性激素对喉癌细胞株Hep-2 ras基因表达的影响
作者：石 梅 于雪艳 田克力 卢红霞 蒋力颖 王廷础
单位：石梅 卢红霞 王廷础 卫生部耳鼻喉科学重点实验室；于雪艳 田克力 蒋力颖 山东医科大学生化教研室
关键词：喉肿瘤；Hep-2；细胞株；雌二醇；睾酮；基因；RAS
山东医大基础医学院学报990201 内容提要 采用葡聚糖包被活性炭技术处理小牛血清,培养喉癌细胞株Hep-2,观察该细胞ras基因表达对睾酮(T)、17β-雌二醇的剂量依赖性。结果表明:该细胞为性激素敏感细胞,当17β-雌二醇浓度为10-8mol/L 时对ras基因的表达有明显的抑制作用,表达率为11.11%;而睾酮浓度为10-9时对ras基因的表达率增至44.44%。此结论为喉癌的内分泌治疗提供了理论基础。
EFFECTION OF SEXUAL HORMONES ON EXPRESSION OF ras
, http://www.100md.com
ONCOGENE OF LARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE Hep-2 IN VITRO
Shi Mei1 Yu Xueyan2 Tian Keli2,et al
(1The State Otolaryngology Institute of P.R.China 2 Shandong Mdical University)
Abstract Laryngeal carcinoma cell line Hep-2 was cultivated in vitro with DCC-FCS which was treated by dextran-coated charcoal technique.The does-dependence of Hep-2 to 17-beta-estradiol and testosterone was explored. The results showed that Hep-2 cell line is sexual-sensitive cell line.When the concentration of testosterone is 10-9mol/L,the expression rate of ras oncogene increased to 44.44%;on the contrary,when the concentration of 17-beta-estradiol is 10-8mol/L,the inhibition effect on expression rate of ras oncogene is remarkable,the expression rate decreased to 11.11%.This study offered the evidences of the endocrine therapy for laryngeal carcinoma.
, 百拇医药
Key words Laryngeal neoplasms; Hep-2 cell line;Estradiol; Testosterone; Genes,RAS
肿瘤发生的分子生物学研究表明:ras基因家族在细胞癌变中起重要作用,ras基因的扩增使其编码的蛋白质P21过量生成,持续不断地将生长信号传入细胞内,从而导致细胞的转化与恶变[1]。研究发现,ras基因的过量表达同喉癌的发生发展密切相关[2]。喉癌是非生殖系统中与性激素关系极密切的恶性肿瘤,赵小冬[3]等也证实特定浓度的睾酮 对Hep-2 细胞的体外增殖有促进作用。因此,有必要就性激素对喉癌基因ras的表达影响进行探讨,以了解内分泌治疗的有效性。有关此方面的研究国内外尚未见报道。
1 资料与方法
1.1 细胞和试剂 本实验所用的喉癌细胞株Hep-2 由山东医学科学院免疫研究室提供,小牛血清(FCS)也系该室提供。培养基RPMI1640为美国Life Technologies Inc. 产品,含10%～15%灭活血清(葡聚糖包被活性炭处理 DCC-FCS)及2mmol/L青霉素及链霉素。睾酮(T)、17-β雌二醇(17β-ER)均为SIGMA公司产品,P21免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 取指数生长期细胞,用DCC-FCS 培养基配置单细胞悬液,每毫升含细胞1.5×104,每瓶接种2ml,将灭菌的盖玻片置入瓶内。实验组48h更换含性激素的培养基,睾酮、17-β雌二醇在培养基中的浓度为10-10～10-8mol/L,对照组加入乙醇,终浓度小于0.01%。此后隔日更换含有相同激素和浓度的培养基,对照组更换含有相同浓度乙醇的培养基,每一激素的每一浓度均有3个平行样。上述实验重复3次。
1.3 免疫组化 细胞培养5d后,取出盖玻片用福尔马林固定,用SABC法检测激素处理细胞及对照细胞的P21阳性率,阴性对照为喉息肉组织切片。
