皮片低温(0～-40℃) 冷冻损伤的实验研究*
作者：贾晓明 Yang H Liss K McGam LE Tredget EE
单位：贾晓明：解放军304医院烧伤研究所临床部，中国北京 100037；Yang H Liss K McGam LE：加拿大阿尔伯塔大学医学院低温医学实验室 Tredget EE：加拿大阿尔伯塔大学医学院整形烧伤科
关键词：梯度冷冻；皮片；低温保藏
皮片低温 摘要 目的：验证皮片在 0～-40℃ 冷冻降温区域组织细胞损伤后的变化及其活力的改变。方法：依据McGam梯度冷冻实验原理与方法。结果：采用皮片在无低温保护剂的前题下，观察出 0～-40℃ 皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势以及两种活力指标(O2耗量及WST-1)活力的变化规律。结论：在 -20℃ 温度组时，两种不同降温速度条件下其活力指标达到平衡的趋势。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 322.99
The experimental study of freeing injury in split-thickness skin at 0～-40℃
Jian Xiaoming, Yang H, Liss K, McGann LE, Tredget EE (Burn institute, 304th Hospital of PLA, Beijing, 100037)
Abstract Objective:In order to improve the viability of cryopreserved splitthickness skin and get a higher survival rate.It is necessary of verify the changes of tissues and cells damaged during 0～-40℃ region so as to supply the experimental basis to alleviate freezing injury.Methods: The skin splits without cryoprotectant were utilized to observe the viability changes and optimal freezing rate according to the graded freezing theory and methods of McGann.Results: Compared by two methods (oxygen consumption and WST-1) during graded freezing of 0～-40℃ under two cooling rates.The tendency of viability changes of cryopreserved split-thickness skin of thaw group and LN2 group were observed.Conclusion:Viability of the cryopreserved split-thickness skin comes to balance under two cooling rates at -20℃.
, 百拇医药
Key words graded freezing; skin split; cryopreservation
随着当今低温生物学领域与技术的不断发展，低温冷冻储存组织细胞的冷冻损伤因素已被逐渐阐明。经典的低温生物学认为在 0～-40℃ 这一温度区域是目前组织细胞低温冷冻储存损伤的最危险区域〔1〕，因此为了提高皮片储存后良好的活力及其较高的植皮成活率，有必要在实验中来验证皮片在这一冷冻降温区域过程中组织细胞损伤后的变化及其活力的改变，为今后低温储皮减轻冷冻损伤提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源及采取方法 加拿大雄性小型猪，30 kg 左右，固定在手术台上，于气管内插管静脉全麻下，肥皂水刷洗后刮毛，0.5% 碘伏溶液消毒后铺无菌单，电动取皮机(美国产)沿猪腹背部两侧依次分别取下条片状断层皮片(0.3 mm 厚度)，尔后将取下的皮片浸泡于 1000 ml MEM溶液(Eagles Mininum Essential Medum, GIBCO公司)无菌罐内备用。
, http://www.100md.com
1.2 实验分组皮片冷冻步骤及活力检测 采用直径 10 mm，厚度为 0.3 mm 的猪皮片为实验材料，按照梯度冷冻(Graded Freezing, 0～-40℃)的实验方法，实验分为两大组：①梯度冷冻复温组(Thaw group)，②梯度冷冻液氮组(LN2 group)，每组又分为 0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃，共 7 个不同温度组，每个温度组标本数为 n=10。将每个实验温度组的每块皮片依次置入 1 ml MEM溶液的小塑料容皿内，分别按上述 7 个温度点将标本容皿置入甲醇冷冻剂冰浴下的可控冷冻降温仪(美国产)内，以 -1℃/min 速率，自 0℃ 开始依次降温冷冻。梯度冷冻复温组(Thaw group)按 7 个温度点冷冻后，分别取出标本在 37℃ 恒温水浴箱内复温(复温速率为 200℃/min)。而梯度冷冻液氮组(LN2 group)，在相应 7 个不同温度点时取出标本快速投入液氮内冷冻(冷冻速率为 -300℃/min) 10 min，取出标本放入 37℃ 水浴内复温，并将每组复温后皮片标本分别进行 O2 耗量(Orion Research Inc, Cambride, MA公司)测定，以及WST-1 (新型四氮唑盐方法，试剂购于Boehrigrer Mannheim公司)活力测定，两种活力指标均以 0℃ 复温组的数值为 100% 计，并分别除以各其它温度组的数值，乘以 100% 得出该温度组的活力百分率，其中 O2 耗量测定数值单位为 kPa/min，WST-1 数值为OD。
, 百拇医药
1.3 实验数据统计学处理 本实验中各组数据均以
±s表示，各实验组之间两两比较，采用t检验。P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异非常显著。
2 结果
2.1 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后 O2 耗量测定结果 本实验对皮片在 0～-40℃ 冷冻条件下梯度冷冻LN2 组和Thaw组进行了 O2 耗量活力指标的检测，结果见表 1。
表1 0～-40℃梯度冷冻后O2耗量活力测定(n=10，
±s，%)
, 百拇医药
℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
9.27±2.78**
100.00±5.67
32.13
-5
3.46±1.02**
88.52±13.18
14.37
, http://www.100md.com
-10
19.39±3.24**
71.66±9.06
12.15
-15
11.80±3.97**
41.31±12.13
5.17
-20
16.44±7.06**
25.96±5.98
, 百拇医药
2.30
-30
15.47±6.72
15.34±7.58
0.03
-40
8.01±3.97
14.33±6.83
1.79
