细胞因子对角膜成纤维细胞生长的作用
作者：沈炳棣 陶志华 朱涛
单位：沈炳棣 陶志华 朱涛(温州医学院细胞研究室 325027)
关键词：表皮生长因子；转化生长因子-β1；纤维连接蛋白；成纤维细胞
眼视光学杂志990215 摘 要 目的：研究细胞因子对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供实验依据。方法：用MTT法测定细胞因子EGF、TGF-β1、FN等对角膜成纤维细胞生长的影响作用。结果：EGF对角膜成纤维细胞具有生长调节作用。在0.01～1.0μg/ml浓度下，具有明显促生长作用(与0浓度组比较P<0.001)，其最佳浓度为0.1μg/ml，但浓度在10.0μg/ml时却对其具有明显抑制作用(与0浓度组比较P<0.005)，TGF-β1(0.01～10.0ng/ml)、FN(0.01～10.0mg/ml)对角膜成纤维细胞未见明显促生长或抑制作用(P>0.05)。结论：EGF能调节角膜成纤维细胞生长，而TGF、FN对角膜成纤维细胞生长无影响。
, 百拇医药
Effects of cytokines on rabbit corneal fibroblast proliferation
Shen Bingdi，Tao Zhihua，Zhu Tao. Department of Cell Research，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027
Abstract Objective：To investigate the effects of several cytokines on rabbit corneal epithelial cell proliferation in order to provide experimental evidence of treating corneal disease with cytokines. Methods：A well-cultured system of rabbit corneal fibroblast was established to determine the effects of some cytokines such as epidermal growth factor(EGF)，transforming growth factor-β1(TGF-β1)，fibronectin(FN)on the culturing rabbit corneal fibroblast proliferation by MTT assay. Results：①EGF induce proliferation of alone in comparison with control in 0.01～1.0mg/ml(P<0.01)，but in 10.0mg/ml of EGF did markedly effect of inhibition(P<0.005). ②β1-TGF(0.01～10.0mg/ml)，FN(0.01～10.0mg/ml)didn’t induced proliferation or inhibition of corneal fibroblast alone(P>0.05). Conclusion：the result suggested EGF could regulate growth of rabbit corneal fibroblast；But TGF-β1、FN couldn’t.
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Keywords Epidermal growth factor(EGF) Transforming growth factor-β1(TGF-β1) Fibronectin(FN) Fibroblast
笔者等在培养了传代角膜成纤维细胞基础上，用MTT还原法测定了表皮生长因子(Epidermal Growth factor，EGF)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供依据，现将实验结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养液：采用F和RPMI1640的混和液(1∶1)，其中加有10%FCS，0.3mg/ml谷氨酰胺，0.1U/ml胰岛素，0.5mg/ml氢化可的松，20U/ml庆大霉素，pH调正至7.2～7.4。
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1.1.2 EGF：购自美国Sigma公司的冻干粉(Lot73H8952)，用D-Hanks液配制，原始浓度为20μg/ml。
1.1.3 TGF-β1μg(1ml)，Cat.No.1412272BoehringerMamnHeim。
1.1.4 FN：4mg/ml，购自Corning公司。
1.1.5 MTT：每毫升D-Hanks中溶解2mgMTT(serva，上海实生细胞生物技术公司分装)，用0.22μm滤膜过滤除去细菌及不溶物。分装，置-20℃避光保存。
1.1.6 培养板：购自美国Corning公司的96孔培养板。
1.2 方法
1.2.1 角膜成纤维细胞的培养：取成年、体重1.5～2.0kg的日本大耳白兔眼角膜，用硅胶刀刮除角膜上皮细胞层和内皮细胞层，用手术剪剪成小块于小平皿中，置37℃5%CO2的培养箱中培养，24h可见少量成纤维细胞贴壁生长，约10天细胞布满整个平皿时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养，每5～6天传代一次，经用无水乙醇固定，用手术刀刮下，行常规电镜观察，证实为纯成纤维细胞后，用于实验。
