单克隆抗体对茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响
作者：张平 樊明文 边专 杜民权 汪喻忠
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：龋齿；单克隆抗体；茸毛链球菌
中华口腔医学杂志990214 【摘要】 目的 研究局部运用抗茸毛链球菌主要表面蛋白抗原(PAg)的单克隆抗体(简称单抗)对定菌大白鼠茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响。方法 将30只大白鼠随机分组，分别用单抗、非特异性腹水及PBS免疫6次。在第3次免疫后，接种耐链霉素的茸毛链球菌并给予致龋饲料。实验结束后检测茸毛链球菌的粘附水平，并根据Keyes评分方法作龋齿计分。结果 单抗处理组茸毛链球菌粘附水平为18.3%，龋齿记分为10.5 (Ds级)，均显著低于两对照组。结论 用抗PAg的单抗作局部被动免疫，可有效地抑制茸毛链球菌粘附于牙面，并能在一定程度减少龋病发生。
Effect of monoclonal antibody on the colonization of Streptococcus sobrinus and the development of dental caries in rats ZHANG Ping, FAN Mingwen, BIAN Zhuan, et al. College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effect of local application of monoclonal antibody (McAb) raised against the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus (PAg) on the colonization of rats′ teeth by Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) and the development of dental caries. Methods 30 wistar rats were divided into three groups: group I received McAb against PAg; group Ⅱ received unrelated mice ascites; group Ⅲ received PBS. They were applied on six occations. After three times of application, streptomycin resistant S. sobrinus 6715 were inoculated onto the teeth and the rats were fed with caries-inducing diet 2000#. The number of colonized S. sobrinus were counted and the presence of caries was examined by the procedure of Keyes'. Results There was a significant lower level of colonization by S. sobrinus and lower mean caries scores treated with McAb compared with the control groups. Conclusion Local passive immunization with McAb against PAg may be an effective way to prevent the colonization by implanted S. sobrinus and the development of dental caries.
, 百拇医药
【Key words】 Dental caries Monoclonal antibody Streptococcus sobrinus
变形链球菌组与龋病发生密切相关。其中茸毛链球菌(S.sobrinus，又称远缘链球菌，血清d、g型)因具有产酸速度快、耐酸性强、葡糖基转移酶活性高等特性，使其在龋病发生及发展过程中的地位日益受到注目。目前认为位于其细胞表面的主要蛋白质抗原在介导细菌粘附于牙面的过程中可能起重要作用。
单克隆抗体(简称单抗)技术为茸毛链球菌的研究和免疫防龋提供了新的手段。本研究通过制备的抗茸毛链球菌6715主要表面蛋白抗原(the major cell surface protein antigen of serotype g S. sobrinus, PAg)的单抗作局部被动免疫，以观察其对定菌大白鼠口内茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响。
材料和方法
, 百拇医药
1.细菌及其培养条件：S. sobrinus6715(国际标准株)活化后，连续培养于硫酸链霉素浓度梯度递增的BHI培养基，至耐药浓度达1 500 μg/ml。
2.单抗及对照腹水的准备：采用经典的单抗制备法，即将S. sobrinus6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合，酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选，有限稀释法克隆化，得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286。经双扩鉴定为IgG/IgG1亚类单抗，Western-blotting显示其在PAg相应位置呈单一条带。将其所致小鼠腹水单抗用0.22 μm微孔滤膜过滤备用。同时，用SP2/0免疫BALB/C小鼠，收集腹水后离心去除细胞残渣及小颗粒物质，0.22 μm微孔滤膜过滤备用。