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表1显示，其变化的规律为：① Thaw组自 -5℃ 起逐渐下降，随冷冻温度愈低，皮片活力均值百分率降低愈明显，至 -30℃ 时活力测定均值百分率降到谷值，并一直持续至 -40℃。② LN2组在 0℃、-5℃时活力均值百分率降低最显著，-10℃ 至 -20℃ 温度组，略有回升，-30℃、-40℃ 时，Thaw组与LN 组降低的活力均值百分率基本相同并无显著差异(P>0.05)。③ 两组活力比较(Thaw 组与LN2组) 0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 个不同温度组两两对应比较，t检验分析均有非常显著的差异，P均<0.01。-20℃ 组两组比较t检验有显著差异 P<0.05。说明在这 5 个不同温度组皮片冷冻的两种降温方式均存在着较大的影响与异同。
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2.2 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后WST-1 活力测定结果 实验中皮片 0～-40℃ 梯度冷冻后 LN2 组及Thaw组的WST-1 活力检测结果见表 2。
表2 0～-40℃梯度冷冻后WST-1活力测定(n=10，
±s，%)
℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
4.46±1.11**
, 百拇医药
100.00±4.57
45.53
-5
3.57±1.28**
100.00±3.57
56.82
-10
4.82±1.89**
84.38±18.75
28.59
-15
22.59±4.38**
, 百拇医药
53.22±10.49
6.03
-20
33.22±2.68
43.75±14.64
1.58
-30
11.25±1.56
11.25±4.24
0
-40
12.5±3.80
, 百拇医药
12.50±3.80
0
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表 2 显示出类似 O2 耗量活力变化的规律，但与 O2 耗量指标不同的是：① Thaw组 -5℃，-10℃ 温度组活力降低的幅度不如 O2 耗量指标显著，但也亦随着冷冻温度的降低，测定活力百分率均值愈下降，至 -30℃ 时达到谷值，并持续至 -40℃。② LN2 组 0℃，-5℃，-10℃ 组为最低，但自 -15℃ 起活力百分率均值有所升高，至 -20℃ 时，达到峰值，尔后迅速降低。③ 各温度组两两比较T检验，0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 组仍呈非常显著的差异，P均<0.01，其降低的趋势大致同 O2 耗量组，但 -20℃ 温度组两两比较未见显著差异 (P<0.05) 。
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3 讨论
生物组织样品冷冻保存的一个重要方面是冷冻速率，同一种细胞或组织，在相同的低温保存液中，以不同的降温速率进行冷冻，其复温后的存活率差异甚大。因此在不同的生物组织样品中均有一个存活率最高的冷冻速率范围，称之为“适宜冷冻速率”。在不同的细胞或组织中适宜的冷冻速率之间差异较大，有的可达数百倍。本实验正是利用皮片这一生物组织样品，来进行 0 ～-40℃ 梯度冷冻的损伤实验，以探讨皮片组织在 0 ～-40℃ 这一最常见温度区域中损伤后适宜冷冻速率范围。冷冻速率与细胞的损伤可归纳为两个方面：①在慢速冷冻过程中，随着冷冻温度的降低，冰晶先在细胞外液发生，尔后不断增大，游离水减少，细胞外液渗透压增高，致使细胞内水份外逸，细胞内渗透压升高，造成细胞“溶质性损害”；②在快速冷冻过程中，降温速度甚快，细胞内水份未及外逸即被冰结，此时细胞内外形成许多小结晶，除压迫性损伤外，在其复温过程如复温速率较慢，则会形成再结晶对细胞的损伤。“适宜冷冻速率”是对于某些组织细胞在降温过程中来说即不快又不慢的冷冻速率，实验上是溶质性损害与再结晶损伤均较少的冷冻速率，而表现出在此条件下其组织细胞的活力阈值最高。
, 百拇医药
本实验依据McGann〔2，3〕的梯度冷冻实验原理与方法，利用皮片的生物样品，在无低温保护剂的前题下，观察其变化的最适宜冷冻速率与其活力改变的状况。实验中在 0 ～-40℃ 两种降温速率的梯度冷冻过程中的两种活力指标(O2 耗量及WST-1 法)中均体现出，皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势。在两组不同冷冻速率的条件下，皮片检测的活力值改变，以 -20℃ 温度组时，LN2 与Thaw组最为接近，此时LN2 组的活力趋势达到峰值，也证实了在皮片经两种不同降温速率冷冻条件下，在 -20℃ 温度组区域时，组织细胞的溶质性损害与再结晶损伤两者达到了相对的平衡，因而表现出LN2 组活力值的升高，这也为今后我们进一步研究低温皮片冷冻损伤的机制奠定了实验基础。
* 加拿大国家医学研究理事会(The Medical Resarch Council of Canada, MRC)基金资助项目；留学回国人员医学科研启动基金，批准号 97H30
, 百拇医药
参考文献
[1]章崧英，王泽时，郑斯涌主编.实用低温医学.北京：科学出版社，1994.32
[2]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃ I.Holding temperature and time.Cryobiology, 1976,13:261
[3]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃.Ⅱ.Warming rate and concentration of dimethylsulfoxide.Cryobiology, 1976, 13:269
, 百拇医药
(1998—11—23收稿，1998—12—25修回)
皮片低温 (0～-40℃) 冷冻损伤的实验研究*
贾晓明 Yang H Liss K McGam LE Tredget EE
摘要 目的：验证皮片在 0～-40℃ 冷冻降温区域组织细胞损伤后的变化及其活力的改变。方法：依据McGam梯度冷冻实验原理与方法。结果：采用皮片在无低温保护剂的前题下，观察出 0～-40℃ 皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势以及两种活力指标(O2耗量及WST-1)活力的变化规律。结论：在 -20℃ 温度组时，两种不同降温速度条件下其活力指标达到平衡的趋势。
关键词 梯度冷冻；皮片；低温保藏
, 百拇医药 中国图书资料分类法分类号 R 322.99
The experimental study of freeing injury in split-thickness skin at 0～-40℃
Jian Xiaoming, Yang H, Liss K, McGann LE, Tredget EE (Burn institute, 304th Hospital of PLA, Beijing, 100037)
