MTT法测定低分子量肝素对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用
作者：杨庆松 袁盛榕 王光璐 张瑾峰 唐 玉
单位：杨庆松 王光璐(首都医科大学附属北京同仁医院眼科，100730)；袁盛榕 唐 玉(首都医科大学药理教研室)；张瑾峰 首都医科大学细胞生物教研室)
关键词：依诺肝素；成纤维细胞
眼科990215 摘 要 目的：观察低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，探讨其与地塞米松联合应用的价值，并与肝素的抑制作用相比较。方法：应用MTT法，测定不同浓度的LMWH对结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，同时比较单独应用LMWH、地塞米松、同一抗凝单位的肝素及LMWH联合地塞米松对成纤维细胞增殖的抑制作用。结果：LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用与浓度成正相关关系，与对照组相比本实验所采用浓度的各种药物均对兔结膜成纤维细胞的增殖有抑制作用(P<0.05)，LMWH比肝素的抑制作用强，差异有显著性(P<0.05)，而与LMWH联合地塞米松相比抑制作用无显著性差异(P>0.05)。结论：LMWH有可能克服肝素易引起出血的副作用，成为一种新型的抗眼部增殖性疾病的药物。
, 百拇医药
分类号 R973.2
Investigation of the effects of low molecular weight heparin on rabbit conjunctival fibrobast proliferation using MTT method in vitro/Yang Qingsong...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(2).-117～119(Dept.of Ophthalmology，Tong Ren Hospital Affiliated to the Capital University of Medical Sciences，Beijing 100730)
To investigate the inhibiting effects of low molecular weight heparin(LMWH)on conjunctival fibroblast proliferation alone and in combination with dexamethasone，the anti-proliferation effects of heparin were compared also.Using MTT method，we detected the dose-effect relationship of LMWH on inhibiting conjunctival fibroblast proliferation；we also evaluated the inhibiting effect on rabbit conjunctival fibroblast proliferation of LMWH alone，LMWH combined dexamethasone and the same anticoagulative unit heparin.The proliferation of rabbit conjuntival fibroblasts was inhibited effectively by LMWH，the inhibiting rates changed with concertrations positively.All medicine inhibited rabbit conjunctival fibroblast proliferation significantly at the tested concentration(P<0.05).The inhibiting effect of LMWH was higher than that of heparin at the same anticoagulative unit(P<0.05)，no significant difference between LMWH or dexamethasone alone and the combinition(P>0.05).This study offered a baseline for further clinic investigation，LMWH may be used to treat proliferative eye diseases.
, 百拇医药
Subject terms Enoxaparin；Fibroblasts
肝素是一种多聚阴离子酸性粘多糖，是传统的抗凝血药剂，近年来的研究发现，其尚具有抑制细胞增殖的其它生物活性[1]。低分子量肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)是近十年来由肝素经不同物理或化学方法处理而得到的肝素片断，是一种新型的抗凝血药物，与母体肝素相比，其具有对血小板功能影响小，极少增加出血倾向等优点[2]，在内科尤其是血液透析方面得到广泛的应用。在眼科领域，近几年的基础及临床研究亦发现肝素类物质尚具有抗细胞增殖、减少玻璃体视网膜手术后纤维蛋白的渗出及降低PVR的复发等作用，但临床研究亦发现肝素有加重术中出血的倾向[3，4]；相对于肝素而言，LMWH具有上述的优点，又能克服肝素易出血的副作用，成为一种新型的抗眼部增殖性疾病的药物。本文应用MTT法观察LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，比较与同样抗凝单位的肝素对兔结膜成纤
, 百拇医药
? 维细胞的抑制作用，并探讨LMWH与目前临床上常用的地塞米松联合作用的价值。
1 材料与方法
1.1 实验细胞
采用经原代培养的兔结膜成纤维细胞，以第5代的兔成纤维细胞进行药物实验。
1.2 主要实验药品及仪器
1.2.1 低分子量肝素的商品名是速避凝(Fraxiparine)，法国赛诺菲公司生产，地塞米松磷酸钠注射液，扬州制药厂生产，肝素钠注射液，上海生物化学制药厂生产。
1.2.2 培养液：①完全培养液：DMEM(美国Sigma公司)培养液，含15%的小牛血清，100u/ml青霉素和链霉素100μg/ml；②无血清培养液：除上述培养液中不含小牛血清外，其余成分均相同。