1.4 结果判断 依照阳性细胞百分比及着色强度综合积分做半定量分析,其中细胞阳性率:0为0分,25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,75%为4分。着色强度:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两种标准相加为最后结果:0分为(-),2～3分为(±),4～5分为(+),6～7分为(++),所得数据经χ2检验,进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结 果
喉息肉组织切片为阴性表达。P21阳性着色定位于细胞浆,阳性细胞浆内呈弥漫性细小颗粒状。未经激素处理的Hep-2 细胞,其P21的阳性率为22.22%。17β-雌二醇的浓度为10-8mol/L时,P21的表达率为11.11%,同添加睾酮(T)培养的细胞中P21的表达率呈显著性差异(P<0.05),同17β-雌二醇浓度为10-9、10-10mol/L时差异有高度显著性(P<0.01),而睾酮对细胞中P21阳性率的影响不显著,并且P21表达也不呈现浓度梯度依赖性。
睾酮能使ras基因表达强度增强,当浓度为10-8mol/L时,有22.22%的细胞表达强度为(++),但在其他浓度时,这种作用不明显。性激素对P21表达的影响见表1。
3 讨 论
, http://www.100md.com
类固醇类激素与某些肿瘤的关系十分密切。喉是第二性征器管,是性激素的靶器管。研究表明,喉鳞状上皮细胞在恶性转化过程中可能与雌激素受体有关。Robin等[4]还证明10-9mol/L浓度睾酮可促进喉癌细胞体外增殖。此外,喉组织恶变过程中伴随ras基因扩增[5，2],因而研究性激素对ras基因扩增的影响将深化性激素对喉癌发生、发展影响的研究。
表1 性激素对P21表达的影响 类别
浓度
(c/mol.L-1)
n
表达强度
表达率
, http://www.100md.com
(%)
(-)或(±)
(+)
(++)
睾
酮
10-8
10-9
10-10
9
9
9
, 百拇医药 4
2
3
3
3
1
2
1
0
33.33
44.44
33.33
17β-
雌二醇
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10-8
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1
1
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2
0
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0
1
11.11
22.22
33.33
对照
乙醇
<0.05
9
2
2
0
22.22
, 百拇医药 目前认可的类固醇激素作用机制为[6]:类固醇激素同相应的受体结合,使激素受体复合物(SR)激活,同时受体复合物与称为类固醇反应元件的特异DNA序列高亲和力结合,从而引起一系列特异基因表达的改变。本研究发现:睾酮浓度为10-8mol/L时,能使P21的阳性率显著增高,提示特定浓度的睾酮可能通过促进某些喉癌基因如ras的表达,使细胞趋于恶变,这同Robin等人的结论相一致。17β-雌二醇浓度为10-8mol/L时ras的表达率仅为11.11%。1984年Robland曾报道雌激素对喉癌有促进作用。但目前这方面的证据并不多,因而是否特定浓度的17β-雌二醇对ras表达有抑制作用尚待进一步探讨。
过去性激素治疗喉癌效果的报道常有矛盾之处,这可能与喉癌的细胞类型不同、存在的性激素受体差异有关。喉癌是头颈部常见的肿瘤之一,喉癌的切除会给患者造成很大的痛苦,因而喉癌的内分泌治疗具有重大意义,但其价值仍需进一步验证。
, 百拇医药
参考文献
1 Rodenhuis S,et al.Clinical signification of ras oncogene activiation in human lung cancer.Cancer Res,1992;52:3665
2 Field JK,Spandidos DA.Expression of oncogenes in human tumors with special reference to the head and neck region.J Oral Pathal,1987;16:97
3 赵小冬,肖雪媛,郭晓峰,等.性激素对喉癌细胞株Hep-2体外增殖的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1994;29(3):149
4 Robin JY,Mayer M,Saze S.Role of adrogen on larynx tumor growth.Cancer Treat Rep,1984;63:1195
, 百拇医药
5 Kouichi,Shidafa.Lack of synergistic association between human papilomavirus and ras gene point mutation in laryngeal carcinoma.Laryngoscope,1994;104:1008
6 Marc-Etienne.Steroid hormone receptors compete for factors that mediate their function.Cell, 1989;57:433