3.免疫方案及细菌样本分析：选择同一天出生的30只Wistar大白鼠，随机分为3组(雌雄不分)，每组10只，分别为单抗、非特异性腹水和PBS处理组。于出生后23天断奶，给予普通饲料和含抗生素(氨苄青霉素200 μg/ml)的无菌饮水，并记录体重。于第24、27、31、33、37和45天共进行6次免疫，方法为在切牙唇面和磨牙面接种处理液，每颗牙5 μl。免疫时将大白鼠用2%戊巴比妥钠盐水作腹腔麻醉，并于皮下注射阿托品以抑制唾液分泌。
, 百拇医药
于第3次免疫后接种耐链霉素的S. sobrinus6715于大白鼠口内，接种量为1×109 cfu/ml，于30～60分钟内接种2次，并于24小时内在饮水中加入5%的细菌培养液。立即给大白鼠以致龋饲料2000#。细菌接种前及1周后，采集鼠口内细菌样本分析。大白鼠处死前，再次取样分别接种于含链霉素(500 μg/ml)的MS平皿及BHI平皿，以判断茸毛链球菌数和总菌数。
4.唾液及血清样本的分析：将大白鼠于麻醉后处死前，收集刺激性唾液及血清。采用间接酶联免疫吸附实验检测3组血清、唾液特异性抗PAg及抗单抗的IgG和IgA水平。
5.龋齿计分：将大白鼠处死，分离颌骨，用0.4%紫脲酸铵染色后片切，于体视显微镜下观察各组磨牙患龋情况。评分标准参照Keyes(1958)经典评分方法。
结果
1.各实验组茸毛链球菌粘附水平：接种细菌前，未检测到大白鼠口内有变形链球菌组细菌定殖；接种1周后取样显示各组均有茸毛链球菌粘附。实验结束时，各组茸毛链球菌粘附水平见表1。方差分析显示，3组间茸毛链球菌占可培养总菌数的百分比差异有高度显著性(P<0.01)。进一步作两两比较表明，单抗处理组茸毛链球菌粘附水平明显低于腹水对照组和PBS组(分别为P<0.01和P<0.05)，后两组间差别无显著性。总菌落数3组之间差异无显著性。
, 百拇医药
表1 各实验组茸毛链球菌粘附水平(
±s) 组别
S.sobrinus 6715
(×105)
总菌落数
(×106)
6715占总菌落的
百分比(%)
单抗处理
8.7± 2.6
5.2±1.8
, http://www.100md.com
18.3± 6.9
腹水对照
24.5±14.2
6.9±2.8
37.7±18.0
PBS处理
15.5± 7.9
4.9±2.2
34.8±12.2
2.血清及唾液中特异性抗体水平分析：结果表明各组血清和唾液抗PAg以及抗单抗的IgG和IgA水平，差异均无显著性(P>0.05)。
3.各实验组大白鼠磨牙龋坏情况比较：龋齿计分结果显示(表2)，各实验组鼠磨牙面窝沟均有不同程度的龋损发生，但3组均未见颊、舌面及邻面龋损。各组E级龋损记分差异无显著性(P>0.05)，Ds级龋损记分单抗处理组显著低于SP2/0小鼠腹水处理组和PBS处理组(分别为P<0.01和P<0.05)，后两组之间差异无显著性(P>0.05)。3个实验组未见Dm或Dx级龋损发生。表2 各实验组大白鼠磨牙面窝沟龋损记分(Keyes法) 组别
, 百拇医药
E(±s)
Ds(±s)
单抗处理
31.1±5.47
10.5±3.03
腹水对照
33.7±5.27
20.6±6.98
PBS处理
31.6±4.48
, 百拇医药
16.7±6.04
E：牙釉质龋，Ds: 轻度牙本质龋
讨论
本实验研究了抗茸毛链球菌6715 PAg的单抗(ZS2/286)对定菌大白鼠口内茸毛链球菌粘附和龋病发生的影响。免疫方案主要参照Ma等[1]设计的免疫程序，其依据是3天内可于单抗处理牙面检测到高水平的小鼠特异性IgG，6天以后不能再检测到。设置SP2/0致小鼠腹水组目的是为了排除小鼠腹水中某些非特异性因素介导保护性反应的可能。结果表明，该单抗能显著降低茸毛链球菌对实验大白鼠的粘附，但并不能使其完全受抑制。这可能由于本实验采用了致龋性饮食(蔗糖含量占56%)的缘故。这一结果与Van Raamsdonk等[2]的报道一致。
实验过程中，未发现各组大白鼠出现不良反应。实验结束时，各组鼠体重增加水平无显著性差异，血清和唾液中抗PAg以及抗单抗的IgG和IgA水平也无显著性差异。说明本实验所采用的单抗浓度和免疫频率，对大白鼠作局部被动免疫不会对其机体产生不良作用。但改变单抗用量或频率是否会介导局部或全身反应，还须进一步证实。
, http://www.100md.com
关于单抗防龋的确切机制目前尚属未知。Lehner等[3]学者推测，单抗可能是通过识别主要表面蛋白抗原上特异性抗原决定簇，而阻止致龋菌对牙面的粘附。Ma等[4]发现在体外McAb无抑菌和杀菌作用，但却可介导变形链球菌形成长链。他们推测，在口内形成的长链不易于细菌生长，且聚集的细菌易被吞噬或因口腔自洁作用而清除。Van Raamsdonk等[2，5，6]认为无论是多抗还是单抗，均可通过影响细菌的生长形态，表面理化特性如电荷、表面自由能和疏水性等而对细菌粘附产生影响。
值得一提的是，Ma等[4]发现单抗具有长效作用，即尽管在牙面仅能维持3天，其保护作用却可持续两年。他们认为，可能是因为口腔内发生了菌群的生态转移(ecological shift)。本实验发现，尽管单抗处理组茸毛链球菌粘附水平较低，但在BHI平皿上可培养的总菌落数，各组之间无显著性差异。这一结果似乎支持Ma等学者的推断，即口内有另一种或另几种细菌得益于茸毛链球菌水平的下降。
, 百拇医药
参考文献
1 Ma JKC, Smith R, Lehner T. Use of monoclonal antibodies in local passive immunization to prevent colonization of human teeth by streptococcus mutans. Infect Immun, 1987, 55:1274-1278.