, 百拇医药
消化液：0.2%胰酶+EDTA(乙二胺四乙酸二钠)。
MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]：四甲基偶氮唑，华美生物工程公司；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)：华美生物工程公司。
1.2.3 主要实验仪器：5%的CO2细胞培养箱，倒置显微镜(Olympus)，50ml培养瓶，96孔培养板，MTT酶标仪(SLT.SPETRAN，公司)。
1.3 MTT法测定LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用
1.3.1 LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用
1.3.1.1 将计数好的细胞以相同的剂量接种到96孔板上，每孔的细胞悬液为200μl，每个孔细胞接种的浓度为1×104。在培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，加入用培养液稀释成不同浓度的LMWH，0，15.63，31.25，62.5，125，250，500，1000IU/ml，8个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔，再孵育24小时。
, http://www.100md.com
1.3.1.2 MTT液的配制及比色分析：将MTT溶解在PBS中，使其浓度为5mg/ml，过滤除菌后4℃避光保存。测定时先将上述培养板的原培养液弃去，每孔加入200μl无血清的培养液，每100μl培养液中含MTT 10μl，将培养板放入培养箱中继续培养4～6小时。然后每孔加入20μl SDS中止反应，将培养板放在振荡器上充分混匀，用MTT酶标仪测定570nm波长时每孔的OD值(又称A值)。
1.3.2 MTT法比较LMWH、地塞米松及肝素对细胞增殖抑制作用：用培养液将下列药物稀释成所需要的浓度：对照组(Contr)―不加任何药物；地塞米松组(Dex)―200μg/ml地塞米松；低分子量肝素组(LMWH)―125IU/ml LMWH；联合用药组(LD)―200μg/ml地塞米松+125IU/ml LMWH；肝素组(Hep)―125IU/ml肝素，各组的OD值测定方法同前。
1.3.3 在各种相同条件下将上述实验各重复1次。
, 百拇医药
1.3.4 抑制率(%)＝(实验组OD值-对照组OD值)×100%/对照组OD值
1.3.5 统计方法：各组之间的OD值比较采用SPSS统计软件包的单因素方差分析
2 实验结果
见表1，表2。
表1 不同浓度的LMWH对兔结膜成纤维细胞
增殖的抑制作用 LMWH浓度(IU/ml)
OD值
抑制率(%)
, 百拇医药
0
15.63
31.25
62.5
125
250
500
1000
0.689±0.071
0.513±0.056
0.390±0.052
0.363±0.043
, 百拇医药 0.270±0.044
0.252±0.041
0.245±0.034
0.178±0.034
25.6
43.1
47.1
60.6
63.3
64.2
74.0
3 讨论
, http://www.100md.com MTT比色测定结果显示LMWH对兔成纤维细胞的增殖的确有抑制作用，且与浓度成正相关的关系。本实验所用的LMWH(速避凝)在与肝素具有同样抗凝活性单位的情况下，抑制细胞增殖的作用比肝素更强，差异有显著表2 LMWH、地塞米松(Dex)、肝素(Hep)对兔结
膜成纤维细胞增殖的影响的比较
(检验标准P<0.05) 组别
OD值
抑制率(%)
对照组
LMWH
, http://www.100md.com
Dex
LD
Hep
F值
P值
0.672±0.068
0.262±0.038
0.323±0.048
0.226±0.041
0.366±0.063
67.42
0.000
, 百拇医药
59.7?＃
50.8?
65.0?＃
44.5?
注：?表示与对照组之间有显著性差异；＃表示与肝素组之间有显著性差异
性；但这一结果并不能说明所有类型的LMWH抗增殖的活性都要比普通肝素强，因剂型或制取方法的不同，肝素类物质的抗增殖活性也不同，Lippman[5]比较了数种肝素及LMWH的抗增殖活性，同时指出肝素类物质的抑制细胞增殖的作用与其抗凝活性无关。一般认为随着肝素分子量的增加，肝素与血小板的亲和力亦增加，这种结合可引起适度的血小板的减少，LMWH分子量较肝素小，因此对于血小板的影响也小，这是LMWH较少有出血副作用的理论基础，这对于易出血的增殖性玻璃体视网膜病变的治疗，有潜在的优势，因此从理论上讲，肝素在防治增殖性眼病方面，LMWH要优于普通肝素。地塞米松对细胞增殖的抑制作用尚有争论，一般认为地塞米松在低浓度时对培养的结膜成纤维细胞的增殖有刺激作用，高浓度时有抑制作用，其ID50为200mg/L[6]。本实验亦发现200μg/ml的地塞米松对细胞的增殖有抑制作用，其抑制率为45.22%；125IU/ml的LMWH与200μg/ml的地塞米松联合应用比二者单独应用时的抑制率都高，但统计学无显著性差异。地塞米松是眼科的常用药物，具有抗炎、减少纤维渗出等作用，因此一旦LMWH应用于临床，即面临与地塞米松联合应用的问题，本实验所用的剂量联合应用与单独应用无显著性的差异，只能说是与剂量的选择可能有关系，况且这只是体外研究，二者之间的作用有待进一步的研究。
, 百拇医药
关于肝素类物质抑制细胞增殖的机制，至今尚不清楚。有资料表明，许多与细胞增殖及PVR有关的生长因子结合，如转化生长因子(FGF)，眼源性生长因子(EDGF)，视网膜衍生生长因子(RDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等，与肝素有很强的亲和力[7]，因此肝素通过与生长因子的结合而减弱后者对细胞增殖的促进作用[3，8]，达到防治增殖性眼病的目的，LMWH有望成为一种更为理想的肝素类药物。
4 参考文献
[1] Wang AM，Templeton DM.Inhibition of mitogenesis and c-fos induction in mesangial cells by heparin and heparan sulfates.Kidney International，1996，49：437～448.