Abstract Objective:In order to improve the viability of cryopreserved splitthickness skin and get a higher survival rate.It is necessary of verify the changes of tissues and cells damaged during 0～-40℃ region so as to supply the experimental basis to alleviate freezing injury.Methods: The skin splits without cryoprotectant were utilized to observe the viability changes and optimal freezing rate according to the graded freezing theory and methods of McGann.Results: Compared by two methods (oxygen consumption and WST-1) during graded freezing of 0～-40℃ under two cooling rates.The tendency of viability changes of cryopreserved split-thickness skin of thaw group and LN2 group were observed.Conclusion:Viability of the cryopreserved split-thickness skin comes to balance under two cooling rates at -20℃.
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Key words graded freezing; skin split; cryopreservation
随着当今低温生物学领域与技术的不断发展，低温冷冻储存组织细胞的冷冻损伤因素已被逐渐阐明。经典的低温生物学认为在 0～-40℃ 这一温度区域是目前组织细胞低温冷冻储存损伤的最危险区域〔1〕，因此为了提高皮片储存后良好的活力及其较高的植皮成活率，有必要在实验中来验证皮片在这一冷冻降温区域过程中组织细胞损伤后的变化及其活力的改变，为今后低温储皮减轻冷冻损伤提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源及采取方法 加拿大雄性小型猪，30 kg 左右，固定在手术台上，于气管内插管静脉全麻下，肥皂水刷洗后刮毛，0.5% 碘伏溶液消毒后铺无菌单，电动取皮机(美国产)沿猪腹背部两侧依次分别取下条片状断层皮片(0.3 mm 厚度)，尔后将取下的皮片浸泡于 1000 ml MEM溶液(Eagles Mininum Essential Medum, GIBCO公司)无菌罐内备用。
, 百拇医药
1.2 实验分组皮片冷冻步骤及活力检测 采用直径 10 mm，厚度为 0.3 mm 的猪皮片为实验材料，按照梯度冷冻(Graded Freezing, 0～-40℃)的实验方法，实验分为两大组：①梯度冷冻复温组(Thaw group)，②梯度冷冻液氮组(LN2 group)，每组又分为 0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃，共 7 个不同温度组，每个温度组标本数为 n=10。将每个实验温度组的每块皮片依次置入 1 ml MEM溶液的小塑料容皿内，分别按上述 7 个温度点将标本容皿置入甲醇冷冻剂冰浴下的可控冷冻降温仪(美国产)内，以 -1℃/min 速率，自 0℃ 开始依次降温冷冻。梯度冷冻复温组(Thaw group)按 7 个温度点冷冻后，分别取出标本在 37℃ 恒温水浴箱内复温(复温速率为 200℃/min)。而梯度冷冻液氮组(LN2 group)，在相应 7 个不同温度点时取出标本快速投入液氮内冷冻(冷冻速率为 -300℃/min) 10 min，取出标本放入 37℃ 水浴内复温，并将每组复温后皮片标本分别进行 O2 耗量(Orion Research Inc, Cambride, MA公司)测定，以及WST-1 (新型四氮唑盐方法，试剂购于Boehrigrer Mannheim公司)活力测定，两种活力指标均以 0℃ 复温组的数值为 100% 计，并分别除以各其它温度组的数值，乘以 100% 得出该温度组的活力百分率，其中 O2 耗量测定数值单位为 kPa/min，WST-1 数值为OD。
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1.3 实验数据统计学处理 本实验中各组数据均以±s表示，各实验组之间两两比较，采用t检验。P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异非常显著。
2 结果
2.1 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后 O2 耗量测定结果 本实验对皮片在 0～-40℃ 冷冻条件下梯度冷冻LN2 组和Thaw组进行了 O2 耗量活力指标的检测，结果见表 1。
表1 0～-40℃梯度冷冻后O2耗量活力测定(n=10，±s，%)
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℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
9.27±2.78**
100.00±5.67
32.13
-5
3.46±1.02**
88.52±13.18
14.37
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19.39±3.24**
71.66±9.06
12.15
-15
11.80±3.97**
41.31±12.13
5.17
-20
16.44±7.06**
25.96±5.98
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2.30
-30
15.47±6.72
15.34±7.58
0.03
-40
8.01±3.97
14.33±6.83
1.79
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表1显示，其变化的规律为：① Thaw组自 -5℃ 起逐渐下降，随冷冻温度愈低，皮片活力均值百分率降低愈明显，至 -30℃ 时活力测定均值百分率降到谷值，并一直持续至 -40℃。② LN2组在 0℃、-5℃时活力均值百分率降低最显著，-10℃ 至 -20℃ 温度组，略有回升，-30℃、-40℃ 时，Thaw组与LN 组降低的活力均值百分率基本相同并无显著差异(P>0.05)。③ 两组活力比较(Thaw 组与LN2组) 0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 个不同温度组两两对应比较，t检验分析均有非常显著的差异，P均<0.01。-20℃ 组两组比较t检验有显著差异 P<0.05。说明在这 5 个不同温度组皮片冷冻的两种降温方式均存在着较大的影响与异同。
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2.2 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后WST-1 活力测定结果 实验中皮片 0～-40℃ 梯度冷冻后 LN2 组及Thaw组的WST-1 活力检测结果见表 2。
表2 0～-40℃梯度冷冻后WST-1活力测定(n=10，±s，%)
℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
4.46±1.11**
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100.00±4.57
45.53
-5
3.57±1.28**
100.00±3.57
56.82
-10
4.82±1.89**
84.38±18.75
28.59
-15
22.59±4.38**
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53.22±10.49
6.03
-20
33.22±2.68
43.75±14.64
1.58
-30
11.25±1.56
11.25±4.24
0
-40
12.5±3.80
