当前位置: 首页 > 期刊 > 《眼科新进展》 > 1999年第2期
编号:10244539
破坏视网膜Mller细胞对眼免疫赦免的影响△
http://www.100md.com 《眼科新进展》 1999年第2期
     作者:彭广华 李志杰 李辰

    单位:510632 广州,暨南大学组织移植与免疫实验中心 眼科学实验室(国家专业实验室)Accepted for publication Sep 29,1998

    关键词:免疫赦免;免疫偏离;视网膜;Mller细胞

    破坏视网膜Mller细胞对眼免疫赦免的影响 摘要 目的 探讨视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞在眼免疫赦免诱导和维持中的作用。方法 在Wistar大鼠和新西兰白兔的右眼玻璃体腔接种M78-6.gif (71 bytes)ller细胞的特异性破坏剂L-α-氨基已二酸(L-α-AAA)和10g.L-1牛血清白蛋白。不同时间分别摘除接种眼,进行透射电镜检查。动物模型建立1wk后,进行DTH的诱导和测量。结果 玻璃体腔接种L-α-AAA 4h,视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞肿胀、电子密度降低;12h以上病变加重;48h以上病变减轻;72h恢复正常。玻璃体腔接种L-α-AAA和抗原组的动物DTH反应均呈阴性。非玻璃体腔抗原接种组动物均呈阳性反应。结论 在短时间内、单一的破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞,并不能造成眼免疫赦免状态的削弱或破坏。眼免疫赦免是一多因素、多机制的免疫调节过程,各因素之间具有相互叠加和相互补偿的作用。
, 百拇医药
    Effect of retinal M78-7.gif (84 bytes)ller cells injury on ocular immune privilege

    PENG Guang-Hua,LI Zhi-Jie,LI Chen

    Abstract Objective To examine the effect of retinal M78-6.gif (71 bytes)ller cell injury on the inducement and maintenance of ocular immune privilege.Methods L-α-aminoadipic acid (L-α-AAA),specific gliotoxic agent with bovine serum albumin (BSA)was injected into the vitreous cavity of the right eyes of Wistar rats and New Zealand white rabbits.The eyeballs during different time intervals after vitreous cavity injection were inspected by emission electron microscopy.One week after receiving an immunogenic regimen of BSA in adjuvant,the ability of inducing vitreous cavity associated immune deviation (VCAID)was evaluated.Results All the animals receiving intraocular L-α-AAA inoculation did not display DTH reaction. There was no significant difference between the in oculated and contralateral sites (PBS).The swelling and loss of electron density of M78-6.gif (71 bytes)ller cell cytoplasm were significantly noted and retina recovered to normal morphology in 4 hours and 72 hours after introcular injection of L-α-AAA respectively.Conclusions These data suggest that the in vivo injury of M78-6.gif (71 bytes)llor cells may not interfere with the inducement and maintenance of ocular immue privilege.
, 百拇医药
    Key words immune privilege;immune deviation; retina;M78-6.gif (71 bytes)ller cell

    视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞在维持正常的视网膜功能中起着重要的作用。业已证明,葡萄膜视网膜炎及外伤性增殖性玻璃体视网膜病变等眼病的发生和发展与视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞存在着密切的关系[1,2]。然而,视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞在维持眼免疫赦免中的作用尚不清楚。本实验旨在体内特异性破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞的功能,以探讨视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞在诱导和维持眼免疫赦免中的作用。
, 百拇医药
    1 材料与方法

    1.1 试剂制备 L-α-AAA,Sigma)溶解在磷酸盐缓冲液phosph-ate buffer saline,PBS,pH7.2)中,浓度为20g.L-1;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶解在PBS中,浓度为10g.L-1,分别用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后-20℃保存,供玻璃体腔注射用。

    1.2 实验动物 选择健康无眼疾的Wistar大鼠(Ⅱ级,雄性,体重100±10g,60只)和新西兰白兔(纯系,雄性,体重2.0±0.2kg,45只),由中山医科大学动物实验中心提供。

    1.3 实验分组 每种动物均随机分为3组:(1)常规免疫组;(2)玻璃体相关免疫偏离组;(3)破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞组。
, 百拇医药
    1.4 动物模型的建立

