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编号:10238238
牛磺胆汁酸钠的合成及其镇咳、祛痰作用比较
http://www.100md.com 《同济大学学报(医学版)》 1999年第2期
     作者:李沙 石朝周

    单位:同济医科大学药学院药剂学教研室, 武汉 430030

    关键词:牛磺胆汁酸钠;合成;镇咳;祛痰

    同济医科大学学报990209 摘要 对6种不同的牛磺胆汁酸钠进行了合成,并对比研究其镇咳、祛痰作用。结果表明,相对于空白组它们均具有镇咳、祛痰作用,但两者强弱顺序不一致。前者为:牛磺鹅去氧胆酸钠>牛磺猪去氧胆酸钠>牛磺胆酸钠≥牛磺熊去氧胆酸钠>牛磺蝰胆酸钠>牛磺去氧胆酸钠;后者为:牛磺熊去氧胆酸钠>牛磺鹅去氧胆酸钠>牛磺胆酸钠≥牛磺去氧胆酸钠≥牛磺蝰胆酸钠>牛磺猪去氧胆酸钠。结果提示,牛磺胆汁酸钠的镇咳、祛痰强度因羟基的位置与数目而异,其中7位具羟基者作用较强。

    中图法分类号 R284.1, R243

    Synthesis of Sodium Taurine-Conjugated Bile Salts and Their Comparison
, http://www.100md.com
    in Antitussive and Expectorant Effects

    Li Sha, Shi Chaozhou

    Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy,Tongji Medical University,Wuhan 430030

    Abstract The synthesis of 6 kinds of sodium taurine-conjugated bile salts was studied and their comparison in antitussive and expectorant effects made. The results showed the six compounds all had the antitussive and expectorant effects as compared with control group. But the intensity sequence of the compounds for the two effects was inconsistent. The intensity sequence for the former was: TCDCANa>THDCANa>TCANa≥TUDCANa>TBCANa>TDCANa;for the latter was:TUDCANa>TCDCANa>TCANa≥TDCANa≥TBCANa>THDCANa. The results indicated that there were different antitussive and expectorant effects among the compounds because of the different position and number of the hydroxyl group in their structures, and among them the compounds with hydroxyl group on the 7th carbon atom showed stronger effects.
, 百拇医药
    Key words sodium taurine-conjugated bile salt; synthesis; antitussive effect; expectorant effect

    从上世纪开始,胆汁及胆汁酸的研究一直是化学和医药科学领域中的一个热点[1]。其研究重点已从初期的分离及结构鉴定转向药理作用探索,但研究的对象主要是游离型胆汁酸。鉴于人类与动物胆汁中的胆汁酸多以结合型胆汁酸盐的形式存在,且以牛磺胆汁酸盐最为常见,本文合成纯化了6种主要的牛磺胆汁酸钠,并定性地探讨了结构对其镇咳、祛痰作用的影响。

    1 材料与方法

    1.1 试剂设备及动物

    牛磺酸,由武汉制药厂生产(纯度>98%);石胆酸,由Fluka AG,Chem,Fabrik CH-9470 Buchs购得(纯度>99%);去氧胆酸,由上海化学试剂站分装厂购得,Fluka进口分装(纯度≥99%);猪去氧胆酸,由武汉肉联厂提供,粗品;熊去氧胆酸,由江苏镇江生物化学制药厂生产,片剂;鹅去氧胆酸,由江苏高邮生物化学制药厂生产,胶囊;胆酸,由北京市海淀区微生物培养基制品厂生产;牛磺蝰胆酸钠,由本室制备并经结构鉴定确证;N-乙氧甲酰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ),由本室合成并经结构鉴定确证;二甲基甲酰胺(DMF),分析纯(AR);其它试剂均为AR级;柱层析用硅胶,200~300目,由青岛海洋化工厂生产。
, 百拇医药
    X4熔点测量显微镜;PE-983型红外光谱仪;VG-7070-HF型质谱仪;ARX-500型核磁共振仪;751型紫外-可见分光光度计。

    小白鼠,昆明种,购自同济医科大学实验动物学部,(20±2) g,雌雄各半。

    1.2 牛磺胆汁酸钠的合成

    按照Belleau(EEDQ)[2,3]合成牛磺胆汁酸钠,合成路线见图1。

    取5 mmol A与7 mmol EEDQ,用10 ml DMF溶解,搅拌下向此溶液中依次加入5.5 mmol牛磺酸与0.9 ml三乙胺,反应混合物于90 ℃搅拌回流1 h后去热源,继续搅拌1 h至室温。将反应液缓缓加入冰浴中的100 ml冷乙醚中,边加边搅拌,将所得混悬液冷藏过夜。过滤,沉淀用乙醚洗涤后溶于30 ml二氯甲烷中,并滤除不溶物(未反应的牛磺酸)。在冰浴中,于搅拌下将澄清的滤液慢慢加入100 ml乙醚后过滤。沉淀用乙醚洗涤后溶于25 ml 0.2 mol/L NaOH 甲醇溶液中,搅拌下向其中加入100 ml乙醚,产生大量白色絮状沉淀,用乙醚洗涤后于真空干燥得白色粉末B(约4.65 mmol,93%)。
, 百拇医药
    A