2 Van Raamsdonk M, de Soet JJ, de Graaff J. Effect of monoclonal antibodies on the colonization of rats by streptococcus sobrinus. Caries Res, 1993, 27:31-37.
3 Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local Passive immunization by monoclonal antibodies against streptococci antigen Ⅰ/Ⅱ in the prevention of dental caries. Infect Immun, 1985, 50:769-799.
, http://www.100md.com
4 Ma JKC, Hunjan M, Smith R, et al. An investigation into the mechanism of protection by local passive immunization with monoclonal antibodies against streptococcus mutans. Infect Immun, 1990, 58:3407-3414.
5 Van Raamsdonk M, Van der Mei HC, de Soet JJ, et al. Effect of polyclonal and monoclonal antibodies on surface properities of streptococcus sobrinus. Infect Immun, 1995, 63:1689-1702.
6 Van Raamsdonk M, de Soet JJ, Boch-Tijhof CJ, et al. Effect of antibodies on chemiluminescence and on killing of streptococcus sobrinus by polymorphonuclear leukocytes. Oral Microbiol Immunol, 1996, 11:254-258.
(收稿：1998-06-08 修回：1998-11-18), 百拇医药
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：龋齿；单克隆抗体；茸毛链球菌
中华口腔医学杂志990214 【摘要】 目的 研究局部运用抗茸毛链球菌主要表面蛋白抗原(PAg)的单克隆抗体(简称单抗)对定菌大白鼠茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响。方法 将30只大白鼠随机分组，分别用单抗、非特异性腹水及PBS免疫6次。在第3次免疫后，接种耐链霉素的茸毛链球菌并给予致龋饲料。实验结束后检测茸毛链球菌的粘附水平，并根据Keyes评分方法作龋齿计分。结果 单抗处理组茸毛链球菌粘附水平为18.3%，龋齿记分为10.5 (Ds级)，均显著低于两对照组。结论 用抗PAg的单抗作局部被动免疫，可有效地抑制茸毛链球菌粘附于牙面，并能在一定程度减少龋病发生。
Effect of monoclonal antibody on the colonization of Streptococcus sobrinus and the development of dental caries in rats ZHANG Ping, FAN Mingwen, BIAN Zhuan, et al. College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
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【Abstract】 Objective To investigate the effect of local application of monoclonal antibody (McAb) raised against the major cell surface protein antigen of streptococcus sobrinus (PAg) on the colonization of rats′ teeth by Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) and the development of dental caries. Methods 30 wistar rats were divided into three groups: group I received McAb against PAg; group Ⅱ received unrelated mice ascites; group Ⅲ received PBS. They were applied on six occations. After three times of application, streptomycin resistant S. sobrinus 6715 were inoculated onto the teeth and the rats were fed with caries-inducing diet 2000#. The number of colonized S. sobrinus were counted and the presence of caries was examined by the procedure of Keyes'. Results There was a significant lower level of colonization by S. sobrinus and lower mean caries scores treated with McAb compared with the control groups. Conclusion Local passive immunization with McAb against PAg may be an effective way to prevent the colonization by implanted S. sobrinus and the development of dental caries.
