孕妇单纯疱疹病毒Ⅱ型的检测
作者：崔景辉 郝莉萍 伊纯德 张守峰
单位：116017 大连，解放军大连医学高等专科学校
关键词：
中华传染病杂志/990222
单纯疱疹病毒(HSV)感染是性传播疾病之一，尤其对妇女儿童的危害很大。为调查大连市妇女的感染水平以及感染后对妊娠的影响，我们应用聚合酶链反应(PCR)[1-3]对800例孕妇和200例已婚妇女(非妊娠期)HSV-Ⅱ型感染情况进行调查，现报道如下。
材料和方法
一、材料
(一) 病例来源 1994年5月至1996年10月妇产科门诊检查的孕妇800例，平均年龄26.3岁；对照组(已婚非妊娠妇女)由妇科普查随机选定200例，平均年龄30岁，询问并记录年龄、流产史、职业、居住地、家庭经济状况等。
, 百拇医药
(二)试剂与仪器 FDDK-ⅡDNA扩增试剂为上海复华实业股份有限公司生物技术开发中心产品；HSV-Ⅱ标准株为SM44株，由北京生物制品研究所提供；DNA扩增仪为中国科学院遗传研究所产品。
二、方法
(一) 标本的采集和处理 取宫颈分泌物，放入浓度为0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中洗脱；4℃ 8 000r/min离心20分钟，取上清，加2倍体积的无水乙醇，置-70℃ 20分钟；4℃ 8 000r/min离心20分钟，弃上清。将DNA沉淀溶于无菌去离子水10μl中，煮沸10分钟后立即放-20℃保存。
(二) PCR操作及结果判定
反应物含5×反应缓冲液10 ml，混合DNTP液5μl，引物I(序列为5′-AAGGAGGCGCCCAAGCG-3′)15mol，引物Ⅱ(序列为5′-GGTACAGGCTGGCAAAGT-3′)15mol[4]，待测标本2μl。用无菌去离子水补足至50μl，摇匀置92.5℃水浴7分钟，取出冷至55℃以后加入1μl FD DNA多聚酶，加无菌石蜡油30μl，离心。扩增程序为92.5℃ 30秒，55℃ 30秒，70℃ 90秒，共30次循环，置70℃水浴5分钟。取扩增分析产物10μl与溴酚蓝电泳上样品液1μl混匀后作琼脂糖微量下层水相电泳分析。其中胶浓度为3%，每100ml琼脂糖加溴乙锭3μl染色5分钟，电泳缓冲液1×TAE液。100V 1小时后取胶。在紫外灯下观察A区带，并根据区带与DNA标准株的位置关系，估算扩增产物的碱基数。
, 百拇医药
结果
一、孕妇组与对照组感染情况
孕妇组800例，感染阳性率18.0%(144/800)，对照组200例，感染阳性率6.0%(12/200)，两组差异有显著性(P<0.05)，即孕妇感染率高于非妊娠对照组。
二、孕妇感染与异常妊娠结局的关系
见表1。将孕妇组分为感染阳性和阴性两组(其中阴性组中有4例曾感染过HSV，但其妊娠结局均为正常)，随访800例孕妇妊娠结局，发现阳性组异常结局的发生率明显高于阴性组，两者差异有显著性(P<0.01)。同时也说明阴性组(未感染者与过去曾感染者)与异常结局的发生无关(P>0.05)。
表1 孕妇HSV-Ⅱ感染阳性及阴性与异常妊娠结局的关系 HSV-Ⅱ
, 百拇医药
妊娠异常结局(%)
妊娠正常结局
(%
自然流产
早产
死胎
畸形
新生儿死亡
合计
阳性144
8(5.56)
2(1.39)
5(3.47)*
, 百拇医药
2(1.39)
1(0.69)
18(12.50)
124(86.10)
阴性656
2(0.3)
1(0.15)
1(0.15)
0(0.00)
1(0.15)
5(0.76)
651(99.20)
, http://www.100md.com
合计800
10(1.25)
3(0.38)
6(0.75)
2(0.25)
2(0.245)
23(2.87)
775(96.90)
注：阳性组中2例人工流产，未纳入统计；阴性组中包括过去有过感染史者4例，其妊娠结局均正常；*其中1例伴巨型细胞病毒感染；**其中1例感染弓形体 三、对孕妇感染的影响因素分析
见表2。HSV-Ⅱ的感染与怀孕年龄、怀孕次数等多种因素有关。本组怀孕年龄小于23岁和大于28岁的孕妇感染率高于23～28岁之间的孕妇；首次怀孕者感染率低于1次以上者；孕周13～27周者高于孕周小于12周和大于28周者；有自然流产史者感染率高于其他组；农村高于城市；农民和医务人员高于其他职业组，这可能与其所处的卫生、生活和工作环境有关。
, 百拇医药