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12.50±3.80
0
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表 2 显示出类似 O2 耗量活力变化的规律，但与 O2 耗量指标不同的是：① Thaw组 -5℃，-10℃ 温度组活力降低的幅度不如 O2 耗量指标显著，但也亦随着冷冻温度的降低，测定活力百分率均值愈下降，至 -30℃ 时达到谷值，并持续至 -40℃。② LN2 组 0℃，-5℃，-10℃ 组为最低，但自 -15℃ 起活力百分率均值有所升高，至 -20℃ 时，达到峰值，尔后迅速降低。③ 各温度组两两比较T检验，0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 组仍呈非常显著的差异，P均<0.01，其降低的趋势大致同 O2 耗量组，但 -20℃ 温度组两两比较未见显著差异 (P<0.05) 。
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3 讨论
生物组织样品冷冻保存的一个重要方面是冷冻速率，同一种细胞或组织，在相同的低温保存液中，以不同的降温速率进行冷冻，其复温后的存活率差异甚大。因此在不同的生物组织样品中均有一个存活率最高的冷冻速率范围，称之为“适宜冷冻速率”。在不同的细胞或组织中适宜的冷冻速率之间差异较大，有的可达数百倍。本实验正是利用皮片这一生物组织样品，来进行 0 ～-40℃ 梯度冷冻的损伤实验，以探讨皮片组织在 0 ～-40℃ 这一最常见温度区域中损伤后适宜冷冻速率范围。冷冻速率与细胞的损伤可归纳为两个方面：①在慢速冷冻过程中，随着冷冻温度的降低，冰晶先在细胞外液发生，尔后不断增大，游离水减少，细胞外液渗透压增高，致使细胞内水份外逸，细胞内渗透压升高，造成细胞“溶质性损害”；②在快速冷冻过程中，降温速度甚快，细胞内水份未及外逸即被冰结，此时细胞内外形成许多小结晶，除压迫性损伤外，在其复温过程如复温速率较慢，则会形成再结晶对细胞的损伤。“适宜冷冻速率”是对于某些组织细胞在降温过程中来说即不快又不慢的冷冻速率，实验上是溶质性损害与再结晶损伤均较少的冷冻速率，而表现出在此条件下其组织细胞的活力阈值最高。
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本实验依据McGann〔2，3〕的梯度冷冻实验原理与方法，利用皮片的生物样品，在无低温保护剂的前题下，观察其变化的最适宜冷冻速率与其活力改变的状况。实验中在 0 ～-40℃ 两种降温速率的梯度冷冻过程中的两种活力指标(O2 耗量及WST-1 法)中均体现出，皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势。在两组不同冷冻速率的条件下，皮片检测的活力值改变，以 -20℃ 温度组时，LN2 与Thaw组最为接近，此时LN2 组的活力趋势达到峰值，也证实了在皮片经两种不同降温速率冷冻条件下，在 -20℃ 温度组区域时，组织细胞的溶质性损害与再结晶损伤两者达到了相对的平衡，因而表现出LN2 组活力值的升高，这也为今后我们进一步研究低温皮片冷冻损伤的机制奠定了实验基础。
* 加拿大国家医学研究理事会(The Medical Resarch Council of Canada, MRC)基金资助项目；留学回国人员医学科研启动基金，批准号 97H30
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作者单位：贾晓明：解放军304医院烧伤研究所临床部，中国北京 100037
Yang H Liss K McGam LE：加拿大阿尔伯塔大学医学院低温医学实验室
Tredget EE：加拿大阿尔伯塔大学医学院整形烧伤科
参考文献
[1]章崧英，王泽时，郑斯涌主编.实用低温医学.北京：科学出版社，1994.32
[2]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃ I.Holding temperature and time.Cryobiology, 1976,13:261
[3]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃.Ⅱ.Warming rate and concentration of dimethylsulfoxide.Cryobiology, 1976, 13:269
(1998—11—23收稿，1998—12—25修回), 百拇医药
单位：贾晓明：解放军304医院烧伤研究所临床部，中国北京 100037；Yang H Liss K McGam LE：加拿大阿尔伯塔大学医学院低温医学实验室 Tredget EE：加拿大阿尔伯塔大学医学院整形烧伤科
关键词：梯度冷冻；皮片；低温保藏
皮片低温 摘要 目的：验证皮片在 0～-40℃ 冷冻降温区域组织细胞损伤后的变化及其活力的改变。方法：依据McGam梯度冷冻实验原理与方法。结果：采用皮片在无低温保护剂的前题下，观察出 0～-40℃ 皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势以及两种活力指标(O2耗量及WST-1)活力的变化规律。结论：在 -20℃ 温度组时，两种不同降温速度条件下其活力指标达到平衡的趋势。
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中国图书资料分类法分类号 R 322.99
The experimental study of freeing injury in split-thickness skin at 0～-40℃
Jian Xiaoming, Yang H, Liss K, McGann LE, Tredget EE (Burn institute, 304th Hospital of PLA, Beijing, 100037)
Abstract Objective:In order to improve the viability of cryopreserved splitthickness skin and get a higher survival rate.It is necessary of verify the changes of tissues and cells damaged during 0～-40℃ region so as to supply the experimental basis to alleviate freezing injury.Methods: The skin splits without cryoprotectant were utilized to observe the viability changes and optimal freezing rate according to the graded freezing theory and methods of McGann.Results: Compared by two methods (oxygen consumption and WST-1) during graded freezing of 0～-40℃ under two cooling rates.The tendency of viability changes of cryopreserved split-thickness skin of thaw group and LN2 group were observed.Conclusion:Viability of the cryopreserved split-thickness skin comes to balance under two cooling rates at -20℃.