(收稿日期 1999-03-30)
, http://www.100md.com
单位：石梅 卢红霞 王廷础 卫生部耳鼻喉科学重点实验室；于雪艳 田克力 蒋力颖 山东医科大学生化教研室
关键词：喉肿瘤；Hep-2；细胞株；雌二醇；睾酮；基因；RAS
山东医大基础医学院学报990201 内容提要 采用葡聚糖包被活性炭技术处理小牛血清,培养喉癌细胞株Hep-2,观察该细胞ras基因表达对睾酮(T)、17β-雌二醇的剂量依赖性。结果表明:该细胞为性激素敏感细胞,当17β-雌二醇浓度为10-8mol/L 时对ras基因的表达有明显的抑制作用,表达率为11.11%;而睾酮浓度为10-9时对ras基因的表达率增至44.44%。此结论为喉癌的内分泌治疗提供了理论基础。
EFFECTION OF SEXUAL HORMONES ON EXPRESSION OF ras
, http://www.100md.com
ONCOGENE OF LARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE Hep-2 IN VITRO
Shi Mei1 Yu Xueyan2 Tian Keli2,et al
(1The State Otolaryngology Institute of P.R.China 2 Shandong Mdical University)
Abstract Laryngeal carcinoma cell line Hep-2 was cultivated in vitro with DCC-FCS which was treated by dextran-coated charcoal technique.The does-dependence of Hep-2 to 17-beta-estradiol and testosterone was explored. The results showed that Hep-2 cell line is sexual-sensitive cell line.When the concentration of testosterone is 10-9mol/L,the expression rate of ras oncogene increased to 44.44%;on the contrary,when the concentration of 17-beta-estradiol is 10-8mol/L,the inhibition effect on expression rate of ras oncogene is remarkable,the expression rate decreased to 11.11%.This study offered the evidences of the endocrine therapy for laryngeal carcinoma.
, 百拇医药
Key words Laryngeal neoplasms; Hep-2 cell line;Estradiol; Testosterone; Genes,RAS
肿瘤发生的分子生物学研究表明:ras基因家族在细胞癌变中起重要作用,ras基因的扩增使其编码的蛋白质P21过量生成,持续不断地将生长信号传入细胞内,从而导致细胞的转化与恶变[1]。研究发现,ras基因的过量表达同喉癌的发生发展密切相关[2]。喉癌是非生殖系统中与性激素关系极密切的恶性肿瘤,赵小冬[3]等也证实特定浓度的睾酮 对Hep-2 细胞的体外增殖有促进作用。因此,有必要就性激素对喉癌基因ras的表达影响进行探讨,以了解内分泌治疗的有效性。有关此方面的研究国内外尚未见报道。
1 资料与方法
1.1 细胞和试剂 本实验所用的喉癌细胞株Hep-2 由山东医学科学院免疫研究室提供,小牛血清(FCS)也系该室提供。培养基RPMI1640为美国Life Technologies Inc. 产品,含10%～15%灭活血清(葡聚糖包被活性炭处理 DCC-FCS)及2mmol/L青霉素及链霉素。睾酮(T)、17-β雌二醇(17β-ER)均为SIGMA公司产品,P21免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 取指数生长期细胞,用DCC-FCS 培养基配置单细胞悬液,每毫升含细胞1.5×104,每瓶接种2ml,将灭菌的盖玻片置入瓶内。实验组48h更换含性激素的培养基,睾酮、17-β雌二醇在培养基中的浓度为10-10～10-8mol/L,对照组加入乙醇,终浓度小于0.01%。此后隔日更换含有相同激素和浓度的培养基,对照组更换含有相同浓度乙醇的培养基,每一激素的每一浓度均有3个平行样。上述实验重复3次。
1.3 免疫组化 细胞培养5d后,取出盖玻片用福尔马林固定,用SABC法检测激素处理细胞及对照细胞的P21阳性率,阴性对照为喉息肉组织切片。
