋亡指数
肾小管间质细胞凋亡指数
, 百拇医药
肾小球细胞凋亡指数
正常对照组
6
0.19±0.03
0.28±0.03
0
高脂组
6
1.36±0.93*
0.88±0.49*
0.306±0.22
与正常对照组比较 *P<0.053 讨 论
, 百拇医药
高脂饮食对病变肾脏的进行性发展有促进作用，近年来通过动物实验发现高脂饮食可引起健康肾脏受损。本文中大鼠饲以高脂饮食8周即出现尿蛋白量明显增加，血脂增高，尤其是血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇增高，但高脂血症引起肾损害的机制目前尚不清楚。本研究发现饲以高脂饮食后随着血脂的升高，大鼠尿中
排泄量增加(P<0.05)，肾脏中iNOS表达增强，说明NO的升高与iNOS表达增强有关。在抗胸腺细胞血清诱导的肾小球肾炎模型中，发生补体依赖性肾小球系膜细胞溶解，L-NMMA(NO合成抑制剂)可防止肾小球系膜细胞溶解，阻止蛋白尿并降低肾小球转化生长因子β的表达和胞外基质的积聚，防止肾小球硬化[1]。在动物残余肾模型及人类肾小球肾炎中发现细胞凋亡与肾小球硬化指数显著相关，提示细胞凋亡参与了肾小球硬化[2]。在抗髓过氧化物酶相关的实验性新月体形成的肾小球肾炎模型中发现iNOS表达增强，过氧亚硝酸修饰的蛋白增多，双重染色显示硝基化的酪氨酸阳性细胞既产生超氧离子()也表达iNOS，高脂动物体内的超氧离子增加[3，4]，肾脏中的O2-也增加[5]，NO与反应可生成对细胞具有毒性作用的ONOO-。本实验中的iNOS表达增强与肾组织凋亡细胞数量正相关，其可能机制就是iNOS产生NO与肾组织中的反应生成ONOO-，从而造成细胞凋亡。NO增多与蛋白尿有关，iNOS表达增强及NO的增多可能通过细胞凋亡导致肾小球硬化及肾小管间质损害。特异地阻止iNOS表达有可能减轻脂质肾损害。后者有待进一步的实验证实。, 百拇医药
作者简介：刘红燕，女，1968年生，博士研究生
参考文献
1 Nartta I, Border W A, Ketteler M et al. Nitric oxide mediates immunologic injury to kidney mesangium in experimental glomerulonephritis. Lab Invest,1995, 72:12
2 Hitoshi Sugiyama, Naoki Kasihara. Apoptosis in glomerular sclerosis. Kidney Int,1996,49:103
3 Yuichi Ohara,Peterson T E, Harrison D G. Hypercholesterilemia increases endothelian superoxide anion production.J Clin Invest,1993, 91:2 546
, http://www.100md.com
4 Rainer H B, stefanie M, Bode Boger et al. Supplementation of hypercholesterolaemic rabbits with L-arginine reduces the vascular release of supreoxide anions and restores NO production. Atherosclerosis,1995,117:273
5 Jan Galle.Impact of nitric oxicle on renal hemodynamics and glomerular function:modulation by atherogenic lipoproteins? Kidney Blood Press Res, 1996,19:2
收稿日期：1998-11-01, 百拇医药