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Key words graded freezing; skin split; cryopreservation
随着当今低温生物学领域与技术的不断发展，低温冷冻储存组织细胞的冷冻损伤因素已被逐渐阐明。经典的低温生物学认为在 0～-40℃ 这一温度区域是目前组织细胞低温冷冻储存损伤的最危险区域〔1〕，因此为了提高皮片储存后良好的活力及其较高的植皮成活率，有必要在实验中来验证皮片在这一冷冻降温区域过程中组织细胞损伤后的变化及其活力的改变，为今后低温储皮减轻冷冻损伤提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源及采取方法 加拿大雄性小型猪，30 kg 左右，固定在手术台上，于气管内插管静脉全麻下，肥皂水刷洗后刮毛，0.5% 碘伏溶液消毒后铺无菌单，电动取皮机(美国产)沿猪腹背部两侧依次分别取下条片状断层皮片(0.3 mm 厚度)，尔后将取下的皮片浸泡于 1000 ml MEM溶液(Eagles Mininum Essential Medum, GIBCO公司)无菌罐内备用。
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1.2 实验分组皮片冷冻步骤及活力检测 采用直径 10 mm，厚度为 0.3 mm 的猪皮片为实验材料，按照梯度冷冻(Graded Freezing, 0～-40℃)的实验方法，实验分为两大组：①梯度冷冻复温组(Thaw group)，②梯度冷冻液氮组(LN2 group)，每组又分为 0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃，共 7 个不同温度组，每个温度组标本数为 n=10。将每个实验温度组的每块皮片依次置入 1 ml MEM溶液的小塑料容皿内，分别按上述 7 个温度点将标本容皿置入甲醇冷冻剂冰浴下的可控冷冻降温仪(美国产)内，以 -1℃/min 速率，自 0℃ 开始依次降温冷冻。梯度冷冻复温组(Thaw group)按 7 个温度点冷冻后，分别取出标本在 37℃ 恒温水浴箱内复温(复温速率为 200℃/min)。而梯度冷冻液氮组(LN2 group)，在相应 7 个不同温度点时取出标本快速投入液氮内冷冻(冷冻速率为 -300℃/min) 10 min，取出标本放入 37℃ 水浴内复温，并将每组复温后皮片标本分别进行 O2 耗量(Orion Research Inc, Cambride, MA公司)测定，以及WST-1 (新型四氮唑盐方法，试剂购于Boehrigrer Mannheim公司)活力测定，两种活力指标均以 0℃ 复温组的数值为 100% 计，并分别除以各其它温度组的数值，乘以 100% 得出该温度组的活力百分率，其中 O2 耗量测定数值单位为 kPa/min，WST-1 数值为OD。
, 百拇医药
1.3 实验数据统计学处理 本实验中各组数据均以
±s表示，各实验组之间两两比较，采用t检验。P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异非常显著。2 结果
2.1 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后 O2 耗量测定结果 本实验对皮片在 0～-40℃ 冷冻条件下梯度冷冻LN2 组和Thaw组进行了 O2 耗量活力指标的检测，结果见表 1。
表1 0～-40℃梯度冷冻后O2耗量活力测定(n=10，
±s，%), 百拇医药
℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
9.27±2.78**
100.00±5.67
32.13
-5
3.46±1.02**
88.52±13.18
14.37
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-10
19.39±3.24**
71.66±9.06
12.15
-15
11.80±3.97**
41.31±12.13
5.17
-20
16.44±7.06**
25.96±5.98
, 百拇医药
2.30
-30
15.47±6.72
15.34±7.58
0.03
-40
8.01±3.97
14.33±6.83
1.79
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表1显示，其变化的规律为：① Thaw组自 -5℃ 起逐渐下降，随冷冻温度愈低，皮片活力均值百分率降低愈明显，至 -30℃ 时活力测定均值百分率降到谷值，并一直持续至 -40℃。② LN2组在 0℃、-5℃时活力均值百分率降低最显著，-10℃ 至 -20℃ 温度组，略有回升，-30℃、-40℃ 时，Thaw组与LN 组降低的活力均值百分率基本相同并无显著差异(P>0.05)。③ 两组活力比较(Thaw 组与LN2组) 0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 个不同温度组两两对应比较，t检验分析均有非常显著的差异，P均<0.01。-20℃ 组两组比较t检验有显著差异 P<0.05。说明在这 5 个不同温度组皮片冷冻的两种降温方式均存在着较大的影响与异同。
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2.2 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后WST-1 活力测定结果 实验中皮片 0～-40℃ 梯度冷冻后 LN2 组及Thaw组的WST-1 活力检测结果见表 2。
表2 0～-40℃梯度冷冻后WST-1活力测定(n=10，
±s，%)℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
4.46±1.11**
, 百拇医药
100.00±4.57
45.53
-5
3.57±1.28**
100.00±3.57
56.82
-10
4.82±1.89**
84.38±18.75
28.59
-15
22.59±4.38**
, 百拇医药
53.22±10.49
6.03
-20
33.22±2.68
43.75±14.64
1.58
-30
11.25±1.56
11.25±4.24
0
-40
12.5±3.80
, 百拇医药
12.50±3.80
0
