脑缺血大鼠大脑中动脉VIP样神经纤维的变化
作者：任明 朱克 黄旭升 张凤英 刘洁晓
单位：解放军总医院神经内科，北京 100853
关键词：局灶脑缺血；VIP；免疫组化；大脑中动脉；大鼠
军医进修学院学报990213 摘要 目的：探讨支配脑血管的血管活性肠肽(VIP)样神经纤维在脑缺血中的作用。方法：采用线栓法建立大鼠局灶脑缺血模型采用免疫组化法动态观察SD大鼠局灶脑缺血后大脑中动脉VIP样神经纤维的变化。结果：缺血侧大脑中动脉近端单位面积的神经纤维数目，在缺血后 24h 开始减少，1 周时恢复正常，2～4 周高于正常，5 周时又恢复正常。结论：支配脑血管的VIP样神经纤维可能参与脑缺血这一病理生理过程。
中国图书资料分类法分类号 R 743.9
The changes of VIP-like nerve fibers inmiddle cerebral artery focal cerebral ischemia in rat
, 百拇医药
Renming, Zhu Ke,huang Xusheng, Zhang Fengying, Liu Jexiao (Department of neurology, Generalhospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To study the role of vasoactive intestinal polypeptide-like(VIP-LI) nerve fibers innervatingmiddle cerebral artery (MCA)during cerebral ischemia.Methods: Themodel of rat focal cerebral ischemia was produced with the thread occlusion of themCA. Thedyamic changes of the number of VIP-LI nerve fibers inmCA were studied with the techniques of immunohistochemistry. Results: Thedenasity (the averaged number or nerve fibers in a unit area) of VIP-LI nerve fibers ofmCA in the ischemic sidedecreased 24hours after ischemia, returned to normal after 1 week, increased after 2 to 4 weeks and became normal againduring the 5th week.Conclusion: The cerebral artery innervating VIP-LI nerve fibersmay play a protective roleduring cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words focal cerebral ischemia; VIP; immunohistochemistry;middle cerebral artery; rat
脑血管的神经调节已得到广泛研究。脑血管主要由三类神经纤维支配：① 含去甲肾上腺素和神经肽Y的交感神经纤维；② 含乙酰胆碱、血管活性肠肽(VIP)和组异素的副交感神经丛；③ 含P物质、神经激肽A以及降钙素基因相关肽的感觉传入神经纤维〔1，2〕。在大鼠，起源于蝶腭神经节的VIP样神经纤维经筛孔入颅，支配脑底部血管且主要是同侧脑血管〔3〕。电刺激一侧神经可使同侧脑血流增加，切断一侧神经未见平静状态下脑血流出现变化〔4〕。切断一侧神经后，局灶脑缺血大鼠脑梗塞体积增加〔5〕。因此，支配脑血管之VIP样神经纤维很可能在脑缺血这一病理生理过程中起作用。本研究采用免疫组化法对大鼠局灶脑缺血后大脑中动脉近端血管壁上VIP样神经纤维的变化进行了动态观察，目的在于从形态学的角度来证实支配脑血管的VIP样神经纤维参与脑缺血这一病理生理过程。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物分组 选用成年SD大鼠 44 只，雌雄不限，体重 250～300g，在日常光照下自由饮水进食，随机分成 11 组，每组 4 只，其中A、B、C、D、E、F、G、H、I组动物分别在脑缺血后 12h、1d、2 和 3d 及 1 周、2 周、3 周、4 和 5 周处死，其余 2 组J和K组分别为正常对照组和假手术组。
1.2 局灶脑缺血模型的建立 用线栓法进行大脑中动脉的堵塞〔6〕，即经右侧颈总动脉结插入直径为 0.165mm 的尼龙线至同侧Willis环，进线长度以颈动脉分叉处为准至最远端为 1.7 cm，堵住该侧大脑中动脉入口。假手术组除不插线外余处理同前，正常对照组不行任何手术处理。
1.3 分别在上述脑缺血时间给动物以过量水合氯醛腹腔注射麻醉，经升主动脉灌注，先用 200ml 生理盐水，后用含 0.2% 苦味酸和 4% 多聚甲醛之 0.1mol/L PB 500ml。灌注完毕后取出鼠脑，在解剖显微镜下剥离出脑底动脉环及与其相连的各动脉。免疫组化采用漂浮染色，步骤为脑血管依次入： 3% 的过氧化氢 3min，10% 的山羊血清中孵育 10min，1% Tritox X-100 漂洗 10min，抗VIP抗体中(兔抗鼠，1∶3000 稀释) 4℃ 48h，生物素标记的二抗(抗兔IgG，1∶3000 稀释) 37℃ 孵育 30min，辣根过氧化酶标记的链卵白素中，37℃ 孵育 30min。上述各步骤之间均用PBS漂洗。最后用DBA呈色，标本上玻片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片及光镜下观察。
, 百拇医药
1.4 神经纤维计数 显微镜下测微尺单位面积(0.1×0.1mm2)内计数神经纤维数目，在大脑中动脉起始段任选 4 个单位面积。结果用平均数±标准差表示。