表2 孕妇感染影响因素分析 影响因素
感染阳性数
年龄
<23
83(10.4)
23～28
19(2.4)
>28
42(5.3)
怀孕次数
1
52(6.5)
, http://www.100md.com >1
92(11.5)
孕周
<12
41(5.1)
13～27
68(8.5)
>28
35(4.4)
流产史
自然流产
93(11.6)
人工流产
, http://www.100md.com
33(4.1)
无流产史
18(2.3)
居住地
农村
92(11.5)
城市
52(6.5)
职业
农民
56(7.0)
医务人员
48(6.0)
, 百拇医药
知识分子
10(1.3)
商务人员
21(2.6)
工人及其他
9(1.1)
注：()内为感染阳性率
讨论
单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)所致的生殖道感染是目前常见的性病之一。主要通过性接触而获得，传播途径包括性交、口-生殖道、手-生殖道等，其感染无季节性，原发感染一般为亚临床型，病毒可在体内潜伏下来，易于复发。妊娠期由于孕激素增加，抑制细胞介导免疫而易于感染，并可增加自然流产、早产死胎、 畸形儿及新生儿死亡等异常妊娠结局的发生率，是对母婴健康有重大危害的病原体之一[1,5,6]。HSV-Ⅱ感染发生症状疱疹时，产生肉眼可见的特征性病变；发生持续感染时复制出少量完整病毒，无特征性病变，需用IFA或ELISA等免疫学方法确诊；潜伏感染时仅有传染性核酸存留于细胞核内，没有HSV抗原的产生，用免疫学方法无法检测，以上三种情况理论上讲均携带HSV核酸，故PCR法可以检测。研究证明，应用此法检测宫颈分泌物中HSV-Ⅱ的感染省时、省力，且可以反复取材，结果可靠[1，3]。我们的研究结果表明，孕妇感染率高于非妊娠期妇女，两组差异有显著性(P<0.05)；感染阳性组异常妊娠结局的发生率明显高于阴性组，两组差异有显著性(P<0.01)。而且感染的发生率与社会经济条件、年龄、性乱等密切相关。 据报道[3，6] 西方国家经济条件较差的贫困阶层感染率高，社会地位较高层人群中50%有HSV-Ⅱ抗体，而下层人群中80%～100%有HSV-Ⅱ抗体。女性15岁以后易于发生感染，且性乱人群中有较高发生率，早婚者感染危险性较大，且随着年龄增长，感染率及发病率均呈上升趋势[7]。所以选择适当怀孕年龄，减少不必要的人工流产，改善孕妇各种条件，大力加强孕妇感染的研究和防治工作，搞好健康普查，将对优生优育，提高人口素质有重大意义。
, 百拇医药
参考文献
1 王群，徐华，龙建秋，等.多重聚合酶链反应检测人子宫颈病毒感染.中华医学检验杂志，1996，19：86-88.
2 唐家琪，陶开华，李越希，等.DNA聚合酶链反应对HSV的检测和分型.中国公共卫生学报，1993，12：74-76.
3 Edouard M,Lange W,Openshaw H,et al.Application of polymerase chain reaction assays to studies of HSV Latenly.Interviro,1991,92:91-93.
4 Jones C,Ortiz J,Jariwalla RJ.Localization and comparative nucleotide sequence analysis of the transforming domain in herpes simpler virus DNA containing repetitive genetic elements.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:7855-7859.
, 百拇医药
5 Nahmias AJ,Stalder H,Oxman M,et al.Significance of herpes simplex virus during pregnancy.Science News,1991,139:398-340.
6 Backer TM.Genital herpes-yesterday,today,tomorrow.Ann Rev Med,1985,36:185-187.
7 唐家琪.单克隆抗体ELISA检测宫颈分泌中单纯疱疹病毒抗原.南京部队医药，1991，5：53-55.
