乙型肝炎患者肝组织中庚型肝炎病毒的检测
作者：孙毅 李育贤 徐友珍 闫军凯 熊惠颜
单位：215007 苏州，解放军第100医院
关键词：
中华传染病杂志/990213
庚型肝炎病毒(HGV)是1995年国外发现的人类致肝炎病毒[1]。1996年国内克隆和测定了中国人HGV的全基因序列(Gen Bank注册号为U75356)[2]。国内先后建立了聚合酶链反应(PCR)检测血清HGV RNA和免疫酶法(EIA)检测抗-HGV的诊断方法。本文作者对各种程度的乙型肝炎患者肝穿刺活检组织进行HGVAg的检测，探讨这一人群中HGV的感染率及免疫病理的表达特点。
材料和方法
一、标本来源
, http://www.100md.com
本组336例均为1991年3月至1996年4月本院住院患者，男294例，女42例，年龄7～71岁。经针吸肝穿刺活检同时留取相对应血清，经血清PCR检测HBV DNA或EIA方法检测血清HBV有关指标诊断为乙型肝炎，临床诊断和病理组织学诊断均按1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案进行[3]。其中轻度慢性肝炎232例，重度慢性肝炎51例，活动性肝硬化53例。
二、肝组织HGVAg的检测及HBsAg双标记染色
(一) 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化方法(SP法) 切片脱蜡水化-PBS液-过氧化酶阻断剂-PBS液-非免疫性动物血清-鼠抗-HGV NS5 McAb-PBS液-生物素标记的第二抗体-PBS液-链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶-PBS液-部分DAB显色，部分AEC显色-复染-部分中性树胶封固，部分AEC水性封片剂封固。
, 百拇医药 (二) HGVAg和HBsAg双标记染色 HGVAg按上述程序进行，切片-鼠抗-HBsMcAb-生物素标记的第二抗体-链霉菌抗生物素蛋白碱性磷酸酶-底物缓冲液-底物溶液-双重染色增强剂-双染封片剂。
三、试剂来源
鼠抗-HGV NS5 McAb为军事医学科学院微生物流行病研究所馈赠。即用型SP免疫组化试剂盒，AEC酶底物和水性封片剂(迈新公司)。鼠抗-HBsMcAb及免疫组化双重标记试剂盒(美国Zymed Lab公司)。对照试验检测HCVAg使用鼠抗-HCV NS3 McAb(北京医科大学肝病研究所)。
结果
一、对单克隆抗体鼠抗-HGV NS5特异性考核
对已知肝内HGVAg阳性的组织切片进行多种替代试剂的对照试验。加入抗-HGV NS5呈阳性反应，分别加入抗-HCV NS3，抗-HDV，PBS液等均呈阴性反应。本项研究中每组均设置正常肝组织和HGVAg阳性片，正常肝组织均呈阴性反应，HGVAg阳性片每次均呈阳性反应。
, 百拇医药
二、HGVAg检出率
336例乙型肝炎患者肝穿刺活检组织中共检出HGVAg阳性病例25例(7.4%)，见表1。
表1 336例乙型肝炎患者肝组织中HGVAg检出结果 病理组织类型
例数
阳性例数
百分率(%)
轻度慢性肝炎
232
13
5.6
重度慢性肝炎
, 百拇医药
51
5
9.8
活动性肝硬化
53
7
13.3
合 计
336
25
7.4
三、HGVAg在肝组织内的分布及免疫表达特点
HGVAg阳性肝细胞呈三种分布方式。单个HGVAg阳性肝细胞分布于HGVAg阴性肝细胞之间的散在型；3～5个成群的簇状型；数10个分布的片状型。HGVAg阳性肝细胞多在肝小叶周边靠近汇管区的门周带。HGVAg阳性肝细胞胞浆内可见均质状，颗粒状和斑块状包涵体。呈棕黄色(DAB显色)或红色(AEC显色)。并可出现在汇管区肝管上皮内。
, 百拇医药
四、HGVAg和HBsAg双标记染色
在双标记阳性的肝组织中，部分胞浆可见深蓝色HBsAg阳性沉积物，部分胞浆可见红色的HGVAg阳性沉积物。两种阳性染色物也可见于同一肝细胞内。两种染色阳性的肝细胞可位于同一肝小叶或不同肝小叶。讨论
HGV是经血液或肠道外传播的病毒，它的基因结构及蛋白组成同HCV一样划归为黄病毒属。HGV为单股正链RNA病毒，基因全长9.1～9.4kb，有一个连续的编码前体多聚蛋白的读码框架，编码一个长度为2 870～2 900个氨基酸的多聚前体蛋白[4]。
对感染HGV的诊断报道较多的是对血清学的检测，主要是采取分子生物学检测和免疫学检测。采用逆转录PCR(RT-RCR)直接检测病毒核酸RNA，此种方法是诊断HGV感染最直接和最可靠的方法。也可用RT-PCR扩增产物对用同位素或非同位素标记的特异性探针进行杂交鉴定。另一种方法是用重组蛋白或合成肽做抗原建立的ELISA方法检测血清中抗-HGV-IgG和IgM。但这种方法特异性差，敏感性低。我们采用敏感的鼠抗-HGV NS5基因重组McAb对肝组织HGVAg进行检测。这种免疫组化方法是对上述两种血清学检测的最好弥补，也是诊断HGV感染的重要方法。