[2] Lensing AW，Prins MH，Davidson BL，et al.Treatment of deep venous thrombosis with low molecular weight heparins：a meta-analysis.Arch Intern Med，1995，155：601.
, 百拇医药
[3] Blumenkranz MS，Hartzer MK，Iverson D.An overview of potential applications of heparin in vitreoretinal surgery.Retina，1992，12：S71～S74.
[4] Johnson RN，Blnkenship G.A prospecive randomized clinical trial of heparin therapy for postoperative introcular fibrin.Ophthalmology，1988，95：312～317.
[5] Lippman MM，Mathews MB.Heparin：varying effects on cell proliferation in vitro and lack of correlation with anticoaguant activity.Federation Proceedings，1977，36(1)：55～59.
, 百拇医药
[6] Blumenkranz MB，Calflin A，Hajek AS.Selection of therapeutic agents or intraocular proliferation disease.Arch Ophthalmol，1984，102：598～604.
[7] 曹景泰.生长因子与视网膜增殖性疾病的研究进展.见：张惠蓉主编.视网膜病临床和基础研究，第1版，太原：山西科学技术出版社，339～353.
[8] Iverson DA，Dailey WD，Hartzer M，et al.The effect of low molecuar weight heparin on the mitogenicity of intraocular fluid from patients with proliferative rerinopathies.Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32：879.
(1998-11-30收稿)
?, http://www.100md.com
单位：杨庆松 王光璐(首都医科大学附属北京同仁医院眼科，100730)；袁盛榕 唐 玉(首都医科大学药理教研室)；张瑾峰 首都医科大学细胞生物教研室)
关键词：依诺肝素；成纤维细胞
眼科990215 摘 要 目的：观察低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，探讨其与地塞米松联合应用的价值，并与肝素的抑制作用相比较。方法：应用MTT法，测定不同浓度的LMWH对结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，同时比较单独应用LMWH、地塞米松、同一抗凝单位的肝素及LMWH联合地塞米松对成纤维细胞增殖的抑制作用。结果：LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用与浓度成正相关关系，与对照组相比本实验所采用浓度的各种药物均对兔结膜成纤维细胞的增殖有抑制作用(P<0.05)，LMWH比肝素的抑制作用强，差异有显著性(P<0.05)，而与LMWH联合地塞米松相比抑制作用无显著性差异(P>0.05)。结论：LMWH有可能克服肝素易引起出血的副作用，成为一种新型的抗眼部增殖性疾病的药物。
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分类号 R973.2
Investigation of the effects of low molecular weight heparin on rabbit conjunctival fibrobast proliferation using MTT method in vitro/Yang Qingsong...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(2).-117～119(Dept.of Ophthalmology，Tong Ren Hospital Affiliated to the Capital University of Medical Sciences，Beijing 100730)
To investigate the inhibiting effects of low molecular weight heparin(LMWH)on conjunctival fibroblast proliferation alone and in combination with dexamethasone，the anti-proliferation effects of heparin were compared also.Using MTT method，we detected the dose-effect relationship of LMWH on inhibiting conjunctival fibroblast proliferation；we also evaluated the inhibiting effect on rabbit conjunctival fibroblast proliferation of LMWH alone，LMWH combined dexamethasone and the same anticoagulative unit heparin.The proliferation of rabbit conjuntival fibroblasts was inhibited effectively by LMWH，the inhibiting rates changed with concertrations positively.All medicine inhibited rabbit conjunctival fibroblast proliferation significantly at the tested concentration(P<0.05).The inhibiting effect of LMWH was higher than that of heparin at the same anticoagulative unit(P<0.05)，no significant difference between LMWH or dexamethasone alone and the combinition(P>0.05).This study offered a baseline for further clinic investigation，LMWH may be used to treat proliferative eye diseases.