1.5 统计方法 各组动物自身左、右侧之神经纤维数目之比较采用Student t检验。
2 结果
支配大脑中动脉之VIP样神经纤维，在脑缺血后 12h 未见减少，1d～1 周内缺血侧较对侧少，脑缺血 2～4 周缺血侧较对侧增多，5 周恢复正常(附表)。
附表 脑缺血各组及对照组左右侧大脑中动脉VIP样神经纤维数目的比较(n=4，
±s)
左
, http://www.100md.com
右
P
A
10.8±0.37
11.3±0.28
>0.05
B
11.3±0.22
6.2±0.21
<0.05
C
10.5±0.36
5.7±0.38
, 百拇医药
<0.01
D
11.6±0.47
6.4±0.65
<0.05
E
11.6±0.58
11.4±0.45
>0.05
F
12.0±0.21
18.6±0.34
, 百拇医药 <0.05
G
12.6±0.12
20.4±0.37
<0.01
H
11.8±0.47
17.3±0.22
<0.05
I
10.8±0.32
11.3±0.25
>0.05
, 百拇医药
J
11.4±0.28
12.1±0.15
>0.05
K
11.8±0.16
11.3±0.37
>0.05
3 讨论
支配脑血管的副交感神经含乙酰胆碱、VIP和组异素。在大鼠，起源于蝶腭神经节的节后副交感神经纤维经筛孔入颅，支配脑底部血管，且主要是同侧脑血管〔3〕。乙酰胆碱、VIP和组异素均具有扩血管作用。本研究采用大鼠局灶脑缺血模型，用免疫组化方法对局灶脑缺血大鼠大脑中动脉的VIP样神经纤维的变化进行了观察，发现缺血侧大脑中动脉管壁上VIP样神经纤维在缺血后先是下降，尔后又升高，最后恢复正常。1d～1 周内，血管上VIP样神经纤维下降的原因可能与神经末梢VIP大量释放有关。VIP作为扩血管物质在脑缺血的情况下释放出来以改善缺血区之血液循环〔7，8〕。 2～4 周后血管上VIP样神经纤维增多，推测与神经元内VIP合成的增多以及突触末梢再摄取的增加有关。到后期可能通过神经的自我调节功能而使血管上VIP样神经纤维恢复正常。本实验从形态学的角度为VIP样神经在脑缺血这一病理生理过程中起相应的反应提供了一定的证据。结论认为，该神经可能在脑缺血中对脑组织起保护作用。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Edvinsson L,harah, Uddman R. Retrograde tracing of nerve fibers to the ratmiddle cerebral artery with ture blue: colocalization withdifferent peptides. J Cereb Blood Flowmetab, 1989,9:212
[2]Edvinsson L, Uddman R, Juul R. Pepti-dergic innervation of the cerebral circulation. Role in subarachnoidhemorrhage inman. Neurosurg Rev, 1990,13:265
[3]Suzuki N,hardebo JE, Owman C et al. Origings and Pathways of Cerebrovascular Vasoactive Intestinal polypeptide-positive nerves in rat. J Cereb Blood Flowmetab, 1988,8:697
, http://www.100md.com
[4]Suzuki N,hardebo JE, Kahrstrom J et al. Selective electrical stimulation of Postganglionic cerebrovascular para-sympathetic nerve fibers originatiing from the sphenopalatine ganglion enhances cortical blood flow in the rat. J Cereb Blood Flowmetab, 1990,10:383
[5]Kanom,moskowitzmA, Yokotam.Parasympatheticdenervation of rat pial vessels significantly increases infarction volume followingmiddle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flowmetab, 1991,11:628
, 百拇医药
[6]Nagasawah, and Kogure K. Correlation between blood flow andhistologic changes in a new ratmodel ofmiddle cerebral artery occlusion. Stroke, 1989,20:1037
[7]Owman C. Peptidergic vasodilator nerves in the peripheral circrlation and in the vascular beds of theheart and brain. Blood Vessels, 1990,27:73
[8]Uemura Y, Sugimoto T, Okamoto S et al. Changes of neuropeptide immunoreactivity in cerebrovascular nerve fibers after experimentally produced SAH. J Neurosurg, 1987,66:741
(1998—09—23收稿，1998—11—17修回), 百拇医药
单位：解放军总医院神经内科，北京 100853
关键词：局灶脑缺血；VIP；免疫组化；大脑中动脉；大鼠