    1.4.1 玻璃体相关免疫偏离动物模型的建立 氯胺酮(25mg.kg-1)和氯丙嗪(25mg.kg-1)混合肌肉注射诱导全身麻醉,5g.L-1地卡因眼表面麻醉,手术显微镜下利用微量注射系统(接种针头0.3mm×8mm,Singapore),在右眼颞上象限角膜缘内1mm处前房穿刺,抽取少量房水(大鼠10μL、新西兰白兔100μL),降低眼压以避免注射抗原溢出。然后,在颞上象限平坦部向玻璃体腔内接种抗原(5g.L-1BSA),接种抗原量分别为:大鼠10μL、新西兰白兔100μL。术后结膜囊内涂抗生素眼膏,裂隙灯显微镜下观察眼部情况。
, 百拇医药
    1.4.2 破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞动物模型的建立 按玻璃体相关免疫偏离动物模型的方法,利用微量注射系统在实验动物的右眼玻璃体腔内接种,其接种量:大鼠10μL、白兔100μL(L-α-AAA和10g.L-1BSA各半)。

    1.5 DTH的诱导方法 以上2组动物眼内接种抗原1wk后,与常规免疫组相同,用0.5g.L-1BSA与CFA的混合乳剂(比例1∶1)免疫动物,大鼠每只前足掌皮下注射50μL;新西兰白兔臀部皮下每点注射100μL,共2点。动物免疫1wk后,进行再次抗原注射,大鼠右足皮内注射5g.L-1BSA 100μL,左足皮内注射PBS 100μL作为阴性对照;新西兰白兔背部右侧皮内注射2点,每点5g.L-1BSA 100μL,左侧皮内注射相同体积的PBS作为阴性对照。
, 百拇医药
    1.6 DTH的测量方法 动物再次免疫24h,用工程游标卡尺(精确度为0.01mm)测量大鼠的足肿厚度;用毫米尺测量新西兰白兔的皮肤红斑的垂直径,红班直径>4mm为阳性反应。测量结果采用两样本均数比较的t检验。

    1.7 透射电镜检查 玻璃体腔注射后4h、12h、24h、48h、72h分别摘除眼球,从赤道部注入25g.L-1戊二醛(大鼠注入10μL、白兔注入100μL),20min后放在25g.L-1戊二醛的蜡盘中,用剃须刀取视神经下方的眼球壁,大小约1mm×1mm×3mm,置入25g.L-1戊二醛的标本瓶中,4℃固定12h,充分冲洗后再进行10g.L-1锇酸后固定(4℃)1.5~2h。常规使用乙醇、丙酮脱水,包埋剂浸泡组织2h后,再置入塑料模具中加入包埋剂进行聚合、修块、制备半薄切片定位后,超薄切片,醋酸双氧铀-硝酸铅双重染色,透射电镜[JEOL(JEM)100CXII/T]下进行观察并摄像记录。
, 百拇医药
    2 结果

    2.1 透射电镜检查结果

    2.1.1 视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞破坏组检查结果 注射L-α-AAA 4h后,视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞水肿、电子密度降低(图1);12h上述病变加重;48h以后,上述病变逐渐减轻;72h,视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞恢复正常。视网膜各层组织未见异常。78-1.gif (11113 bytes)
, 百拇医药
    Figour1 The swelling and loss of electron density of retinal M78-6.gif (71 bytes)ller cell cytoplasm

    4h after introcluar injection of L-a-AAA×8000 L-a-AAA 注射 4h,电镜下视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞肿胀,电子密度降低78-2.gif (4864 bytes)78-3.gif (11073 bytes)
, 百拇医药
    Figour2 All the aniamls receiving intraocular L-a-AAA inculation did display DTH reaction (Figour 2a foot swelling in rat,figour 2b sike erythema diameter)L-a-AAA 眼内注射后,DTH反应均呈阴性,(图2大鼠足肿阴性 图2b白兔皮肤红斑反应阴性)

    2.1.2 玻璃体相关免疫偏离组检查结果 抗原接种后不同时间内,视网膜各层组织均未见异常。

    2.2 迟发型超敏反应检测结果 视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞破坏组的动物未出现DTH反应(图2a、2b)。两侧注射部位相比无显著性差异,与玻璃体相关免疫偏离组相比无统计学差异(P>0.05),与常规免疫组相比有显著性统计学差异(P<0.05),(见表1)。
, http://www.100md.com
    表1 迟发型超敏反应检测结果

    Table 1 The results of delayed-type hypersensitivity

    Groups

    No.