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【Key words】 Dental caries Monoclonal antibody Streptococcus sobrinus
变形链球菌组与龋病发生密切相关。其中茸毛链球菌(S.sobrinus，又称远缘链球菌，血清d、g型)因具有产酸速度快、耐酸性强、葡糖基转移酶活性高等特性，使其在龋病发生及发展过程中的地位日益受到注目。目前认为位于其细胞表面的主要蛋白质抗原在介导细菌粘附于牙面的过程中可能起重要作用。
单克隆抗体(简称单抗)技术为茸毛链球菌的研究和免疫防龋提供了新的手段。本研究通过制备的抗茸毛链球菌6715主要表面蛋白抗原(the major cell surface protein antigen of serotype g S. sobrinus, PAg)的单抗作局部被动免疫，以观察其对定菌大白鼠口内茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响。
材料和方法
, 百拇医药
1.细菌及其培养条件：S. sobrinus6715(国际标准株)活化后，连续培养于硫酸链霉素浓度梯度递增的BHI培养基，至耐药浓度达1 500 μg/ml。
2.单抗及对照腹水的准备：采用经典的单抗制备法，即将S. sobrinus6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合，酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选，有限稀释法克隆化，得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286。经双扩鉴定为IgG/IgG1亚类单抗，Western-blotting显示其在PAg相应位置呈单一条带。将其所致小鼠腹水单抗用0.22 μm微孔滤膜过滤备用。同时，用SP2/0免疫BALB/C小鼠，收集腹水后离心去除细胞残渣及小颗粒物质，0.22 μm微孔滤膜过滤备用。
3.免疫方案及细菌样本分析：选择同一天出生的30只Wistar大白鼠，随机分为3组(雌雄不分)，每组10只，分别为单抗、非特异性腹水和PBS处理组。于出生后23天断奶，给予普通饲料和含抗生素(氨苄青霉素200 μg/ml)的无菌饮水，并记录体重。于第24、27、31、33、37和45天共进行6次免疫，方法为在切牙唇面和磨牙面接种处理液，每颗牙5 μl。免疫时将大白鼠用2%戊巴比妥钠盐水作腹腔麻醉，并于皮下注射阿托品以抑制唾液分泌。
, 百拇医药
于第3次免疫后接种耐链霉素的S. sobrinus6715于大白鼠口内，接种量为1×109 cfu/ml，于30～60分钟内接种2次，并于24小时内在饮水中加入5%的细菌培养液。立即给大白鼠以致龋饲料2000#。细菌接种前及1周后，采集鼠口内细菌样本分析。大白鼠处死前，再次取样分别接种于含链霉素(500 μg/ml)的MS平皿及BHI平皿，以判断茸毛链球菌数和总菌数。
4.唾液及血清样本的分析：将大白鼠于麻醉后处死前，收集刺激性唾液及血清。采用间接酶联免疫吸附实验检测3组血清、唾液特异性抗PAg及抗单抗的IgG和IgA水平。
5.龋齿计分：将大白鼠处死，分离颌骨，用0.4%紫脲酸铵染色后片切，于体视显微镜下观察各组磨牙患龋情况。评分标准参照Keyes(1958)经典评分方法。
结果
1.各实验组茸毛链球菌粘附水平：接种细菌前，未检测到大白鼠口内有变形链球菌组细菌定殖；接种1周后取样显示各组均有茸毛链球菌粘附。实验结束时，各组茸毛链球菌粘附水平见表1。方差分析显示，3组间茸毛链球菌占可培养总菌数的百分比差异有高度显著性(P<0.01)。进一步作两两比较表明，单抗处理组茸毛链球菌粘附水平明显低于腹水对照组和PBS组(分别为P<0.01和P<0.05)，后两组间差别无显著性。总菌落数3组之间差异无显著性。
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表1 各实验组茸毛链球菌粘附水平(
±s) 组别S.sobrinus 6715
(×105)
总菌落数
(×106)
6715占总菌落的
百分比(%)
单抗处理
8.7± 2.6
5.2±1.8
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18.3± 6.9
腹水对照
24.5±14.2
6.9±2.8
37.7±18.0
PBS处理
15.5± 7.9
4.9±2.2
34.8±12.2
2.血清及唾液中特异性抗体水平分析：结果表明各组血清和唾液抗PAg以及抗单抗的IgG和IgA水平，差异均无显著性(P>0.05)。
3.各实验组大白鼠磨牙龋坏情况比较：龋齿计分结果显示(表2)，各实验组鼠磨牙面窝沟均有不同程度的龋损发生，但3组均未见颊、舌面及邻面龋损。各组E级龋损记分差异无显著性(P>0.05)，Ds级龋损记分单抗处理组显著低于SP2/0小鼠腹水处理组和PBS处理组(分别为P<0.01和P<0.05)，后两组之间差异无显著性(P>0.05)。3个实验组未见Dm或Dx级龋损发生。表2 各实验组大白鼠磨牙面窝沟龋损记分(Keyes法) 组别
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E(
±s)Ds(
±s)单抗处理
