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编号:10242208
聚合酶链反应一步法检测汉坦病毒RNA
http://www.100md.com 《中华传染病杂志》 1999年第2期
     作者:余寿杰 朱向秀 高聪 罗艳 孙友岭 李银太

    单位:232001 安徽省淮南市卫生防疫站(余寿杰、朱向秀、高聪、罗艳、孙友岭);军事医学科学院微生物流行病研究所(李银太)

    关键词:

    中华传染病杂志/990220 肾综合征出血热病毒(HFRSV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属(HV),长期以来人们希望从组织和其它标本中直接检测出病原体,尽管用动物和细胞培养分离病毒是最为可靠的,但费时、费力、费钱。而常用的IFA和ELISA法对少量抗原的直接检测不够灵敏。聚合酶链反应(PCR)自1985年问世以来,学者们应用此技术对汉坦病毒进行了一系列研究[1]。证实该技术具有灵敏度高、特异性强等优点。我们选用HV 3条特异性引物,采用一步法对鼠肺、患者血清、尿、含漱液、呼出气等标本病毒基因进行扩增,现将初步结果报告如下。

, 百拇医药     材料与方法

    一、标本来源

    1995年6~12月采集的8份经确诊3~11病日HFRS患者血清,9份5~13病日尿,5份5~13病日含漱液,2份5~13病日患者呼出气体(采用南京产GC-1型个体空气采样器,内装pH7.4、PBS 5ml,0.5m3/min空气流量,采集时间5分钟,按说明书操作)。8只疫区黑线姬鼠,取出肺脏,切片进行IFA检测。以上均按病毒分离要求采集标本,-20℃保存。

    二、标本处理(RNA提取)

    采用NaI裂解,玻璃粉吸附原理,血清标本取200μl,裂解液200μl,60℃加热30分钟,鼠肺取0.5克于研钵中加2ml生理盐水细研,离心10 000r/min 5分钟,取200μl上清加入裂解液200μl,60℃加热30分钟,其它标本同血清处理,裂解标本4 000r/min离心30秒,弃上清,洗涤2次(10mmol/L Tris,50 mmol/L NaCl 50%乙醇,DEPC水)4 000r/min离心1分钟,叩干,加入DEPC水50μl,即为制备好的RNA模板。
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    三、阳性病毒对照

    军事医学科学院微生物流行病研究所李钟铎教授惠赠。

    四、引物的选择[2]

    从M片段G2编码区,选择四个汉坦病毒(HV)(Ⅰ~Ⅳ型)公有的碱基对片段;我们选用了3个寡核苷酸,见表1。

    表1 核苷酸引物序列 核苷酸位置

    引物序列(5′-3′)

    意义

    功能

    产物

    1950-1984(P1)
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    TTGTCTTAGAATTCCATAC

    TGTGGGCTG

    +

    cDNA合成

    2010-2020(P2)

    TGGAATGACAATGCCCATGG

    +

    PCR向下游引物

    330bp

    2340-2306(P3)

    GGATAACAACCCCAGCTCGTCTCA
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    TAGTGGTAATC

    -

    PCR向上游引物

    390bp

    五、PCR

    在引物P1介导和逆转录酶(AMV)的催化下,合成RNA的互补链(cDNA),以cDNA为模板,在TagDNA聚合酶,引物P1、P2、P3及四种底物作用下,置SX-240C DNA扩增仪扩增,94℃ 3分钟变性,94℃ 30秒,46℃ 45秒,72℃ 45秒,25个循环接着94℃ 30秒,58℃ 45秒,72℃ 45秒,35个循环72℃延伸5分钟。结束后取15μl产物进行电泳,在330bp位置观察阳性条带,阴阳性对照正确判读结果。

    六、特异性实验
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    由凤台县防疫站提供Ⅰ,Ⅱ型HFRS疫苗(Ⅰ型由上海生物制品所生产,950384;Ⅱ型由长春生物制品所生产,950704),本站计划免疫科提供甲型肝炎疫苗,狂犬疫苗,腮腺炎疫苗,脊髓灰质炎糖丸,麻疹疫苗。各种液体疫苗每只加1ml无菌生理盐水,混匀。脊髓灰质炎糖丸每个加1ml无菌生理盐水摇匀,离心10 000r/min 1分钟吸中层;RNA提供与标本处理相同。结果