, 百拇医药
国外报告在HCV和HBV高感染区的人群中HGV感染率较高[5]，在西非等肝炎高发区人群中抗-HGV阳性率高达19.95%。国内报告HCV感染者血清标本，HGV RNA阳性率为3.47%[6]。本组336例肝穿刺活检患者均为乙型肝炎患者，肝组织中HGVAg检出率为7.4%。目前在我国存在的病毒性肝炎虽然有多种，但患病最多的仍属乙型肝炎。我国属乙型肝炎高发区，平均感染率约为60%。有学者认为HGV是一种“伴随病毒”，经常合并于其它类型病毒性肝炎。有报告对我国部分地区几种人群进行了HGV感染的分子流行病学研究。HCV感染者中，HGV RNA阳性率为10.5%，而非甲-戊型肝炎患者HGV RNA阳性率仅为8.5%。本研究表明在我国众多的乙型肝炎患者这个特殊人群中，HGV的同时感染或重叠感染同HGV单一感染一样是一个不容忽视的问题。
参考文献
1 Simmons JN, Pilot-Matias TJ, Leary TP, et al. Identification of two flaviviridae associated with GB agent hepatitis. Acad Sci USA, 1995, 92:3401-3403.
, 百拇医药
2 周育森，王海涛，唐时幸，等.中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆和cDNA序列测定.军事医学科学院院刊，1996，2：160.
3 病毒性肝炎防治方案(试行).中华内科杂志，1995，34：788-794.
4 Muerhoff SA, Leary TP, Pilot-Matias TJ, et al. Genomic organization of GB viruses A and B: two new members of the flaviviridae associated with GB agent hepatitis. J Virol, 1995, 69:5621-5630.
5 Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508.
6 周育森，陈薇，王海涛，等.庚型肝炎病毒(HGV)NS5区部分基因的克隆和cDNA序列测定.中国病毒学，1997，12：50-53.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-30), http://www.100md.com
单位：215007 苏州，解放军第100医院
关键词：
中华传染病杂志/990213
庚型肝炎病毒(HGV)是1995年国外发现的人类致肝炎病毒[1]。1996年国内克隆和测定了中国人HGV的全基因序列(Gen Bank注册号为U75356)[2]。国内先后建立了聚合酶链反应(PCR)检测血清HGV RNA和免疫酶法(EIA)检测抗-HGV的诊断方法。本文作者对各种程度的乙型肝炎患者肝穿刺活检组织进行HGVAg的检测，探讨这一人群中HGV的感染率及免疫病理的表达特点。
材料和方法
一、标本来源
, http://www.100md.com
本组336例均为1991年3月至1996年4月本院住院患者，男294例，女42例，年龄7～71岁。经针吸肝穿刺活检同时留取相对应血清，经血清PCR检测HBV DNA或EIA方法检测血清HBV有关指标诊断为乙型肝炎，临床诊断和病理组织学诊断均按1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案进行[3]。其中轻度慢性肝炎232例，重度慢性肝炎51例，活动性肝硬化53例。
二、肝组织HGVAg的检测及HBsAg双标记染色
(一) 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化方法(SP法) 切片脱蜡水化-PBS液-过氧化酶阻断剂-PBS液-非免疫性动物血清-鼠抗-HGV NS5 McAb-PBS液-生物素标记的第二抗体-PBS液-链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶-PBS液-部分DAB显色，部分AEC显色-复染-部分中性树胶封固，部分AEC水性封片剂封固。
, 百拇医药 (二) HGVAg和HBsAg双标记染色 HGVAg按上述程序进行，切片-鼠抗-HBsMcAb-生物素标记的第二抗体-链霉菌抗生物素蛋白碱性磷酸酶-底物缓冲液-底物溶液-双重染色增强剂-双染封片剂。
三、试剂来源
鼠抗-HGV NS5 McAb为军事医学科学院微生物流行病研究所馈赠。即用型SP免疫组化试剂盒，AEC酶底物和水性封片剂(迈新公司)。鼠抗-HBsMcAb及免疫组化双重标记试剂盒(美国Zymed Lab公司)。对照试验检测HCVAg使用鼠抗-HCV NS3 McAb(北京医科大学肝病研究所)。
结果
一、对单克隆抗体鼠抗-HGV NS5特异性考核