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表 2 显示出类似 O2 耗量活力变化的规律，但与 O2 耗量指标不同的是：① Thaw组 -5℃，-10℃ 温度组活力降低的幅度不如 O2 耗量指标显著，但也亦随着冷冻温度的降低，测定活力百分率均值愈下降，至 -30℃ 时达到谷值，并持续至 -40℃。② LN2 组 0℃，-5℃，-10℃ 组为最低，但自 -15℃ 起活力百分率均值有所升高，至 -20℃ 时，达到峰值，尔后迅速降低。③ 各温度组两两比较T检验，0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 组仍呈非常显著的差异，P均<0.01，其降低的趋势大致同 O2 耗量组，但 -20℃ 温度组两两比较未见显著差异 (P<0.05) 。
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3 讨论
生物组织样品冷冻保存的一个重要方面是冷冻速率，同一种细胞或组织，在相同的低温保存液中，以不同的降温速率进行冷冻，其复温后的存活率差异甚大。因此在不同的生物组织样品中均有一个存活率最高的冷冻速率范围，称之为“适宜冷冻速率”。在不同的细胞或组织中适宜的冷冻速率之间差异较大，有的可达数百倍。本实验正是利用皮片这一生物组织样品，来进行 0 ～-40℃ 梯度冷冻的损伤实验，以探讨皮片组织在 0 ～-40℃ 这一最常见温度区域中损伤后适宜冷冻速率范围。冷冻速率与细胞的损伤可归纳为两个方面：①在慢速冷冻过程中，随着冷冻温度的降低，冰晶先在细胞外液发生，尔后不断增大，游离水减少，细胞外液渗透压增高，致使细胞内水份外逸，细胞内渗透压升高，造成细胞“溶质性损害”；②在快速冷冻过程中，降温速度甚快，细胞内水份未及外逸即被冰结，此时细胞内外形成许多小结晶，除压迫性损伤外，在其复温过程如复温速率较慢，则会形成再结晶对细胞的损伤。“适宜冷冻速率”是对于某些组织细胞在降温过程中来说即不快又不慢的冷冻速率，实验上是溶质性损害与再结晶损伤均较少的冷冻速率，而表现出在此条件下其组织细胞的活力阈值最高。
, 百拇医药
本实验依据McGann〔2，3〕的梯度冷冻实验原理与方法，利用皮片的生物样品，在无低温保护剂的前题下，观察其变化的最适宜冷冻速率与其活力改变的状况。实验中在 0 ～-40℃ 两种降温速率的梯度冷冻过程中的两种活力指标(O2 耗量及WST-1 法)中均体现出，皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势。在两组不同冷冻速率的条件下，皮片检测的活力值改变，以 -20℃ 温度组时，LN2 与Thaw组最为接近，此时LN2 组的活力趋势达到峰值，也证实了在皮片经两种不同降温速率冷冻条件下，在 -20℃ 温度组区域时，组织细胞的溶质性损害与再结晶损伤两者达到了相对的平衡，因而表现出LN2 组活力值的升高，这也为今后我们进一步研究低温皮片冷冻损伤的机制奠定了实验基础。
* 加拿大国家医学研究理事会(The Medical Resarch Council of Canada, MRC)基金资助项目；留学回国人员医学科研启动基金，批准号 97H30
, 百拇医药
参考文献
[1]章崧英，王泽时，郑斯涌主编.实用低温医学.北京：科学出版社，1994.32
[2]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃ I.Holding temperature and time.Cryobiology, 1976,13:261
[3]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃.Ⅱ.Warming rate and concentration of dimethylsulfoxide.Cryobiology, 1976, 13:269
, 百拇医药
(1998—11—23收稿，1998—12—25修回)
皮片低温 (0～-40℃) 冷冻损伤的实验研究*
贾晓明 Yang H Liss K McGam LE Tredget EE
摘要 目的：验证皮片在 0～-40℃ 冷冻降温区域组织细胞损伤后的变化及其活力的改变。方法：依据McGam梯度冷冻实验原理与方法。结果：采用皮片在无低温保护剂的前题下，观察出 0～-40℃ 皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势以及两种活力指标(O2耗量及WST-1)活力的变化规律。结论：在 -20℃ 温度组时，两种不同降温速度条件下其活力指标达到平衡的趋势。
关键词 梯度冷冻；皮片；低温保藏
, 百拇医药 中国图书资料分类法分类号 R 322.99
The experimental study of freeing injury in split-thickness skin at 0～-40℃
Jian Xiaoming, Yang H, Liss K, McGann LE, Tredget EE (Burn institute, 304th Hospital of PLA, Beijing, 100037)
Abstract Objective:In order to improve the viability of cryopreserved splitthickness skin and get a higher survival rate.It is necessary of verify the changes of tissues and cells damaged during 0～-40℃ region so as to supply the experimental basis to alleviate freezing injury.Methods: The skin splits without cryoprotectant were utilized to observe the viability changes and optimal freezing rate according to the graded freezing theory and methods of McGann.Results: Compared by two methods (oxygen consumption and WST-1) during graded freezing of 0～-40℃ under two cooling rates.The tendency of viability changes of cryopreserved split-thickness skin of thaw group and LN2 group were observed.Conclusion:Viability of the cryopreserved split-thickness skin comes to balance under two cooling rates at -20℃.