    B

    R1=R2=R4=H,R3=α-OH

    去氧胆酸

    牛磺去氧胆酸钠(TDCANa)Ⅰ

    R2=R3=R4=H,R1=α-OH

    猪去氧胆酸

    牛磺猪去氧胆酸钠(THDCANa)Ⅱ

    R1=R3=R4=H,R2=α-OH

    鹅去氧胆酸

    牛磺鹅去氧胆酸钠(TCDCANa)Ⅲ
, 百拇医药
    R1=R3=R4=H,R2=β-OH

    熊去氧胆酸

    牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCANa)Ⅳ

    R1=R4=H,R2=R3=α-OH

    胆酸

    牛磺胆酸钠(TCANa)Ⅴ

    R1=R2=H,R3=α-OH,R4=-OH

    蝰胆酸

    牛磺蝰胆酸钠(TBCANa)Ⅵ

    图1 6种牛磺胆汁酸钠的合成路线

    以200~300目硅胶装柱,取2 g粗品制样,将样品小心加于柱顶,以氯仿∶甲醇∶水(65∶28∶4)洗脱,得白色粉末状精品B。精制后收率分别为:Ⅰ与Ⅴ为 65%,其它均为 50%。其m.p.分别为:Ⅰ 178~180 ℃;Ⅱ 207~209 ℃;Ⅲ 198~200 ℃;Ⅳ 176~178 ℃;Ⅴ 194~196 ℃。
, 百拇医药
    将上述精制品B进行IR, 13C-NMR及MS波谱分析,结果与文献报道一致[4~6]

    1.3 牛磺胆汁酸钠镇咳、祛痰作用的药效学试验

    1.3.1供试液:空白对照液:生理盐水。样品液:Ⅱ 0.014 9 mmol/ml;其它均为0.029 8 mmol/ml。

    1.3.2 镇咳作用:选取健康小白鼠70只,体重(20±2) g,雌雄各半,随机分为7组,每组10只。将小鼠放入上悬有棉球的500 ml钟罩内,向棉球注入浓氨水(25 %~28 %)1 ml,2 min后立即取出小鼠,置烧杯中观察。以小鼠腹肌收缩及张口为咳嗽指标,记录1 min内咳嗽次数(无咳嗽或咳嗽次数少于30次者为不敏感,弃之并予以补充)。此后立即将每组小鼠分别用空白对照液或一种样品液灌胃,剂量分别为:Ⅱ1.0 ml/只,其余均为0.5 ml/只。1 h后依前法给以氨水刺激,记录给药后的咳嗽次数,并以减咳率来反映镇咳效果。
, 百拇医药
    1.3.3 祛痰作用: 酚红标准曲线的绘制:精密称取酚红0.091 8 g,以50 g/L NaHCO3溶液溶解,移至1 000 ml的容量瓶中,加50 g/L NaHCO3溶液至刻度定容。分别取此溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 ml于10 ml容量瓶中,以50 g/L NaHCO3溶液稀释至刻度。以50 g/L NaHCO3溶液为空白,在751型紫外-可见分光光度计上于540 nm处测定其吸收度(A)。小鼠气管酚红排泌量的测定:选取健康小白鼠70只,体重(20±2) g,雌雄各半,随机分为7组,每组10只。实验前先将小鼠禁食12 h,然后将每组小鼠分别用空白对照液或一种样品液灌胃,剂量分别为:Ⅱ1.0 ml/只,其余均为0.5 ml/只。给药0.5 h后以0.5 ml/只的量给小白鼠腹腔注射2.5 g/L酚红溶液,再过0.5 h后使小鼠颈椎脱臼处死,仰位固定于木板上。切开颈正中皮肤找出气管,用6号针头从小鼠喉头刺入气管0.3 cm,用线结扎避免针头滑脱,用1 ml的注射器抽取0.5 ml 50 g/L NaHCO3溶液抽洗3次,将抽洗液注入小试管中并重复此操作4次。将5次抽洗液混合,并用50 g/L NaHCO3溶液稀释至3 ml,以1 500 r/min的速度离心5 min。小心分取上清液,于540 nm处以50 g/L NaHCO3溶液为空白,在751型紫外-可见分光光度计上测定A值,并用所得的酚红标准曲线求出小鼠的酚红排泌量。
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    2 结 果

    以生理盐水为空白对照液,小白鼠为实验动物,测得6种牛磺胆汁酸钠的镇咳、祛痰作用的药效学数据见表1、表2。

    表1 化合物Ⅰ~Ⅵ对小鼠氨水引咳模型的镇咳作用比较(±s) 组别

    n

    减咳率(%)