对已知肝内HGVAg阳性的组织切片进行多种替代试剂的对照试验。加入抗-HGV NS5呈阳性反应，分别加入抗-HCV NS3，抗-HDV，PBS液等均呈阴性反应。本项研究中每组均设置正常肝组织和HGVAg阳性片，正常肝组织均呈阴性反应，HGVAg阳性片每次均呈阳性反应。
, 百拇医药
二、HGVAg检出率
336例乙型肝炎患者肝穿刺活检组织中共检出HGVAg阳性病例25例(7.4%)，见表1。
表1 336例乙型肝炎患者肝组织中HGVAg检出结果 病理组织类型
例数
阳性例数
百分率(%)
轻度慢性肝炎
232
13
5.6
重度慢性肝炎
, 百拇医药
51
5
9.8
活动性肝硬化
53
7
13.3
合 计
336
25
7.4
三、HGVAg在肝组织内的分布及免疫表达特点
HGVAg阳性肝细胞呈三种分布方式。单个HGVAg阳性肝细胞分布于HGVAg阴性肝细胞之间的散在型；3～5个成群的簇状型；数10个分布的片状型。HGVAg阳性肝细胞多在肝小叶周边靠近汇管区的门周带。HGVAg阳性肝细胞胞浆内可见均质状，颗粒状和斑块状包涵体。呈棕黄色(DAB显色)或红色(AEC显色)。并可出现在汇管区肝管上皮内。
, 百拇医药
四、HGVAg和HBsAg双标记染色
在双标记阳性的肝组织中，部分胞浆可见深蓝色HBsAg阳性沉积物，部分胞浆可见红色的HGVAg阳性沉积物。两种阳性染色物也可见于同一肝细胞内。两种染色阳性的肝细胞可位于同一肝小叶或不同肝小叶。讨论
HGV是经血液或肠道外传播的病毒，它的基因结构及蛋白组成同HCV一样划归为黄病毒属。HGV为单股正链RNA病毒，基因全长9.1～9.4kb，有一个连续的编码前体多聚蛋白的读码框架，编码一个长度为2 870～2 900个氨基酸的多聚前体蛋白[4]。
对感染HGV的诊断报道较多的是对血清学的检测，主要是采取分子生物学检测和免疫学检测。采用逆转录PCR(RT-RCR)直接检测病毒核酸RNA，此种方法是诊断HGV感染最直接和最可靠的方法。也可用RT-PCR扩增产物对用同位素或非同位素标记的特异性探针进行杂交鉴定。另一种方法是用重组蛋白或合成肽做抗原建立的ELISA方法检测血清中抗-HGV-IgG和IgM。但这种方法特异性差，敏感性低。我们采用敏感的鼠抗-HGV NS5基因重组McAb对肝组织HGVAg进行检测。这种免疫组化方法是对上述两种血清学检测的最好弥补，也是诊断HGV感染的重要方法。
, 百拇医药
国外报告在HCV和HBV高感染区的人群中HGV感染率较高[5]，在西非等肝炎高发区人群中抗-HGV阳性率高达19.95%。国内报告HCV感染者血清标本，HGV RNA阳性率为3.47%[6]。本组336例肝穿刺活检患者均为乙型肝炎患者，肝组织中HGVAg检出率为7.4%。目前在我国存在的病毒性肝炎虽然有多种，但患病最多的仍属乙型肝炎。我国属乙型肝炎高发区，平均感染率约为60%。有学者认为HGV是一种“伴随病毒”，经常合并于其它类型病毒性肝炎。有报告对我国部分地区几种人群进行了HGV感染的分子流行病学研究。HCV感染者中，HGV RNA阳性率为10.5%，而非甲-戊型肝炎患者HGV RNA阳性率仅为8.5%。本研究表明在我国众多的乙型肝炎患者这个特殊人群中，HGV的同时感染或重叠感染同HGV单一感染一样是一个不容忽视的问题。
参考文献
1 Simmons JN, Pilot-Matias TJ, Leary TP, et al. Identification of two flaviviridae associated with GB agent hepatitis. Acad Sci USA, 1995, 92:3401-3403.
, 百拇医药
2 周育森，王海涛，唐时幸，等.中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆和cDNA序列测定.军事医学科学院院刊，1996，2：160.
3 病毒性肝炎防治方案(试行).中华内科杂志，1995，34：788-794.
4 Muerhoff SA, Leary TP, Pilot-Matias TJ, et al. Genomic organization of GB viruses A and B: two new members of the flaviviridae associated with GB agent hepatitis. J Virol, 1995, 69:5621-5630.
5 Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508.
6 周育森，陈薇，王海涛，等.庚型肝炎病毒(HGV)NS5区部分基因的克隆和cDNA序列测定.中国病毒学，1997，12：50-53.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-30), http://www.100md.com