军医进修学院学报990213 摘要 目的：探讨支配脑血管的血管活性肠肽(VIP)样神经纤维在脑缺血中的作用。方法：采用线栓法建立大鼠局灶脑缺血模型采用免疫组化法动态观察SD大鼠局灶脑缺血后大脑中动脉VIP样神经纤维的变化。结果：缺血侧大脑中动脉近端单位面积的神经纤维数目，在缺血后 24h 开始减少，1 周时恢复正常，2～4 周高于正常，5 周时又恢复正常。结论：支配脑血管的VIP样神经纤维可能参与脑缺血这一病理生理过程。
中国图书资料分类法分类号 R 743.9
The changes of VIP-like nerve fibers inmiddle cerebral artery focal cerebral ischemia in rat
, 百拇医药
Renming, Zhu Ke,huang Xusheng, Zhang Fengying, Liu Jexiao (Department of neurology, Generalhospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To study the role of vasoactive intestinal polypeptide-like(VIP-LI) nerve fibers innervatingmiddle cerebral artery (MCA)during cerebral ischemia.Methods: Themodel of rat focal cerebral ischemia was produced with the thread occlusion of themCA. Thedyamic changes of the number of VIP-LI nerve fibers inmCA were studied with the techniques of immunohistochemistry. Results: Thedenasity (the averaged number or nerve fibers in a unit area) of VIP-LI nerve fibers ofmCA in the ischemic sidedecreased 24hours after ischemia, returned to normal after 1 week, increased after 2 to 4 weeks and became normal againduring the 5th week.Conclusion: The cerebral artery innervating VIP-LI nerve fibersmay play a protective roleduring cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words focal cerebral ischemia; VIP; immunohistochemistry;middle cerebral artery; rat
脑血管的神经调节已得到广泛研究。脑血管主要由三类神经纤维支配：① 含去甲肾上腺素和神经肽Y的交感神经纤维；② 含乙酰胆碱、血管活性肠肽(VIP)和组异素的副交感神经丛；③ 含P物质、神经激肽A以及降钙素基因相关肽的感觉传入神经纤维〔1，2〕。在大鼠，起源于蝶腭神经节的VIP样神经纤维经筛孔入颅，支配脑底部血管且主要是同侧脑血管〔3〕。电刺激一侧神经可使同侧脑血流增加，切断一侧神经未见平静状态下脑血流出现变化〔4〕。切断一侧神经后，局灶脑缺血大鼠脑梗塞体积增加〔5〕。因此，支配脑血管之VIP样神经纤维很可能在脑缺血这一病理生理过程中起作用。本研究采用免疫组化法对大鼠局灶脑缺血后大脑中动脉近端血管壁上VIP样神经纤维的变化进行了动态观察，目的在于从形态学的角度来证实支配脑血管的VIP样神经纤维参与脑缺血这一病理生理过程。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物分组 选用成年SD大鼠 44 只，雌雄不限，体重 250～300g，在日常光照下自由饮水进食，随机分成 11 组，每组 4 只，其中A、B、C、D、E、F、G、H、I组动物分别在脑缺血后 12h、1d、2 和 3d 及 1 周、2 周、3 周、4 和 5 周处死，其余 2 组J和K组分别为正常对照组和假手术组。
1.2 局灶脑缺血模型的建立 用线栓法进行大脑中动脉的堵塞〔6〕，即经右侧颈总动脉结插入直径为 0.165mm 的尼龙线至同侧Willis环，进线长度以颈动脉分叉处为准至最远端为 1.7 cm，堵住该侧大脑中动脉入口。假手术组除不插线外余处理同前，正常对照组不行任何手术处理。
1.3 分别在上述脑缺血时间给动物以过量水合氯醛腹腔注射麻醉，经升主动脉灌注，先用 200ml 生理盐水，后用含 0.2% 苦味酸和 4% 多聚甲醛之 0.1mol/L PB 500ml。灌注完毕后取出鼠脑，在解剖显微镜下剥离出脑底动脉环及与其相连的各动脉。免疫组化采用漂浮染色，步骤为脑血管依次入： 3% 的过氧化氢 3min，10% 的山羊血清中孵育 10min，1% Tritox X-100 漂洗 10min，抗VIP抗体中(兔抗鼠，1∶3000 稀释) 4℃ 48h，生物素标记的二抗(抗兔IgG，1∶3000 稀释) 37℃ 孵育 30min，辣根过氧化酶标记的链卵白素中，37℃ 孵育 30min。上述各步骤之间均用PBS漂洗。最后用DBA呈色，标本上玻片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片及光镜下观察。
, 百拇医药
1.4 神经纤维计数 显微镜下测微尺单位面积(0.1×0.1mm2)内计数神经纤维数目，在大脑中动脉起始段任选 4 个单位面积。结果用平均数±标准差表示。
1.5 统计方法 各组动物自身左、右侧之神经纤维数目之比较采用Student t检验。
2 结果
支配大脑中动脉之VIP样神经纤维，在脑缺血后 12h 未见减少，1d～1 周内缺血侧较对侧少，脑缺血 2～4 周缺血侧较对侧增多，5 周恢复正常(附表)。
附表 脑缺血各组及对照组左右侧大脑中动脉VIP样神经纤维数目的比较(n=4，
±s)左
, http://www.100md.com
右
P
A