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1.2.2 细胞因子对角膜成纤维细胞生长作用：将细胞浓度为1×105/ml的角膜成纤维细胞接种于96孔培养板，每孔加100μl，并将其分成三组。一组加入含不同浓度EGF的RPMI640培养液100μl，使EGF的终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0μg/ml；第二组加入含不同浓度的TGF-β1的RPMI1640培养液100μl，使TGF终浓度为0、0.1、1.0、10.0ng/ml；第三组加入含不同浓度的FN的RPMI1640培养液100μl，使FN终浓度为0、0.1、1.0、10.0mg/ml；每个浓度重复4孔，置37℃5%CO2的培养箱中培养72h；加入2%MTT溶液50μl/孔，继续培养4h，离心5min，500r/min，去上清液，用每孔DMSO200μl溶解甲月替，用∑960全自动酶标仪于550mm处测其OD值。
1.2.3 统计学处理：每实验组重复4孔，组间数据比较采用t检验。
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2 结果
2.1 成纤维细胞的电镜观察
经传代培养的成纤维细胞用常规方法固定，行透视电镜观察，结果从图1、2可见，纤维细胞生长良好，细胞间可见胶原纤维。
1 成纤维细胞电镜图(×10000)
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图2 成纤维细胞电镜图(×35000)
2.2 MTT法测定成纤维细胞的生长活性
经传代培养生长良好的成纤维细胞，调整细胞浓度为1×106/ml、5×105/ml、2.5×105/ml、1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，分别加入96孔培养板中，每孔100μl，每个浓度4孔。培养24h加入50μlMTT(2mg/ml)，继续培养4h，离心5min，500r/min弃上清液加入DMSO 200μl溶解甲月替，用∑960全自动酶标仪测OD550nm值，结果可见：在每孔2.5×103～1×105范围内线性良好。
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2.3 EGF、TGF-β1、FN对角膜成纤维细胞生长的影响作用
不同EGF浓度对成纤维细胞作用不同，在低浓度0.001μg/ml未见促生长作用，在0.01～1.0μg/ml时，具有明显促生长作用(P<0.001)，其最佳浓度为0.1μg/ml，而在高浓度10.0μg/ml时却具有明显生长抑制作用(P<0.05)，TGF-β1和FN未见明显促生长作用(P>0.05)。(附表)
附表 EGF、TGF-β1、FN对角膜成纤维细胞生长的影响作用(
±s，n＝3) 细胞因子
浓 度
0
0.001
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0.01
0.1
1.0
10.0
EFG(μg/ml)
0.541±0.012
0.551±0.018
0.676±0.034* * *
0.725±0.044* * *
0.647±0.022* * *
0.493±0.019*
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TGF-β1
(ng/ml)
0.541±0.012
—
0.542±0.010
0.496±0.027
0.507±0.032
0.531±0.029
FN(mg/ml)
0.541±0.012
—
0.572±0.025
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0.552±0.019
0.557±0.018
0.549±0.026
与0浓度组比较：* P<0.05,* * *P<0.001
3 讨论
角膜基质成纤维细胞能分泌胶质纤维，胶质纤维基质对角膜上皮细胞生长具有重要作用，此外它还能分泌TGF[2]和FN[3]，而TGF和FN能明显促进角膜上皮细胞生长。我们在研究EGF对角膜上皮细胞生长作用发现EGF需要角膜基质或FN存在下才能明显促进角膜上皮细胞生长[1]，为了研究细胞因子对角膜上皮细胞生长作用机理，本文研究了细胞因子对角膜基质成纤维细胞的生长作用，结果发现EGF能促进纤维细胞生长，而高浓度时却抑制其生长，表明EGF对角膜上皮细胞的生长作用除在胶原基质或FN存在下直接刺激其生长作用外，还可存在调节刺激成纤维细胞的生长，可能使其分泌FN、TGF-β1，促进其生长；而TGF-β1和FN却对成纤维细胞无明显促生长作用，表明TGF-β和FN只能通过直接角膜上皮细胞生长而发挥作用。此外本实验用MTT法测定成纤维细胞生长活性，具有简便、准确的特点。
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参考文献
[1] 陶志华，沈炳棣，朱涛. 表皮生长因子对兔角膜上皮细胞生长作用的实验研究. 中西医结合眼科杂志，1997，15(2)∶65
[2] Strissel KJ. Corneal epitbelial inhibitor of stromal cell collagenase sythesis identified as TGF-beta. Invest Ophthalmol Vis Sic，1995，36(1)∶62～151
[3] 曲萱(综述). 纤维连接蛋白及其在眼科的应用. 国外医学(眼科分册)，1988，4∶197
(收稿：1997-12-16)*011*ChinJOptomOphthalmol1999，Vol.1，No.2, http://www.100md.com
