血链球菌特异DNA片段探针制备及临床应用
作者：潘亚萍 赵彦艳 孙开来 章锦才
单位：潘亚萍 中国医科大学口腔医学院口腔内科学教研室 110002；赵彦艳 孙开来 中国医科大学基础医学院遗传学教研室；章锦才 华西医科大学口腔医学院
关键词：血链球菌；地高辛探针；nif基因
华西口腔医学杂志990204 要 目的:探讨血链球菌特异DNA片段探针制备及临床应用。方法:采用特异引物的PCR扩增及运用探针进行Southern杂交,斑点杂交来检测口腔链球菌同源序列。结果:S34sr,S34非1和ATCC10556的DNA含有同源序列,另有两株血链球菌临床分离株斑点杂交结果为弱阳性,其它30余株细胞杂交结果阳性。结论:血链球菌ATCC10556菌株中的nif基因为血链球菌的特异基因,该基因在血链球菌蛋白的表达及功能尚待深入探讨。
Preparation of Streptococcus sanguis DIG-labeled DNA Probes
, 百拇医药
and Clinical Application
Pan Yaping
Department of Oral Medicine, Dental School, China Medical University
Zhao Yanyan, Sun Kailai
Department of Heredity, Basic Medicine College, China Medical University
Zhang Jincai
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate oral Streptococci nif gene. Methods: According to the 800 base pairs(bp) sequence, a couple of special prime was designed, which were 5'TAGTTGAAGCGATTAAAGCG 3' and 5' TCGTCGTGAAAGCCAAA 3'. DIG-labeled DNA probes of ATCC10556 800bp DNA fragment and 559bp DNA fragment were made. By using Southern blotting and dot blotting, more than 30 bacterial strains were checked. Results: 559bp sequence was according with the reported results, and the Southern blot results showed that S34sr, S34 no 1 strains had homologicous sequence with ATCC10556, two strains of Streptococcus sanguis were weak positive, and other strains were negative.Conclusion: Streptococcus sanguis ATCC10556 strain contained exactly nif gene and nif gene may be the special gene of Streptococcus sanguis ATCC 10556.
, http://www.100md.com
Key words: Streptococcus sanguis DIG probe nif gene
以往的研究表明血链球菌S.sr DNA重组质粒PCRTM3-S.sr含有nif基因[1]。nif基因在血链球菌的能量代谢及蛋白功能的具体作用及与口腔疾病的发生相关因素仍未完全明确,血链球菌ATCC10556所含有的nif基因是否也存在于其它菌群未见报道。本研究根据已知序列,设计特异引物及标记的DIG探针再次验证nif的基因是否存在于血链球菌ATCC10556菌株中;另一方面检测口腔链球菌及其它菌群中是否也含有nif基因。
1 材料和方法
1.1 菌种选择
血链球菌:ATCC10556,S34sr,S34非1,JFr及临床分离株;变链球菌:国际参考株血清型c、d、f及临床分离株;唾液链球菌:HHT模式株;其它菌种:大肠杆菌、绿脓杆菌、阴沟杆菌、产气荚膜杆菌、葡萄球菌、奈瑟代菌等共30余种细菌。
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1.2 引物设计
通过oligonucleotide二级结构检测,根据测序的800 bp DNA片段设计一对引物。上游引物:5'TAGTTGAAGCGA TTAAAGCG3',下游引物:5'TCGTCGTGAAAGCC AAA3'。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取
常规方法 经碘酚和氯仿,氯仿和异戊醇抽提细菌染色体DNA。
煮沸法 过夜培养细菌,收集菌体,溶菌酶,1%SDS及蛋白酶K,65℃水浴1小时;加入自配的DNA裂解液混匀水浴60℃1小时;沸水煮沸10分,12000 r/min离心5分,收集上清液即含有细菌染色体DNA。
1.3.2 PCR扩增