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Subject terms Enoxaparin；Fibroblasts
肝素是一种多聚阴离子酸性粘多糖，是传统的抗凝血药剂，近年来的研究发现，其尚具有抑制细胞增殖的其它生物活性[1]。低分子量肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)是近十年来由肝素经不同物理或化学方法处理而得到的肝素片断，是一种新型的抗凝血药物，与母体肝素相比，其具有对血小板功能影响小，极少增加出血倾向等优点[2]，在内科尤其是血液透析方面得到广泛的应用。在眼科领域，近几年的基础及临床研究亦发现肝素类物质尚具有抗细胞增殖、减少玻璃体视网膜手术后纤维蛋白的渗出及降低PVR的复发等作用，但临床研究亦发现肝素有加重术中出血的倾向[3，4]；相对于肝素而言，LMWH具有上述的优点，又能克服肝素易出血的副作用，成为一种新型的抗眼部增殖性疾病的药物。本文应用MTT法观察LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用，比较与同样抗凝单位的肝素对兔结膜成纤
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? 维细胞的抑制作用，并探讨LMWH与目前临床上常用的地塞米松联合作用的价值。
1 材料与方法
1.1 实验细胞
采用经原代培养的兔结膜成纤维细胞，以第5代的兔成纤维细胞进行药物实验。
1.2 主要实验药品及仪器
1.2.1 低分子量肝素的商品名是速避凝(Fraxiparine)，法国赛诺菲公司生产，地塞米松磷酸钠注射液，扬州制药厂生产，肝素钠注射液，上海生物化学制药厂生产。
1.2.2 培养液：①完全培养液：DMEM(美国Sigma公司)培养液，含15%的小牛血清，100u/ml青霉素和链霉素100μg/ml；②无血清培养液：除上述培养液中不含小牛血清外，其余成分均相同。
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消化液：0.2%胰酶+EDTA(乙二胺四乙酸二钠)。
MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]：四甲基偶氮唑，华美生物工程公司；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)：华美生物工程公司。
1.2.3 主要实验仪器：5%的CO2细胞培养箱，倒置显微镜(Olympus)，50ml培养瓶，96孔培养板，MTT酶标仪(SLT.SPETRAN，公司)。
1.3 MTT法测定LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用
1.3.1 LMWH对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用
1.3.1.1 将计数好的细胞以相同的剂量接种到96孔板上，每孔的细胞悬液为200μl，每个孔细胞接种的浓度为1×104。在培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，加入用培养液稀释成不同浓度的LMWH，0，15.63，31.25，62.5，125，250，500，1000IU/ml，8个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔，再孵育24小时。
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1.3.1.2 MTT液的配制及比色分析：将MTT溶解在PBS中，使其浓度为5mg/ml，过滤除菌后4℃避光保存。测定时先将上述培养板的原培养液弃去，每孔加入200μl无血清的培养液，每100μl培养液中含MTT 10μl，将培养板放入培养箱中继续培养4～6小时。然后每孔加入20μl SDS中止反应，将培养板放在振荡器上充分混匀，用MTT酶标仪测定570nm波长时每孔的OD值(又称A值)。
1.3.2 MTT法比较LMWH、地塞米松及肝素对细胞增殖抑制作用：用培养液将下列药物稀释成所需要的浓度：对照组(Contr)―不加任何药物；地塞米松组(Dex)―200μg/ml地塞米松；低分子量肝素组(LMWH)―125IU/ml LMWH；联合用药组(LD)―200μg/ml地塞米松+125IU/ml LMWH；肝素组(Hep)―125IU/ml肝素，各组的OD值测定方法同前。
1.3.3 在各种相同条件下将上述实验各重复1次。
, 百拇医药
1.3.4 抑制率(%)＝(实验组OD值-对照组OD值)×100%/对照组OD值
1.3.5 统计方法：各组之间的OD值比较采用SPSS统计软件包的单因素方差分析
2 实验结果
见表1，表2。
表1 不同浓度的LMWH对兔结膜成纤维细胞
增殖的抑制作用 LMWH浓度(IU/ml)
OD值
抑制率(%)
, 百拇医药
0
15.63
31.25
62.5
125
250
500
1000
0.689±0.071
0.513±0.056
0.390±0.052
0.363±0.043
, 百拇医药 0.270±0.044
0.252±0.041
0.245±0.034
0.178±0.034
25.6
43.1
47.1
60.6
63.3
64.2
74.0
3 讨论
, http://www.100md.com MTT比色测定结果显示LMWH对兔成纤维细胞的增殖的确有抑制作用，且与浓度成正相关的关系。本实验所用的LMWH(速避凝)在与肝素具有同样抗凝活性单位的情况下，抑制细胞增殖的作用比肝素更强，差异有显著表2 LMWH、地塞米松(Dex)、肝素(Hep)对兔结
膜成纤维细胞增殖的影响的比较
(检验标准P<0.05) 组别
OD值
抑制率(%)
对照组
LMWH
, http://www.100md.com
Dex
LD
Hep
F值
P值
0.672±0.068
0.262±0.038
0.323±0.048
0.226±0.041
0.366±0.063
67.42
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50.8?