, 百拇医药
Key words graded freezing; skin split; cryopreservation
随着当今低温生物学领域与技术的不断发展，低温冷冻储存组织细胞的冷冻损伤因素已被逐渐阐明。经典的低温生物学认为在 0～-40℃ 这一温度区域是目前组织细胞低温冷冻储存损伤的最危险区域〔1〕，因此为了提高皮片储存后良好的活力及其较高的植皮成活率，有必要在实验中来验证皮片在这一冷冻降温区域过程中组织细胞损伤后的变化及其活力的改变，为今后低温储皮减轻冷冻损伤提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源及采取方法 加拿大雄性小型猪，30 kg 左右，固定在手术台上，于气管内插管静脉全麻下，肥皂水刷洗后刮毛，0.5% 碘伏溶液消毒后铺无菌单，电动取皮机(美国产)沿猪腹背部两侧依次分别取下条片状断层皮片(0.3 mm 厚度)，尔后将取下的皮片浸泡于 1000 ml MEM溶液(Eagles Mininum Essential Medum, GIBCO公司)无菌罐内备用。
, 百拇医药
1.2 实验分组皮片冷冻步骤及活力检测 采用直径 10 mm，厚度为 0.3 mm 的猪皮片为实验材料，按照梯度冷冻(Graded Freezing, 0～-40℃)的实验方法，实验分为两大组：①梯度冷冻复温组(Thaw group)，②梯度冷冻液氮组(LN2 group)，每组又分为 0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃，共 7 个不同温度组，每个温度组标本数为 n=10。将每个实验温度组的每块皮片依次置入 1 ml MEM溶液的小塑料容皿内，分别按上述 7 个温度点将标本容皿置入甲醇冷冻剂冰浴下的可控冷冻降温仪(美国产)内，以 -1℃/min 速率，自 0℃ 开始依次降温冷冻。梯度冷冻复温组(Thaw group)按 7 个温度点冷冻后，分别取出标本在 37℃ 恒温水浴箱内复温(复温速率为 200℃/min)。而梯度冷冻液氮组(LN2 group)，在相应 7 个不同温度点时取出标本快速投入液氮内冷冻(冷冻速率为 -300℃/min) 10 min，取出标本放入 37℃ 水浴内复温，并将每组复温后皮片标本分别进行 O2 耗量(Orion Research Inc, Cambride, MA公司)测定，以及WST-1 (新型四氮唑盐方法，试剂购于Boehrigrer Mannheim公司)活力测定，两种活力指标均以 0℃ 复温组的数值为 100% 计，并分别除以各其它温度组的数值，乘以 100% 得出该温度组的活力百分率，其中 O2 耗量测定数值单位为 kPa/min，WST-1 数值为OD。
, 百拇医药
1.3 实验数据统计学处理 本实验中各组数据均以
±s表示，各实验组之间两两比较，采用t检验。P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异非常显著。2 结果
2.1 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后 O2 耗量测定结果 本实验对皮片在 0～-40℃ 冷冻条件下梯度冷冻LN2 组和Thaw组进行了 O2 耗量活力指标的检测，结果见表 1。
表1 0～-40℃梯度冷冻后O2耗量活力测定(n=10，
±s，%), 百拇医药
℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
9.27±2.78**
100.00±5.67
32.13
-5
3.46±1.02**
88.52±13.18
14.37
, http://www.100md.com
-10
19.39±3.24**
71.66±9.06
12.15
-15
11.80±3.97**
41.31±12.13
5.17
-20
16.44±7.06**
25.96±5.98
, http://www.100md.com
2.30
-30
15.47±6.72
15.34±7.58
0.03
-40
8.01±3.97
14.33±6.83
1.79
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表1显示，其变化的规律为：① Thaw组自 -5℃ 起逐渐下降，随冷冻温度愈低，皮片活力均值百分率降低愈明显，至 -30℃ 时活力测定均值百分率降到谷值，并一直持续至 -40℃。② LN2组在 0℃、-5℃时活力均值百分率降低最显著，-10℃ 至 -20℃ 温度组，略有回升，-30℃、-40℃ 时，Thaw组与LN 组降低的活力均值百分率基本相同并无显著差异(P>0.05)。③ 两组活力比较(Thaw 组与LN2组) 0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 个不同温度组两两对应比较，t检验分析均有非常显著的差异，P均<0.01。-20℃ 组两组比较t检验有显著差异 P<0.05。说明在这 5 个不同温度组皮片冷冻的两种降温方式均存在着较大的影响与异同。