    Right(mm)

    Left(mm)

    P

    Comparison with

    VAID group

    Comparison with

    control group
, 百拇医药
    Wistar rats

    New zealand white rabbits

    15

    10

    5.14±0.98

    1.90±1.40

    4.92±0.90

    2.10±1.10

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05
, 百拇医药
    <0.02

    <0.02

    3 讨论

    眼作为脑器官的一部分,具有独特的免疫赦免特性。针对抗原刺激多表现为细胞和体液免疫反应的偏离现象,将这种现象称为眼相关的免疫偏离(eye-associated immune deviation)[1]。实验研究表明,多种因素参与了眼局部免疫偏离的形成[2]。例如,房水和玻璃体液含有独特的免疫抑制分子,眼固有的组织细胞及其分泌细胞因子发挥重要的免疫调控作用。其它研究结果提示,视网膜的M78-6.gif (71 bytes)ller细胞也具有重要的免疫调节作用。在体外,不但具有抑制抗原特异性或丝裂原刺激的T细胞的增殖作用[3],而且还具有促发抗原特异性淋巴细胞凋亡的作用[4]。但是,该类细胞在活体的免疫偏离的诱导和维持中的作用还不清楚。L-α-AAA是一种谷氨酸酯类的六碳化合物,在体内和体外对视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞和脑胶质细胞具有特异的毒性作用[5~7]。Chen等[8]通过玻璃体腔接种L-α-AAA预先破坏实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)低敏感性的WF大鼠M78-6.gif (71 bytes)ller细胞,发现该类大鼠的发病率增加2倍,局部炎症反应加剧。另外,在眼内发生炎证和眼外伤状态下,L-α-AAA破坏M78-6.gif (71 bytes)ller细胞可使原有的眼部病变加重。以上结果表明,M78-6.gif (71 bytes)ller细胞对眼后节的免疫反应具有重要的调节作用。
, 百拇医药
    本实验通过在啮齿目和兔形目动物玻璃体腔注射L-α-AAA,在特异性破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞的同时接种抗原以诱导玻璃体腔相关的免疫偏离。结果表明,在短时间内单一破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞并不能造成眼免疫赦免的削弱或破坏,其原因可能有两个方面:一方面,眼相关免疫偏离的诱导需要一个长时间的过程,短时间内破坏视网膜M78-6.gif (71 bytes)ller细胞的功能,并不能引起免疫赦免状态的破坏;另一方面,眼后节其它类型的组织细胞,如视网膜色素上皮细胞,在眼后节免疫赦免状态的诱导和维持中也具有重要的调节作用,补偿了因M78-6.gif (71 bytes)ller细胞破坏所产生的削弱效应。上述结果提示,眼的免疫赦免是一极其复杂的、多机制的调节过程,各因素之间可能具有相互叠加和相互补偿的作用。
, http://www.100md.com
     国家自然科学青年基金(No.39500158)、广东省自然科学基金(No.9602208)和教育部霍英东教育基金会资助(No.0505031)

    作者简介 彭广华,女,1958年12月出生于北京,汉族,眼科学副教授、副主任医师。1983年毕业于河南医科大学,一直从事于眼科临床、教学和科研工作。1998年在暨南大学获医学博士学位,现在河南医科大学博士后流动站工作。主要从事眼免疫性疾病和儿童眼病的研究工作。

    From the Research Section of Ophthalmology,Institute of Tissue Transplantation & Immunology,Jinan University,Guangzhou 510632, P.R.China

    参考文献

    1 Streilein JW,Ksander BR,Taylor AW.Immune deviation in relation to ocular immune privilege.J Immunol 1997;158∶3557-3560.
, 百拇医药
    2 李志杰,李 辰.眼免疫赦免的现代概念及临床意义.国外医学眼科学分册 1996;20∶129-135.

    3 Caspi RR,Roberge FG,Nussenblatt RB.Organ-resident,non-lymphoid cells suppress proliferation of autoimmune lymphocytes.Science 1989;237∶1029-1032.

    4 彭广华,李志杰,李 辰.视网膜 M78-6.gif (71 bytes)ller细胞诱导淋巴细胞调亡的体外研究.第四届全国眼免疫学术会议论文汇编 1997∶109.

    5 Karlsen RL,Pederson OO,Schonshoc A,et al.Toxic effects of L-α-aminoadipic acid on M78-6.gif (71 bytes)ller cells from rats in vivo and in cultured cerebral astrocytes.Exp Eye Res 1982;35∶305-311.
, 百拇医药
    6 Ishikawa Y,Mine S.Aminoadipic acid toxic effects on retinal glial cells.Jpn J Ophthalmol 1983;27∶107-118.

    7 Zimmerman RP,Coryman TR.A comparison of the effects of isomers of alpha-aminoadipic acid and 2-amino-4-phosphobutyric acid on the light response of the M78-6.gif (71 bytes)ller glisl cell and the electroretinogram.Neuroscience 1984;12∶77-84.

    8 Chen CC,Francois G,Roberge MN,et al. Injury of M78-6.gif (71 bytes)ller cells increases the incidence of experimental autoimmune uveoretinitis. Clin Immunol Immunopathol 1991;59∶201-207.

    收稿 1998-09-29 修回 1998-10-28, http://www.100md.com