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以细菌DNA为模板,用设计的特异一对引物进行PCR扩增。反应条件为95℃变性3分,95℃1分,55℃50秒,72℃1.5分,72℃延伸5分,40个循环。
1.3.3 地高辛(DIG)标记探针制备
DIG探针标记 ATCC10556 PCR S.sr质粒酶切产物加入双蒸水16 μl,100℃加热5分使DNA变性,加入DIG标记引物4 μl 20小时孵育,标记后用0.2 mμ的EDTA终止反应。
探针浓度测定 标记的产物1 μl加入到39 μl DNA稀释液中,倍比稀释,点样定量测定显示1∶33稀释浓度的探针做杂交实验较为适宜。
1.3.4 Southern印迹、斑点印迹和Southern杂交及检测
细菌DNA PCR扩增产物进行1%琼脂糖电泳检测,将凝胶变性后印迹于尼龙膜,DNA转移24小时,80℃2小时真空干燥尼龙膜;斑点印迹为细菌提取的染色体DNA 5 μl沸水煮沸10分变性,点样于尼龙膜,将尼龙膜80℃真空干燥2小时。
, 百拇医药
将尼龙膜放入含有变性探针的杂交液2.5 ml中杂交,68℃16小时,洗膜,加入二抗,最后加入10 ml新鲜配制的底物显色。
2 结 果
2.1 特异引物PCR扩增
根据引物设计预计扩增出559个碱基,在设计的PCR扩增条件下,电泳仅出现一条特异带并与预计长度相符。结果显示血链球菌ATCC10556及S34sr扩出同样片段,而且血链球菌JFr菌株、变链球菌、唾液链球菌、大肠杆菌等非亲源性细菌未扩出相应DNA片段(图1)。
图1 特异引物PCR扩增结果 A：ATCC10556，B：S34sr，C：JFr，D：变链球菌血清型c，E：变链球菌血清型f，G、H：血链球菌临床分离株
, 百拇医药
2.2 细菌DNA提取的改进
采用自配的细菌裂解液提取细菌DNA使检测方法更为容易和简单。采用同样PCR扩增条件,ATCC10556扩出同等特异片段,而其它细菌未扩出同样DNA片段,显示煮沸后提取的DNA足够PCR扩增需要(图2)。
图2 采用不同DNA提取方法特异引物PCR扩增结果 B：煮沸提取，C：经典提取
2.3 Southern杂交
Southern印迹杂交显示800 bp左右DNA基因片段含有ATCC10556S.sr基因,即nif基因(图3)。斑点杂交表明,血链球菌国际参考株S34sr,S34非1同样含有nif基因,其中血链球菌2株临床分离株为弱阳性。阴性对照及变链球菌、唾液链球菌、革兰氏阴性杆菌、产气杆菌、葡萄球菌等菌株杂交阴性,表明不含有nif基因(图4)。
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图3 Southern杂交结果 A：特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针杂交阳性，B：非特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针在800bp杂交阳性
图4 DIG斑点杂交结果 A、B、C：血链球菌临床分离株，D：唾液链球菌模式分离株，E、F、G：变链球菌血清型c、f、d，H：S34sr，I：S34非1，J：产气杆菌，K：葡萄球菌，L：奈瑟氏菌，阴性对照：TE液，阳性对照：ATCC10556特异引物PCR扩增产物
3 讨 论
3.1 设计特异引物PCR扩增结果评价
本文设计的一对引物是根据ATCC10556特异DNA片段已知序列所设计的一对引物,含有大部分nif基因。实验结果再次验证用TA克隆系统进行PCR片段转化克隆成功,结果确切,同时也再次证实血链球菌ATCC10556确含有nif基因同源序列,有效序列长度为765个碱基。本研究的DNA碱基序列仅含有部分nifs和nifu基因序列,并不能完成细菌蛋白表达[2],血链球菌哪一种蛋白或功能表达与nifs和nifu基因有关是研究关键,设计适宜引物进行DNA片段多次克隆及表达研究,寻找ATCC10556 nif完整基因是目前首要任务。
, 百拇医药
nif基因已在10余株细菌中发现[3,9],作者对口腔中大部分口腔链球菌菌群进行检测,除ATCC10556及S34sr外,其它菌株未扩增出同样DNA片段,显示了ATCC10556血链球菌DNA基因片段具有较强的特异性。能否完全判断上述微生物中不存在同样的nif基因,证据还不充分。主要原因是作者设计的一对引物长度仅是20和17个碱基,扩增条件要求高,在其它种属细菌中完全扩增同等DNA片段可能性较小,只有与ATCC10556遗传特性非常相近的细菌才有可能,因此尚需运用更好的检测手段进行验证。
3.2 DIG探针评价及临床应用
本研究运用的随机引物法地高辛标记是近年来发展起来的一种较为理想的核酸探针标记方法,并有取代缺口平移法而作为实验室中DNA探针标记的常规方法趋势[5]。本研究制备的DIG探针包含ATCC10556全部nif基因序列,比特异引物PCR扩增检测方法特异性更准确,特异性更高,敏感性好,细菌只要含有部分同源碱基序列即可检出。本实验表明,制备的DIG探针与ATCC10556亲缘性非常相近的血链球菌S34sr,S34非1杂交强阳性,表明这两种菌株含有nif基因,另两株血链球菌临床分离株斑点杂交呈弱阳性,表明可能存在与ATCC10556部分基因序列相似的DNA。
, 百拇医药
作者曾探讨血链球菌ATCC10556含有nif基因同源序列,推测其功能与其产生过氧化氢相关[1]。DIG探针的制备使进行此方面相关性研究手段简化,通过DIG探针检测,Southern或斑点杂交寻找血链球菌nif基因表达及相关性的研究将指日可待。