    与空白比较

    与Ⅰ比较

    与Ⅱ比较

    与Ⅲ比较

    与Ⅳ比较
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    与Ⅴ比较

    与Ⅵ比较

    空白

    10

    -1.23±2.17

    —

    *

    *

    *

    *

    *

    *

    Ⅰ

    10
, 百拇医药
    19.71±3.43

    *

    —

    *

    *

    *

    *

    *

    Ⅱ

    10

    54.63±3.73

    *

    *

, 百拇医药     —

    *

    *

    *

    *

    Ⅲ

    10

    68.37±4.73

    *

    *

    *

    —

    *

    *
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    *

    Ⅳ

    10

    29.44±4.37

    *

    *

    *

    *

    —

    *

    Ⅴ

    10

    30.00±2.49

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    *

    *

    *

    —

    *

    Ⅵ

    10

    25.21±3.50

    *

    *

    *

    *

    *
, 百拇医药
    *

    —

    * P<0.05;空格表示无显著性差异表2 化合物Ⅰ~Ⅵ对小鼠酚红排泌量的影响比较(±s) 组别

    n

    酚红排泌量

    (μg/ml)

    与空白比较

    与Ⅰ比较

    与Ⅱ比较

    与Ⅲ比较

    与Ⅳ比较
, 百拇医药
    与Ⅴ比较

    与Ⅵ比较

    空白

    10

    0.18±0.08

    —

    *

    *

    *

    *

    *

    *

    Ⅰ

    10
, 百拇医药
    0.96±0.09

    *

    —

    *

    *

    *

    Ⅱ

    10

    0.73±0.09

    *

    *

    —

    *

    *
, 百拇医药
    *

    *

    Ⅲ

    10

    1.18±0.16

    *

    *

    *

    —

    *

    *

    *

    Ⅳ

    10
, 百拇医药
    1.29±0.22

    *

    *

    *

    *

    —

    *

    *

    Ⅴ

    10

    0.97±0.11

    *

    *

    *
, 百拇医药
    *

    —

    Ⅵ

    10

    0.96±0.11

    *

    *

    *

    *

    —

    * P<0.05;空格表示无显著性差异 从表1与表2中看出,与空白对照组比较,这6种牛磺胆汁酸钠均具有镇咳、祛痰作用。其作用强度顺序依次为:①镇咳作用, TCDCANa>THDCANa>TCANa≥TUDCANa>TBCANa>TDCANa;②祛痰作用, TUDCANa>TCDCANa>TCANa≥TDCANa≥TBCANa>THDCANa。
, 百拇医药
    3 讨 论

    胆汁酸是动物胆汁的主要成分,它们在胆汁中多与各种氨基酸以结合形式存在,最常见的为牛磺胆汁酸与甘氨胆汁酸,而在许多动物胆汁中又以牛磺胆汁酸更为多见,且它们大多为钠盐。虽然国内外许多文献报道过一些动物胆汁或结石中所含胆汁酸的组成及药理作用,但关于结合型胆汁酸的研究较游离型少。例如,有人已证实鹅去氧胆酸钠、猪去氧胆酸钠分别为鸡、猪胆汁的镇咳、祛痰活性成分[7],那么它们的牛磺酸结合物是否也有此效用呢?至今未见报道。本文合成了6种主要的牛磺胆汁酸钠,并对其进行了镇咳、祛痰作用的药效学实验,结果表明对于空白对照组而言,这6种牛磺胆汁酸钠均具有镇咳、祛痰的生理活性,但强度不尽相同。实验结果还提示,甾环上具二个羟基的牛磺胆汁酸钠较三个羟基者镇咳作用要强,尤其是7位或6位碳原子上有羟基的牛磺胆汁酸钠;当分子中的羟基数目相等时,羟基所在位置不同,其镇咳作用有显著性差异,且羟基在7α位者比7β位者作用强。祛痰作用与镇咳作用的强弱顺序间不存在平行关系,但3位和7位碳原子上有羟基的二羟基牛磺胆汁酸钠仍显示较强的祛痰活性,且羟基处于7β位者的强度较7α位者大。
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    作者简介:李 沙,女,1973年生,硕士,助教

    参考文献

    1 Hofmann A F, Aldo R. Physicochemical properties of bile acids and their relationship to biological properties:an overview of the problem. J Lipid Res,1984,25∶1 477

    2 Tserng Koo-Yi,Hachey D L, Klein P D.An improved procedure for the synthesis of glycine and taurine conjugates of bile acids. J Lipids Res,1977,18∶404

    3 Lack Leon,Dorrity F O, Walker J T.Synthesis of conjugated bile acids by means of a peptide coupling reagent. J Lipid Res,1973,14∶367
, http://www.100md.com
    4 王永金,杨泽民.红外光谱鉴定熊胆的研究.沈阳药学院学报,1989,6(3)∶157

    5 Whitney J O, Burlingame A L.Mass Spectrometric analysis of bile acids in neonatal liver diseases.Mass spectrometry of large molecules,Lectures of a course held at the Joint Research Centre. Italy:Ispra.1983,195

    6 于德泉,杨峻山,谢晶曦.分析化学手册(第五分册).北京:化学工业出版社,1989.818

    7 辽宁中医学院药理教研室,沈阳军区药检组,沈阳药学院.鸡、猪、羊胆汁镇咳、祛痰、止喘作用及急性毒性的实验研究.辽宁中医,1978,3(1)∶39

    收稿日期:1997-12-01, http://www.100md.com