收稿：1997-05-20 修回：1998-03-16, http://www.100md.com
单位：116017 大连，解放军大连医学高等专科学校
关键词：
中华传染病杂志/990222
单纯疱疹病毒(HSV)感染是性传播疾病之一，尤其对妇女儿童的危害很大。为调查大连市妇女的感染水平以及感染后对妊娠的影响，我们应用聚合酶链反应(PCR)[1-3]对800例孕妇和200例已婚妇女(非妊娠期)HSV-Ⅱ型感染情况进行调查，现报道如下。
材料和方法
一、材料
(一) 病例来源 1994年5月至1996年10月妇产科门诊检查的孕妇800例，平均年龄26.3岁；对照组(已婚非妊娠妇女)由妇科普查随机选定200例，平均年龄30岁，询问并记录年龄、流产史、职业、居住地、家庭经济状况等。
, 百拇医药
(二)试剂与仪器 FDDK-ⅡDNA扩增试剂为上海复华实业股份有限公司生物技术开发中心产品；HSV-Ⅱ标准株为SM44株，由北京生物制品研究所提供；DNA扩增仪为中国科学院遗传研究所产品。
二、方法
(一) 标本的采集和处理 取宫颈分泌物，放入浓度为0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中洗脱；4℃ 8 000r/min离心20分钟，取上清，加2倍体积的无水乙醇，置-70℃ 20分钟；4℃ 8 000r/min离心20分钟，弃上清。将DNA沉淀溶于无菌去离子水10μl中，煮沸10分钟后立即放-20℃保存。
(二) PCR操作及结果判定
反应物含5×反应缓冲液10 ml，混合DNTP液5μl，引物I(序列为5′-AAGGAGGCGCCCAAGCG-3′)15mol，引物Ⅱ(序列为5′-GGTACAGGCTGGCAAAGT-3′)15mol[4]，待测标本2μl。用无菌去离子水补足至50μl，摇匀置92.5℃水浴7分钟，取出冷至55℃以后加入1μl FD DNA多聚酶，加无菌石蜡油30μl，离心。扩增程序为92.5℃ 30秒，55℃ 30秒，70℃ 90秒，共30次循环，置70℃水浴5分钟。取扩增分析产物10μl与溴酚蓝电泳上样品液1μl混匀后作琼脂糖微量下层水相电泳分析。其中胶浓度为3%，每100ml琼脂糖加溴乙锭3μl染色5分钟，电泳缓冲液1×TAE液。100V 1小时后取胶。在紫外灯下观察A区带，并根据区带与DNA标准株的位置关系，估算扩增产物的碱基数。
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结果
一、孕妇组与对照组感染情况
孕妇组800例，感染阳性率18.0%(144/800)，对照组200例，感染阳性率6.0%(12/200)，两组差异有显著性(P<0.05)，即孕妇感染率高于非妊娠对照组。
二、孕妇感染与异常妊娠结局的关系
见表1。将孕妇组分为感染阳性和阴性两组(其中阴性组中有4例曾感染过HSV，但其妊娠结局均为正常)，随访800例孕妇妊娠结局，发现阳性组异常结局的发生率明显高于阴性组，两者差异有显著性(P<0.01)。同时也说明阴性组(未感染者与过去曾感染者)与异常结局的发生无关(P>0.05)。
表1 孕妇HSV-Ⅱ感染阳性及阴性与异常妊娠结局的关系 HSV-Ⅱ
, 百拇医药
妊娠异常结局(%)
妊娠正常结局
(%
自然流产
早产
死胎
畸形
新生儿死亡
合计
阳性144
8(5.56)
2(1.39)
5(3.47)*
, 百拇医药
2(1.39)
1(0.69)
18(12.50)
124(86.10)
阴性656
2(0.3)
1(0.15)
1(0.15)
0(0.00)
1(0.15)
5(0.76)
651(99.20)
, http://www.100md.com
合计800
10(1.25)
3(0.38)
6(0.75)
2(0.25)
2(0.245)
23(2.87)
775(96.90)
注：阳性组中2例人工流产，未纳入统计；阴性组中包括过去有过感染史者4例，其妊娠结局均正常；*其中1例伴巨型细胞病毒感染；**其中1例感染弓形体 三、对孕妇感染的影响因素分析
见表2。HSV-Ⅱ的感染与怀孕年龄、怀孕次数等多种因素有关。本组怀孕年龄小于23岁和大于28岁的孕妇感染率高于23～28岁之间的孕妇；首次怀孕者感染率低于1次以上者；孕周13～27周者高于孕周小于12周和大于28周者；有自然流产史者感染率高于其他组；农村高于城市；农民和医务人员高于其他职业组，这可能与其所处的卫生、生活和工作环境有关。