3.3 DNA提取方法的改进利于临床检测
血链球菌外膜蛋白富含糖蛋白,在提取DNA时常由于蛋白污染导致DNA纯度下降,因此提取DNA过程中如何去除蛋白质尤为重要。本实验采用煮沸法提取细菌DNA,实验方法简单,蛋白更易变性。本实验自配的细菌裂解液较适用于口腔链球菌,提取的DNA纯度与传统提取方法即酚和氯仿抽提无明显差异,使PCR技术应用于口腔链球菌的检测更为实用化,也为本课题进一步深入研究提供一种较为有效的方法。
本课题由美国中华医学会CMB基金资助
, 百拇医药 参考文献
1 潘亚萍,王红杨,金春元,等.血链球菌部分基因克隆及与nif基因同源序列初探.华西口腔医学杂志,1999,17(1):9～11
2 Ouzounis C, Sander C. Homology of the nifs family of proteins to a new class of pyridosal phosphate-department enzymes. FEBS Lett, 1993, 322(1):159～164
3 阎大来,何路红,李秀伦.巴西固氮螺菌ntrBc基因克隆与核苷酸序列分析.微生物学报,1995,35(1):242～249
4 Sun D, Setlow P. Cloning, nucleotide sequence and regulation of the bacillus subtilis and a nifs-like gene, both of which are essential. J Bacteriol, 1993, 175(5):1423～1432
5 萨姆布鲁克,弗里奇,曼尼阿蒂斯,等.分子克隆实验指南.北京:科学出版社,1992:474～490
(1998-05-20收稿), http://www.100md.com
单位：潘亚萍 中国医科大学口腔医学院口腔内科学教研室 110002；赵彦艳 孙开来 中国医科大学基础医学院遗传学教研室；章锦才 华西医科大学口腔医学院
关键词：血链球菌；地高辛探针；nif基因
华西口腔医学杂志990204 要 目的:探讨血链球菌特异DNA片段探针制备及临床应用。方法:采用特异引物的PCR扩增及运用探针进行Southern杂交,斑点杂交来检测口腔链球菌同源序列。结果:S34sr,S34非1和ATCC10556的DNA含有同源序列,另有两株血链球菌临床分离株斑点杂交结果为弱阳性,其它30余株细胞杂交结果阳性。结论:血链球菌ATCC10556菌株中的nif基因为血链球菌的特异基因,该基因在血链球菌蛋白的表达及功能尚待深入探讨。
Preparation of Streptococcus sanguis DIG-labeled DNA Probes
, 百拇医药
and Clinical Application
Pan Yaping
Department of Oral Medicine, Dental School, China Medical University
Zhao Yanyan, Sun Kailai
Department of Heredity, Basic Medicine College, China Medical University
Zhang Jincai
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
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Abstract Objective:To investigate oral Streptococci nif gene. Methods: According to the 800 base pairs(bp) sequence, a couple of special prime was designed, which were 5'TAGTTGAAGCGATTAAAGCG 3' and 5' TCGTCGTGAAAGCCAAA 3'. DIG-labeled DNA probes of ATCC10556 800bp DNA fragment and 559bp DNA fragment were made. By using Southern blotting and dot blotting, more than 30 bacterial strains were checked. Results: 559bp sequence was according with the reported results, and the Southern blot results showed that S34sr, S34 no 1 strains had homologicous sequence with ATCC10556, two strains of Streptococcus sanguis were weak positive, and other strains were negative.Conclusion: Streptococcus sanguis ATCC10556 strain contained exactly nif gene and nif gene may be the special gene of Streptococcus sanguis ATCC 10556.