    一、不同温度处理的标本对HV RNA扩增的影响

    8份HFRS患者血清12稀释后加入同体积裂解液60℃ 30分钟加热,逆转录-PCR(RT-PCR)结果全部阳性。室温25℃放置30分钟RT-PCR 5份阳性。

    二、患者血清、尿液、含漱液、呼出气体、鼠肺HV RNA结果

    见表2。

    表2 各类标本PCR结果 标本
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    例数

    病日

    IFA

    RT-PCR阳性数

    血清

    8

    3~11

    -

    8

    尿样

    9

    5~13

    -

, http://www.100md.com     9

    含漱液

    5

    5~13

    -

    3*

    呼出气

    2

    5~13

    -

    1

    鼠肺

    8

    -
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    3

    5

    * 其中1例是健康者,系患者的配偶

    三、RT-PCR引物的特异性考核

    我们选用Ⅰ、Ⅱ型HFRS、甲型肝炎、脊髓灰质炎、腮腺炎、麻疹六种RNA病毒疫苗作实验,其结果除Ⅰ型HFRS疫苗、麻疹疫苗阳性外,其余均为阴性。

    讨论

    目前国内外常用PCR技术对HV进行分型,结果与血清学分型一致,已充分说明PCR以其灵敏度高,特异性强,快速等优点,极大简化了鉴定新病毒株的步骤,可作为临床实验诊断和病毒学独立鉴定的方法[2],但对临床标本检测报道甚少,杨佩珍等[3]应用此技术检测患者循环免疫复合物,说明该技术可以直接检测病毒基因。
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    PCR技术检测患者临床标本成败关键是RNA提取和引物设计,我们认为核酸提取加热处理效果较好,因为临床标本中的RNA量少,扩增时容易受到其它化学物质干扰,加热至少可以排除标本中一些非特异性干扰。引物设计除考虑不同型别的同源性,还应考虑同类型其它病毒是否有同源性。在特异性实验中,麻疹病毒出现阳性反应,麻疹病毒属呼吸道感染传播是单链、负链RNA病毒,可能和HV有部分同源性,此结果并不影响HV RNA检测的真正价值,因HFRS患者临床表现和流行病学特征与麻疹有明显的差别,但设计的引物须要进一步完善。此次设计的引物还包括HV Ⅱ型病毒基因片段,但经多次实验,Ⅰ型病毒始终阳性,Ⅱ型病毒均为阴性,因此该引物只适于检测Ⅰ型HV基因,尚不能用于Ⅱ型HV基因的检测。是否Ⅱ型HV RNA已降解,或其它原因需进一步探讨。

    PCR技术检测临床标本具有减少分离病毒的繁琐程度,它为出血热病毒靶细胞的研究提供了简便、快速、特异的方法。另外,在患者血清、尿样、含漱液以及呼出气中都检测出HV RNA,因此它们在临床及流行病学的使用价值是显而易见的。
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    表2中5份含漱液,其中一份是患者的配偶的标本,RT-PCR结果阳性,说明感染HV并不一定发病。

    本文承蒙军事医学科学院微生物流行病研究所李钟铎教授、唐时幸博士,安徽省凤台县卫生防疫站余晨晓大力支持,表示致谢

    参考文献

    1 Tang YW,Ruo SL,Sanchez A,et al.Hantavirus strains isolated from rodentia and insectivoya in rural china differentiated by PCR assay.Arch Virol,1990,115:37-46.

    2 李盈盈,杭长寿,刘旭,等.聚合酶链反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用.中华实验和临床病毒学杂志,1994,8:20-25.

    3 杨佩珍,陈国芬,王嘉瑞.应用聚合酶链反应及免疫印迹法直接从流行性出血热病人血清循环免疫复合物中检测EHF病毒抗原.中华实验和临床病毒学杂志,1993,7:170-172.

    收稿:1997-06-11 修回:1998-03-27, 百拇医药