10.8±0.37
11.3±0.28
>0.05
B
11.3±0.22
6.2±0.21
<0.05
C
10.5±0.36
5.7±0.38
, 百拇医药
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D
11.6±0.47
6.4±0.65
<0.05
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11.6±0.58
11.4±0.45
>0.05
F
12.0±0.21
18.6±0.34
, 百拇医药 <0.05
G
12.6±0.12
20.4±0.37
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11.8±0.47
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I
10.8±0.32
11.3±0.25
>0.05
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11.4±0.28
12.1±0.15
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11.8±0.16
11.3±0.37
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3 讨论
支配脑血管的副交感神经含乙酰胆碱、VIP和组异素。在大鼠，起源于蝶腭神经节的节后副交感神经纤维经筛孔入颅，支配脑底部血管，且主要是同侧脑血管〔3〕。乙酰胆碱、VIP和组异素均具有扩血管作用。本研究采用大鼠局灶脑缺血模型，用免疫组化方法对局灶脑缺血大鼠大脑中动脉的VIP样神经纤维的变化进行了观察，发现缺血侧大脑中动脉管壁上VIP样神经纤维在缺血后先是下降，尔后又升高，最后恢复正常。1d～1 周内，血管上VIP样神经纤维下降的原因可能与神经末梢VIP大量释放有关。VIP作为扩血管物质在脑缺血的情况下释放出来以改善缺血区之血液循环〔7，8〕。 2～4 周后血管上VIP样神经纤维增多，推测与神经元内VIP合成的增多以及突触末梢再摄取的增加有关。到后期可能通过神经的自我调节功能而使血管上VIP样神经纤维恢复正常。本实验从形态学的角度为VIP样神经在脑缺血这一病理生理过程中起相应的反应提供了一定的证据。结论认为，该神经可能在脑缺血中对脑组织起保护作用。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Edvinsson L,harah, Uddman R. Retrograde tracing of nerve fibers to the ratmiddle cerebral artery with ture blue: colocalization withdifferent peptides. J Cereb Blood Flowmetab, 1989,9:212
[2]Edvinsson L, Uddman R, Juul R. Pepti-dergic innervation of the cerebral circulation. Role in subarachnoidhemorrhage inman. Neurosurg Rev, 1990,13:265
[3]Suzuki N,hardebo JE, Owman C et al. Origings and Pathways of Cerebrovascular Vasoactive Intestinal polypeptide-positive nerves in rat. J Cereb Blood Flowmetab, 1988,8:697
, http://www.100md.com
[4]Suzuki N,hardebo JE, Kahrstrom J et al. Selective electrical stimulation of Postganglionic cerebrovascular para-sympathetic nerve fibers originatiing from the sphenopalatine ganglion enhances cortical blood flow in the rat. J Cereb Blood Flowmetab, 1990,10:383
[5]Kanom,moskowitzmA, Yokotam.Parasympatheticdenervation of rat pial vessels significantly increases infarction volume followingmiddle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flowmetab, 1991,11:628
, 百拇医药
[6]Nagasawah, and Kogure K. Correlation between blood flow andhistologic changes in a new ratmodel ofmiddle cerebral artery occlusion. Stroke, 1989,20:1037
[7]Owman C. Peptidergic vasodilator nerves in the peripheral circrlation and in the vascular beds of theheart and brain. Blood Vessels, 1990,27:73
[8]Uemura Y, Sugimoto T, Okamoto S et al. Changes of neuropeptide immunoreactivity in cerebrovascular nerve fibers after experimentally produced SAH. J Neurosurg, 1987,66:741
(1998—09—23收稿，1998—11—17修回), 百拇医药