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Key words: Streptococcus sanguis DIG probe nif gene
以往的研究表明血链球菌S.sr DNA重组质粒PCRTM3-S.sr含有nif基因[1]。nif基因在血链球菌的能量代谢及蛋白功能的具体作用及与口腔疾病的发生相关因素仍未完全明确,血链球菌ATCC10556所含有的nif基因是否也存在于其它菌群未见报道。本研究根据已知序列,设计特异引物及标记的DIG探针再次验证nif的基因是否存在于血链球菌ATCC10556菌株中;另一方面检测口腔链球菌及其它菌群中是否也含有nif基因。
1 材料和方法
1.1 菌种选择
血链球菌:ATCC10556,S34sr,S34非1,JFr及临床分离株;变链球菌:国际参考株血清型c、d、f及临床分离株;唾液链球菌:HHT模式株;其它菌种:大肠杆菌、绿脓杆菌、阴沟杆菌、产气荚膜杆菌、葡萄球菌、奈瑟代菌等共30余种细菌。
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1.2 引物设计
通过oligonucleotide二级结构检测,根据测序的800 bp DNA片段设计一对引物。上游引物:5'TAGTTGAAGCGA TTAAAGCG3',下游引物:5'TCGTCGTGAAAGCC AAA3'。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取
常规方法 经碘酚和氯仿,氯仿和异戊醇抽提细菌染色体DNA。
煮沸法 过夜培养细菌,收集菌体,溶菌酶,1%SDS及蛋白酶K,65℃水浴1小时;加入自配的DNA裂解液混匀水浴60℃1小时;沸水煮沸10分,12000 r/min离心5分,收集上清液即含有细菌染色体DNA。
1.3.2 PCR扩增
, http://www.100md.com
以细菌DNA为模板,用设计的特异一对引物进行PCR扩增。反应条件为95℃变性3分,95℃1分,55℃50秒,72℃1.5分,72℃延伸5分,40个循环。
1.3.3 地高辛(DIG)标记探针制备
DIG探针标记 ATCC10556 PCR S.sr质粒酶切产物加入双蒸水16 μl,100℃加热5分使DNA变性,加入DIG标记引物4 μl 20小时孵育,标记后用0.2 mμ的EDTA终止反应。
探针浓度测定 标记的产物1 μl加入到39 μl DNA稀释液中,倍比稀释,点样定量测定显示1∶33稀释浓度的探针做杂交实验较为适宜。
1.3.4 Southern印迹、斑点印迹和Southern杂交及检测
细菌DNA PCR扩增产物进行1%琼脂糖电泳检测,将凝胶变性后印迹于尼龙膜,DNA转移24小时,80℃2小时真空干燥尼龙膜;斑点印迹为细菌提取的染色体DNA 5 μl沸水煮沸10分变性,点样于尼龙膜,将尼龙膜80℃真空干燥2小时。
, 百拇医药
将尼龙膜放入含有变性探针的杂交液2.5 ml中杂交,68℃16小时,洗膜,加入二抗,最后加入10 ml新鲜配制的底物显色。
2 结 果
2.1 特异引物PCR扩增
根据引物设计预计扩增出559个碱基,在设计的PCR扩增条件下,电泳仅出现一条特异带并与预计长度相符。结果显示血链球菌ATCC10556及S34sr扩出同样片段,而且血链球菌JFr菌株、变链球菌、唾液链球菌、大肠杆菌等非亲源性细菌未扩出相应DNA片段(图1)。
图1 特异引物PCR扩增结果 A：ATCC10556，B：S34sr，C：JFr，D：变链球菌血清型c，E：变链球菌血清型f，G、H：血链球菌临床分离株
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2.2 细菌DNA提取的改进
采用自配的细菌裂解液提取细菌DNA使检测方法更为容易和简单。采用同样PCR扩增条件,ATCC10556扩出同等特异片段,而其它细菌未扩出同样DNA片段,显示煮沸后提取的DNA足够PCR扩增需要(图2)。
图2 采用不同DNA提取方法特异引物PCR扩增结果 B：煮沸提取，C：经典提取
2.3 Southern杂交
Southern印迹杂交显示800 bp左右DNA基因片段含有ATCC10556S.sr基因,即nif基因(图3)。斑点杂交表明,血链球菌国际参考株S34sr,S34非1同样含有nif基因,其中血链球菌2株临床分离株为弱阳性。阴性对照及变链球菌、唾液链球菌、革兰氏阴性杆菌、产气杆菌、葡萄球菌等菌株杂交阴性,表明不含有nif基因(图4)。