65.0?＃
44.5?
注：?表示与对照组之间有显著性差异；＃表示与肝素组之间有显著性差异
性；但这一结果并不能说明所有类型的LMWH抗增殖的活性都要比普通肝素强，因剂型或制取方法的不同，肝素类物质的抗增殖活性也不同，Lippman[5]比较了数种肝素及LMWH的抗增殖活性，同时指出肝素类物质的抑制细胞增殖的作用与其抗凝活性无关。一般认为随着肝素分子量的增加，肝素与血小板的亲和力亦增加，这种结合可引起适度的血小板的减少，LMWH分子量较肝素小，因此对于血小板的影响也小，这是LMWH较少有出血副作用的理论基础，这对于易出血的增殖性玻璃体视网膜病变的治疗，有潜在的优势，因此从理论上讲，肝素在防治增殖性眼病方面，LMWH要优于普通肝素。地塞米松对细胞增殖的抑制作用尚有争论，一般认为地塞米松在低浓度时对培养的结膜成纤维细胞的增殖有刺激作用，高浓度时有抑制作用，其ID50为200mg/L[6]。本实验亦发现200μg/ml的地塞米松对细胞的增殖有抑制作用，其抑制率为45.22%；125IU/ml的LMWH与200μg/ml的地塞米松联合应用比二者单独应用时的抑制率都高，但统计学无显著性差异。地塞米松是眼科的常用药物，具有抗炎、减少纤维渗出等作用，因此一旦LMWH应用于临床，即面临与地塞米松联合应用的问题，本实验所用的剂量联合应用与单独应用无显著性的差异，只能说是与剂量的选择可能有关系，况且这只是体外研究，二者之间的作用有待进一步的研究。
, 百拇医药
关于肝素类物质抑制细胞增殖的机制，至今尚不清楚。有资料表明，许多与细胞增殖及PVR有关的生长因子结合，如转化生长因子(FGF)，眼源性生长因子(EDGF)，视网膜衍生生长因子(RDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等，与肝素有很强的亲和力[7]，因此肝素通过与生长因子的结合而减弱后者对细胞增殖的促进作用[3，8]，达到防治增殖性眼病的目的，LMWH有望成为一种更为理想的肝素类药物。
4 参考文献
[1] Wang AM，Templeton DM.Inhibition of mitogenesis and c-fos induction in mesangial cells by heparin and heparan sulfates.Kidney International，1996，49：437～448.
[2] Lensing AW，Prins MH，Davidson BL，et al.Treatment of deep venous thrombosis with low molecular weight heparins：a meta-analysis.Arch Intern Med，1995，155：601.
, 百拇医药
[3] Blumenkranz MS，Hartzer MK，Iverson D.An overview of potential applications of heparin in vitreoretinal surgery.Retina，1992，12：S71～S74.
[4] Johnson RN，Blnkenship G.A prospecive randomized clinical trial of heparin therapy for postoperative introcular fibrin.Ophthalmology，1988，95：312～317.
[5] Lippman MM，Mathews MB.Heparin：varying effects on cell proliferation in vitro and lack of correlation with anticoaguant activity.Federation Proceedings，1977，36(1)：55～59.
, 百拇医药
[6] Blumenkranz MB，Calflin A，Hajek AS.Selection of therapeutic agents or intraocular proliferation disease.Arch Ophthalmol，1984，102：598～604.
[7] 曹景泰.生长因子与视网膜增殖性疾病的研究进展.见：张惠蓉主编.视网膜病临床和基础研究，第1版，太原：山西科学技术出版社，339～353.
[8] Iverson DA，Dailey WD，Hartzer M，et al.The effect of low molecuar weight heparin on the mitogenicity of intraocular fluid from patients with proliferative rerinopathies.Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32：879.
(1998-11-30收稿)
?, http://www.100md.com