单位：沈炳棣 陶志华 朱涛(温州医学院细胞研究室 325027)
关键词：表皮生长因子；转化生长因子-β1；纤维连接蛋白；成纤维细胞
眼视光学杂志990215 摘 要 目的：研究细胞因子对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供实验依据。方法：用MTT法测定细胞因子EGF、TGF-β1、FN等对角膜成纤维细胞生长的影响作用。结果：EGF对角膜成纤维细胞具有生长调节作用。在0.01～1.0μg/ml浓度下，具有明显促生长作用(与0浓度组比较P<0.001)，其最佳浓度为0.1μg/ml，但浓度在10.0μg/ml时却对其具有明显抑制作用(与0浓度组比较P<0.005)，TGF-β1(0.01～10.0ng/ml)、FN(0.01～10.0mg/ml)对角膜成纤维细胞未见明显促生长或抑制作用(P>0.05)。结论：EGF能调节角膜成纤维细胞生长，而TGF、FN对角膜成纤维细胞生长无影响。
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Effects of cytokines on rabbit corneal fibroblast proliferation
Shen Bingdi，Tao Zhihua，Zhu Tao. Department of Cell Research，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027
Abstract Objective：To investigate the effects of several cytokines on rabbit corneal epithelial cell proliferation in order to provide experimental evidence of treating corneal disease with cytokines. Methods：A well-cultured system of rabbit corneal fibroblast was established to determine the effects of some cytokines such as epidermal growth factor(EGF)，transforming growth factor-β1(TGF-β1)，fibronectin(FN)on the culturing rabbit corneal fibroblast proliferation by MTT assay. Results：①EGF induce proliferation of alone in comparison with control in 0.01～1.0mg/ml(P<0.01)，but in 10.0mg/ml of EGF did markedly effect of inhibition(P<0.005). ②β1-TGF(0.01～10.0mg/ml)，FN(0.01～10.0mg/ml)didn’t induced proliferation or inhibition of corneal fibroblast alone(P>0.05). Conclusion：the result suggested EGF could regulate growth of rabbit corneal fibroblast；But TGF-β1、FN couldn’t.
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Keywords Epidermal growth factor(EGF) Transforming growth factor-β1(TGF-β1) Fibronectin(FN) Fibroblast
笔者等在培养了传代角膜成纤维细胞基础上，用MTT还原法测定了表皮生长因子(Epidermal Growth factor，EGF)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供依据，现将实验结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养液：采用F和RPMI1640的混和液(1∶1)，其中加有10%FCS，0.3mg/ml谷氨酰胺，0.1U/ml胰岛素，0.5mg/ml氢化可的松，20U/ml庆大霉素，pH调正至7.2～7.4。
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1.1.2 EGF：购自美国Sigma公司的冻干粉(Lot73H8952)，用D-Hanks液配制，原始浓度为20μg/ml。
1.1.3 TGF-β1μg(1ml)，Cat.No.1412272BoehringerMamnHeim。
1.1.4 FN：4mg/ml，购自Corning公司。
1.1.5 MTT：每毫升D-Hanks中溶解2mgMTT(serva，上海实生细胞生物技术公司分装)，用0.22μm滤膜过滤除去细菌及不溶物。分装，置-20℃避光保存。
1.1.6 培养板：购自美国Corning公司的96孔培养板。
1.2 方法
1.2.1 角膜成纤维细胞的培养：取成年、体重1.5～2.0kg的日本大耳白兔眼角膜，用硅胶刀刮除角膜上皮细胞层和内皮细胞层，用手术剪剪成小块于小平皿中，置37℃5%CO2的培养箱中培养，24h可见少量成纤维细胞贴壁生长，约10天细胞布满整个平皿时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养，每5～6天传代一次，经用无水乙醇固定，用手术刀刮下，行常规电镜观察，证实为纯成纤维细胞后，用于实验。