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图3 Southern杂交结果 A：特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针杂交阳性，B：非特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针在800bp杂交阳性
图4 DIG斑点杂交结果 A、B、C：血链球菌临床分离株，D：唾液链球菌模式分离株，E、F、G：变链球菌血清型c、f、d，H：S34sr，I：S34非1，J：产气杆菌，K：葡萄球菌，L：奈瑟氏菌，阴性对照：TE液，阳性对照：ATCC10556特异引物PCR扩增产物
3 讨 论
3.1 设计特异引物PCR扩增结果评价
本文设计的一对引物是根据ATCC10556特异DNA片段已知序列所设计的一对引物,含有大部分nif基因。实验结果再次验证用TA克隆系统进行PCR片段转化克隆成功,结果确切,同时也再次证实血链球菌ATCC10556确含有nif基因同源序列,有效序列长度为765个碱基。本研究的DNA碱基序列仅含有部分nifs和nifu基因序列,并不能完成细菌蛋白表达[2],血链球菌哪一种蛋白或功能表达与nifs和nifu基因有关是研究关键,设计适宜引物进行DNA片段多次克隆及表达研究,寻找ATCC10556 nif完整基因是目前首要任务。
, 百拇医药
nif基因已在10余株细菌中发现[3,9],作者对口腔中大部分口腔链球菌菌群进行检测,除ATCC10556及S34sr外,其它菌株未扩增出同样DNA片段,显示了ATCC10556血链球菌DNA基因片段具有较强的特异性。能否完全判断上述微生物中不存在同样的nif基因,证据还不充分。主要原因是作者设计的一对引物长度仅是20和17个碱基,扩增条件要求高,在其它种属细菌中完全扩增同等DNA片段可能性较小,只有与ATCC10556遗传特性非常相近的细菌才有可能,因此尚需运用更好的检测手段进行验证。
3.2 DIG探针评价及临床应用
本研究运用的随机引物法地高辛标记是近年来发展起来的一种较为理想的核酸探针标记方法,并有取代缺口平移法而作为实验室中DNA探针标记的常规方法趋势[5]。本研究制备的DIG探针包含ATCC10556全部nif基因序列,比特异引物PCR扩增检测方法特异性更准确,特异性更高,敏感性好,细菌只要含有部分同源碱基序列即可检出。本实验表明,制备的DIG探针与ATCC10556亲缘性非常相近的血链球菌S34sr,S34非1杂交强阳性,表明这两种菌株含有nif基因,另两株血链球菌临床分离株斑点杂交呈弱阳性,表明可能存在与ATCC10556部分基因序列相似的DNA。
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作者曾探讨血链球菌ATCC10556含有nif基因同源序列,推测其功能与其产生过氧化氢相关[1]。DIG探针的制备使进行此方面相关性研究手段简化,通过DIG探针检测,Southern或斑点杂交寻找血链球菌nif基因表达及相关性的研究将指日可待。
3.3 DNA提取方法的改进利于临床检测
血链球菌外膜蛋白富含糖蛋白,在提取DNA时常由于蛋白污染导致DNA纯度下降,因此提取DNA过程中如何去除蛋白质尤为重要。本实验采用煮沸法提取细菌DNA,实验方法简单,蛋白更易变性。本实验自配的细菌裂解液较适用于口腔链球菌,提取的DNA纯度与传统提取方法即酚和氯仿抽提无明显差异,使PCR技术应用于口腔链球菌的检测更为实用化,也为本课题进一步深入研究提供一种较为有效的方法。
本课题由美国中华医学会CMB基金资助
, 百拇医药 参考文献
1 潘亚萍,王红杨,金春元,等.血链球菌部分基因克隆及与nif基因同源序列初探.华西口腔医学杂志,1999,17(1):9～11
2 Ouzounis C, Sander C. Homology of the nifs family of proteins to a new class of pyridosal phosphate-department enzymes. FEBS Lett, 1993, 322(1):159～164
3 阎大来,何路红,李秀伦.巴西固氮螺菌ntrBc基因克隆与核苷酸序列分析.微生物学报,1995,35(1):242～249
4 Sun D, Setlow P. Cloning, nucleotide sequence and regulation of the bacillus subtilis and a nifs-like gene, both of which are essential. J Bacteriol, 1993, 175(5):1423～1432
5 萨姆布鲁克,弗里奇,曼尼阿蒂斯,等.分子克隆实验指南.北京:科学出版社,1992:474～490
(1998-05-20收稿), http://www.100md.com