1.4 结果判断 依照阳性细胞百分比及着色强度综合积分做半定量分析,其中细胞阳性率:0为0分,25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,75%为4分。着色强度:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两种标准相加为最后结果:0分为(-),2～3分为(±),4～5分为(+),6～7分为(++),所得数据经χ2检验,进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结 果
喉息肉组织切片为阴性表达。P21阳性着色定位于细胞浆,阳性细胞浆内呈弥漫性细小颗粒状。未经激素处理的Hep-2 细胞,其P21的阳性率为22.22%。17β-雌二醇的浓度为10-8mol/L时,P21的表达率为11.11%,同添加睾酮(T)培养的细胞中P21的表达率呈显著性差异(P<0.05),同17β-雌二醇浓度为10-9、10-10mol/L时差异有高度显著性(P<0.01),而睾酮对细胞中P21阳性率的影响不显著,并且P21表达也不呈现浓度梯度依赖性。
睾酮能使ras基因表达强度增强,当浓度为10-8mol/L时,有22.22%的细胞表达强度为(++),但在其他浓度时,这种作用不明显。性激素对P21表达的影响见表1。
3 讨 论
, http://www.100md.com
类固醇类激素与某些肿瘤的关系十分密切。喉是第二性征器管,是性激素的靶器管。研究表明,喉鳞状上皮细胞在恶性转化过程中可能与雌激素受体有关。Robin等[4]还证明10-9mol/L浓度睾酮可促进喉癌细胞体外增殖。此外,喉组织恶变过程中伴随ras基因扩增[5，2],因而研究性激素对ras基因扩增的影响将深化性激素对喉癌发生、发展影响的研究。
表1 性激素对P21表达的影响 类别
浓度
(c/mol.L-1)
n
表达强度
表达率
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(%)
(-)或(±)
(+)
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睾
酮
10-8
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雌二醇
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, 百拇医药 目前认可的类固醇激素作用机制为[6]:类固醇激素同相应的受体结合,使激素受体复合物(SR)激活,同时受体复合物与称为类固醇反应元件的特异DNA序列高亲和力结合,从而引起一系列特异基因表达的改变。本研究发现:睾酮浓度为10-8mol/L时,能使P21的阳性率显著增高,提示特定浓度的睾酮可能通过促进某些喉癌基因如ras的表达,使细胞趋于恶变,这同Robin等人的结论相一致。17β-雌二醇浓度为10-8mol/L时ras的表达率仅为11.11%。1984年Robland曾报道雌激素对喉癌有促进作用。但目前这方面的证据并不多,因而是否特定浓度的17β-雌二醇对ras表达有抑制作用尚待进一步探讨。
过去性激素治疗喉癌效果的报道常有矛盾之处,这可能与喉癌的细胞类型不同、存在的性激素受体差异有关。喉癌是头颈部常见的肿瘤之一,喉癌的切除会给患者造成很大的痛苦,因而喉癌的内分泌治疗具有重大意义,但其价值仍需进一步验证。
, 百拇医药
参考文献
1 Rodenhuis S,et al.Clinical signification of ras oncogene activiation in human lung cancer.Cancer Res,1992;52:3665
2 Field JK,Spandidos DA.Expression of oncogenes in human tumors with special reference to the head and neck region.J Oral Pathal,1987;16:97
3 赵小冬,肖雪媛,郭晓峰,等.性激素对喉癌细胞株Hep-2体外增殖的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1994;29(3):149
4 Robin JY,Mayer M,Saze S.Role of adrogen on larynx tumor growth.Cancer Treat Rep,1984;63:1195
, 百拇医药
5 Kouichi,Shidafa.Lack of synergistic association between human papilomavirus and ras gene point mutation in laryngeal carcinoma.Laryngoscope,1994;104:1008
6 Marc-Etienne.Steroid hormone receptors compete for factors that mediate their function.Cell, 1989;57:433
(收稿日期 1999-03-30)
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