, 百拇医药
表2 孕妇感染影响因素分析 影响因素
感染阳性数
年龄
<23
83(10.4)
23～28
19(2.4)
>28
42(5.3)
怀孕次数
1
52(6.5)
, http://www.100md.com >1
92(11.5)
孕周
<12
41(5.1)
13～27
68(8.5)
>28
35(4.4)
流产史
自然流产
93(11.6)
人工流产
, http://www.100md.com
33(4.1)
无流产史
18(2.3)
居住地
农村
92(11.5)
城市
52(6.5)
职业
农民
56(7.0)
医务人员
48(6.0)
, 百拇医药
知识分子
10(1.3)
商务人员
21(2.6)
工人及其他
9(1.1)
注：()内为感染阳性率
讨论
单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)所致的生殖道感染是目前常见的性病之一。主要通过性接触而获得，传播途径包括性交、口-生殖道、手-生殖道等，其感染无季节性，原发感染一般为亚临床型，病毒可在体内潜伏下来，易于复发。妊娠期由于孕激素增加，抑制细胞介导免疫而易于感染，并可增加自然流产、早产死胎、 畸形儿及新生儿死亡等异常妊娠结局的发生率，是对母婴健康有重大危害的病原体之一[1,5,6]。HSV-Ⅱ感染发生症状疱疹时，产生肉眼可见的特征性病变；发生持续感染时复制出少量完整病毒，无特征性病变，需用IFA或ELISA等免疫学方法确诊；潜伏感染时仅有传染性核酸存留于细胞核内，没有HSV抗原的产生，用免疫学方法无法检测，以上三种情况理论上讲均携带HSV核酸，故PCR法可以检测。研究证明，应用此法检测宫颈分泌物中HSV-Ⅱ的感染省时、省力，且可以反复取材，结果可靠[1，3]。我们的研究结果表明，孕妇感染率高于非妊娠期妇女，两组差异有显著性(P<0.05)；感染阳性组异常妊娠结局的发生率明显高于阴性组，两组差异有显著性(P<0.01)。而且感染的发生率与社会经济条件、年龄、性乱等密切相关。 据报道[3，6] 西方国家经济条件较差的贫困阶层感染率高，社会地位较高层人群中50%有HSV-Ⅱ抗体，而下层人群中80%～100%有HSV-Ⅱ抗体。女性15岁以后易于发生感染，且性乱人群中有较高发生率，早婚者感染危险性较大，且随着年龄增长，感染率及发病率均呈上升趋势[7]。所以选择适当怀孕年龄，减少不必要的人工流产，改善孕妇各种条件，大力加强孕妇感染的研究和防治工作，搞好健康普查，将对优生优育，提高人口素质有重大意义。
, 百拇医药
参考文献
1 王群，徐华，龙建秋，等.多重聚合酶链反应检测人子宫颈病毒感染.中华医学检验杂志，1996，19：86-88.
2 唐家琪，陶开华，李越希，等.DNA聚合酶链反应对HSV的检测和分型.中国公共卫生学报，1993，12：74-76.
3 Edouard M,Lange W,Openshaw H,et al.Application of polymerase chain reaction assays to studies of HSV Latenly.Interviro,1991,92:91-93.
4 Jones C,Ortiz J,Jariwalla RJ.Localization and comparative nucleotide sequence analysis of the transforming domain in herpes simpler virus DNA containing repetitive genetic elements.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:7855-7859.
, 百拇医药
5 Nahmias AJ,Stalder H,Oxman M,et al.Significance of herpes simplex virus during pregnancy.Science News,1991,139:398-340.
6 Backer TM.Genital herpes-yesterday,today,tomorrow.Ann Rev Med,1985,36:185-187.
7 唐家琪.单克隆抗体ELISA检测宫颈分泌中单纯疱疹病毒抗原.南京部队医药，1991，5：53-55.
收稿：1997-05-20 修回：1998-03-16, http://www.100md.com