31.1±5.47
10.5±3.03
腹水对照
33.7±5.27
20.6±6.98
PBS处理
31.6±4.48
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16.7±6.04
E：牙釉质龋，Ds: 轻度牙本质龋
讨论
本实验研究了抗茸毛链球菌6715 PAg的单抗(ZS2/286)对定菌大白鼠口内茸毛链球菌粘附和龋病发生的影响。免疫方案主要参照Ma等[1]设计的免疫程序，其依据是3天内可于单抗处理牙面检测到高水平的小鼠特异性IgG，6天以后不能再检测到。设置SP2/0致小鼠腹水组目的是为了排除小鼠腹水中某些非特异性因素介导保护性反应的可能。结果表明，该单抗能显著降低茸毛链球菌对实验大白鼠的粘附，但并不能使其完全受抑制。这可能由于本实验采用了致龋性饮食(蔗糖含量占56%)的缘故。这一结果与Van Raamsdonk等[2]的报道一致。
实验过程中，未发现各组大白鼠出现不良反应。实验结束时，各组鼠体重增加水平无显著性差异，血清和唾液中抗PAg以及抗单抗的IgG和IgA水平也无显著性差异。说明本实验所采用的单抗浓度和免疫频率，对大白鼠作局部被动免疫不会对其机体产生不良作用。但改变单抗用量或频率是否会介导局部或全身反应，还须进一步证实。
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关于单抗防龋的确切机制目前尚属未知。Lehner等[3]学者推测，单抗可能是通过识别主要表面蛋白抗原上特异性抗原决定簇，而阻止致龋菌对牙面的粘附。Ma等[4]发现在体外McAb无抑菌和杀菌作用，但却可介导变形链球菌形成长链。他们推测，在口内形成的长链不易于细菌生长，且聚集的细菌易被吞噬或因口腔自洁作用而清除。Van Raamsdonk等[2，5，6]认为无论是多抗还是单抗，均可通过影响细菌的生长形态，表面理化特性如电荷、表面自由能和疏水性等而对细菌粘附产生影响。
值得一提的是，Ma等[4]发现单抗具有长效作用，即尽管在牙面仅能维持3天，其保护作用却可持续两年。他们认为，可能是因为口腔内发生了菌群的生态转移(ecological shift)。本实验发现，尽管单抗处理组茸毛链球菌粘附水平较低，但在BHI平皿上可培养的总菌落数，各组之间无显著性差异。这一结果似乎支持Ma等学者的推断，即口内有另一种或另几种细菌得益于茸毛链球菌水平的下降。
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参考文献
1 Ma JKC, Smith R, Lehner T. Use of monoclonal antibodies in local passive immunization to prevent colonization of human teeth by streptococcus mutans. Infect Immun, 1987, 55:1274-1278.
2 Van Raamsdonk M, de Soet JJ, de Graaff J. Effect of monoclonal antibodies on the colonization of rats by streptococcus sobrinus. Caries Res, 1993, 27:31-37.
3 Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local Passive immunization by monoclonal antibodies against streptococci antigen Ⅰ/Ⅱ in the prevention of dental caries. Infect Immun, 1985, 50:769-799.
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4 Ma JKC, Hunjan M, Smith R, et al. An investigation into the mechanism of protection by local passive immunization with monoclonal antibodies against streptococcus mutans. Infect Immun, 1990, 58:3407-3414.
5 Van Raamsdonk M, Van der Mei HC, de Soet JJ, et al. Effect of polyclonal and monoclonal antibodies on surface properities of streptococcus sobrinus. Infect Immun, 1995, 63:1689-1702.
6 Van Raamsdonk M, de Soet JJ, Boch-Tijhof CJ, et al. Effect of antibodies on chemiluminescence and on killing of streptococcus sobrinus by polymorphonuclear leukocytes. Oral Microbiol Immunol, 1996, 11:254-258.
(收稿：1998-06-08 修回：1998-11-18), 百拇医药