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1.2.2 细胞因子对角膜成纤维细胞生长作用：将细胞浓度为1×105/ml的角膜成纤维细胞接种于96孔培养板，每孔加100μl，并将其分成三组。一组加入含不同浓度EGF的RPMI640培养液100μl，使EGF的终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0μg/ml；第二组加入含不同浓度的TGF-β1的RPMI1640培养液100μl，使TGF终浓度为0、0.1、1.0、10.0ng/ml；第三组加入含不同浓度的FN的RPMI1640培养液100μl，使FN终浓度为0、0.1、1.0、10.0mg/ml；每个浓度重复4孔，置37℃5%CO2的培养箱中培养72h；加入2%MTT溶液50μl/孔，继续培养4h，离心5min，500r/min，去上清液，用每孔DMSO200μl溶解甲月替，用∑960全自动酶标仪于550mm处测其OD值。
1.2.3 统计学处理：每实验组重复4孔，组间数据比较采用t检验。
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2 结果
2.1 成纤维细胞的电镜观察
经传代培养的成纤维细胞用常规方法固定，行透视电镜观察，结果从图1、2可见，纤维细胞生长良好，细胞间可见胶原纤维。
1 成纤维细胞电镜图(×10000)
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图2 成纤维细胞电镜图(×35000)
2.2 MTT法测定成纤维细胞的生长活性
经传代培养生长良好的成纤维细胞，调整细胞浓度为1×106/ml、5×105/ml、2.5×105/ml、1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，分别加入96孔培养板中，每孔100μl，每个浓度4孔。培养24h加入50μlMTT(2mg/ml)，继续培养4h，离心5min，500r/min弃上清液加入DMSO 200μl溶解甲月替，用∑960全自动酶标仪测OD550nm值，结果可见：在每孔2.5×103～1×105范围内线性良好。
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2.3 EGF、TGF-β1、FN对角膜成纤维细胞生长的影响作用
不同EGF浓度对成纤维细胞作用不同，在低浓度0.001μg/ml未见促生长作用，在0.01～1.0μg/ml时，具有明显促生长作用(P<0.001)，其最佳浓度为0.1μg/ml，而在高浓度10.0μg/ml时却具有明显生长抑制作用(P<0.05)，TGF-β1和FN未见明显促生长作用(P>0.05)。(附表)
附表 EGF、TGF-β1、FN对角膜成纤维细胞生长的影响作用(
±s，n＝3) 细胞因子浓 度
0
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0.01
0.1
1.0
10.0
EFG(μg/ml)
0.541±0.012
0.551±0.018
0.676±0.034* * *
0.725±0.044* * *
0.647±0.022* * *
0.493±0.019*
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TGF-β1
(ng/ml)
0.541±0.012
—
0.542±0.010
0.496±0.027
0.507±0.032
0.531±0.029
FN(mg/ml)
0.541±0.012
—
0.572±0.025
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0.552±0.019
0.557±0.018
0.549±0.026
与0浓度组比较：* P<0.05,* * *P<0.001
3 讨论
角膜基质成纤维细胞能分泌胶质纤维，胶质纤维基质对角膜上皮细胞生长具有重要作用，此外它还能分泌TGF[2]和FN[3]，而TGF和FN能明显促进角膜上皮细胞生长。我们在研究EGF对角膜上皮细胞生长作用发现EGF需要角膜基质或FN存在下才能明显促进角膜上皮细胞生长[1]，为了研究细胞因子对角膜上皮细胞生长作用机理，本文研究了细胞因子对角膜基质成纤维细胞的生长作用，结果发现EGF能促进纤维细胞生长，而高浓度时却抑制其生长，表明EGF对角膜上皮细胞的生长作用除在胶原基质或FN存在下直接刺激其生长作用外，还可存在调节刺激成纤维细胞的生长，可能使其分泌FN、TGF-β1，促进其生长；而TGF-β1和FN却对成纤维细胞无明显促生长作用，表明TGF-β和FN只能通过直接角膜上皮细胞生长而发挥作用。此外本实验用MTT法测定成纤维细胞生长活性，具有简便、准确的特点。
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参考文献
[1] 陶志华，沈炳棣，朱涛. 表皮生长因子对兔角膜上皮细胞生长作用的实验研究. 中西医结合眼科杂志，1997，15(2)∶65
[2] Strissel KJ. Corneal epitbelial inhibitor of stromal cell collagenase sythesis identified as TGF-beta. Invest Ophthalmol Vis Sic，1995，36(1)∶62～151
[3] 曲萱(综述). 纤维连接蛋白及其在眼科的应用. 国外医学(眼科分册)，1988，4∶197
(收稿：1997-12-16)*011*ChinJOptomOphthalmol1999，Vol.1，No.2, http://www.100md.com