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2.2 0～-40℃ 皮片梯度冷冻后WST-1 活力测定结果 实验中皮片 0～-40℃ 梯度冷冻后 LN2 组及Thaw组的WST-1 活力检测结果见表 2。
表2 0～-40℃梯度冷冻后WST-1活力测定(n=10，
±s，%)℃
梯度冷冻液氮组
梯度冷冻复温组
t
0
4.46±1.11**
, 百拇医药
100.00±4.57
45.53
-5
3.57±1.28**
100.00±3.57
56.82
-10
4.82±1.89**
84.38±18.75
28.59
-15
22.59±4.38**
, http://www.100md.com
53.22±10.49
6.03
-20
33.22±2.68
43.75±14.64
1.58
-30
11.25±1.56
11.25±4.24
0
-40
12.5±3.80
, 百拇医药
12.50±3.80
0
n=10，* P<0.05，** P<0.01
表 2 显示出类似 O2 耗量活力变化的规律，但与 O2 耗量指标不同的是：① Thaw组 -5℃，-10℃ 温度组活力降低的幅度不如 O2 耗量指标显著，但也亦随着冷冻温度的降低，测定活力百分率均值愈下降，至 -30℃ 时达到谷值，并持续至 -40℃。② LN2 组 0℃，-5℃，-10℃ 组为最低，但自 -15℃ 起活力百分率均值有所升高，至 -20℃ 时，达到峰值，尔后迅速降低。③ 各温度组两两比较T检验，0℃、-5℃、-10℃、-15℃ 4 组仍呈非常显著的差异，P均<0.01，其降低的趋势大致同 O2 耗量组，但 -20℃ 温度组两两比较未见显著差异 (P<0.05) 。
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3 讨论
生物组织样品冷冻保存的一个重要方面是冷冻速率，同一种细胞或组织，在相同的低温保存液中，以不同的降温速率进行冷冻，其复温后的存活率差异甚大。因此在不同的生物组织样品中均有一个存活率最高的冷冻速率范围，称之为“适宜冷冻速率”。在不同的细胞或组织中适宜的冷冻速率之间差异较大，有的可达数百倍。本实验正是利用皮片这一生物组织样品，来进行 0 ～-40℃ 梯度冷冻的损伤实验，以探讨皮片组织在 0 ～-40℃ 这一最常见温度区域中损伤后适宜冷冻速率范围。冷冻速率与细胞的损伤可归纳为两个方面：①在慢速冷冻过程中，随着冷冻温度的降低，冰晶先在细胞外液发生，尔后不断增大，游离水减少，细胞外液渗透压增高，致使细胞内水份外逸，细胞内渗透压升高，造成细胞“溶质性损害”；②在快速冷冻过程中，降温速度甚快，细胞内水份未及外逸即被冰结，此时细胞内外形成许多小结晶，除压迫性损伤外，在其复温过程如复温速率较慢，则会形成再结晶对细胞的损伤。“适宜冷冻速率”是对于某些组织细胞在降温过程中来说即不快又不慢的冷冻速率，实验上是溶质性损害与再结晶损伤均较少的冷冻速率，而表现出在此条件下其组织细胞的活力阈值最高。
, 百拇医药
本实验依据McGann〔2，3〕的梯度冷冻实验原理与方法，利用皮片的生物样品，在无低温保护剂的前题下，观察其变化的最适宜冷冻速率与其活力改变的状况。实验中在 0 ～-40℃ 两种降温速率的梯度冷冻过程中的两种活力指标(O2 耗量及WST-1 法)中均体现出，皮片冷冻在Thaw组与LN2组之间的变化趋势。在两组不同冷冻速率的条件下，皮片检测的活力值改变，以 -20℃ 温度组时，LN2 与Thaw组最为接近，此时LN2 组的活力趋势达到峰值，也证实了在皮片经两种不同降温速率冷冻条件下，在 -20℃ 温度组区域时，组织细胞的溶质性损害与再结晶损伤两者达到了相对的平衡，因而表现出LN2 组活力值的升高，这也为今后我们进一步研究低温皮片冷冻损伤的机制奠定了实验基础。
* 加拿大国家医学研究理事会(The Medical Resarch Council of Canada, MRC)基金资助项目；留学回国人员医学科研启动基金，批准号 97H30
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作者单位：贾晓明：解放军304医院烧伤研究所临床部，中国北京 100037
Yang H Liss K McGam LE：加拿大阿尔伯塔大学医学院低温医学实验室
Tredget EE：加拿大阿尔伯塔大学医学院整形烧伤科
参考文献
[1]章崧英，王泽时，郑斯涌主编.实用低温医学.北京：科学出版社，1994.32
[2]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃ I.Holding temperature and time.Cryobiology, 1976,13:261
[3]McGann LE, Farrant J.Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196℃.Ⅱ.Warming rate and concentration of dimethylsulfoxide.Cryobiology, 1976, 13:269
(1998—11—23收稿，1998—12—25修回), 百拇医药