EB病毒BHRF 1基因表达对鼻咽癌细胞周期分布影响的研究*
作者：黄 海 潘星华 余 龙 孔宪涛 周水淼 李兆基
单位：黄 海 周水淼 李兆基(第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(上海 200433)；潘星华(第二军医大学生物学教研室)；余 龙(复旦大学遗传学研究所基因工程国家重点实验室)；孔宪涛(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心)
关键词：基因，BHRF 1；鼻咽肿瘤；细胞周期
肿瘤990213 EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明显相关。近来研究发现，EB病毒编码基因的表达与病毒介导的细胞转化与恶变有关。BHRF 1为EB病毒编码的一个早期基因，其与原癌基因Bcl-2具有部分相同的序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细胞程序性死亡、维持其持续生长的能力[1，2]。本研究通过构建BHRF 1的高表达载体并利用转基因技术将BHRF 1基因转入鼻咽癌细胞株CNE 2细胞中，以检测BHRF 1的表达对癌细胞的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期分布和辐射敏感性的影响，以探讨EB病毒的致癌机制。
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材料与方法
一、BHRF 1重组表达载体构建和鉴定 分别将BHRF 1-pSG 5(英国Dawson教授惠赠)和pcDNA 3质粒用XBaⅠ和EcoRⅠ(Pharmacia公司)酶切，低融点凝胶回收0.9 kb的BHRF 1的5.4 kb的pcDNA 3片段，3 mol/L乙酸钠、无水乙醇提纯，70%乙醇漂洗，晾干后溶于纯水中，凝胶电泳鉴定。将50 ng的BHRF 1与50 ng的pcDNA 3混合，T4连接酶16 ℃连接过夜，转化到感受态细胞中扩增。柱抽提法提取质粒，酶切鉴定。
二、脂质体介导载体转染 转染前先将细胞培养24 h；分别将2 μg的质粒(重组表达质粒或空载体质粒)和6 μl的脂质体与100 μl无血清的培养基混匀，再将两者混匀，室温温育45 min；将细胞用无血清的培养基洗2遍；向质粒与脂质体形成的复合物中加入800 μl的无血清培养基并混匀后，加到转染细胞的表面，温育5 h；将细胞用PBS冲洗2遍后加入含血清的培养基温育72 h；加入G 418选择稳定表达新霉素抗性基因的细胞，并进行扩增。
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三、Northern杂交检测转染细胞 收取培养24 h的CNE 2细胞、含空载体的CNE 2细胞及BHRF 1-CNE 2细胞，利用细胞总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提细胞的总RNA。于1%的甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶中的总RNA转移到尼龙膜上，80 ℃烘烤2 h、预杂交。取酶切提纯的BHRF 1片段，随机引物扩增法制备32P标记探针，检测标记率约为80%，G50柱过滤标记物，煮沸后注入杂交盒中杂交18 h，反复洗膜，-80 ℃放射自显影，洗片。
四、PCNA检测 将含有细胞的玻片，用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min；加50 μl过氧化酶阻断溶液，室温温育10 min；PBS冲洗；每张玻片加50 μl非免疫性动物血清，室温下温育10 min；加50 μl的第一抗体，室温下温育60 min；PBS冲洗；加50 μl生物素标记的第二抗体，室温下温育10 min；PBS冲洗；加50 μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下温育10 min；PBS冲洗：100 μl新鲜配制的DAB溶液浸泡10 min；自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固，镜检。结果判定及增殖指数统计：随机选择视野，每例计数1000个癌细胞中的阳性细胞数，如下计算增殖指数：增殖指数=阳性细胞数/1000×100%，结果经t检验。
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五、流式细胞仪检测细胞周期分布情况 细胞传代培养24 h，胰酶消化，生理盐水漂洗，70%酒精固定，0.05%碘化丙啶染色，取106细胞/ml用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
六、原位末端标记法检测凋亡细胞 (1)BHRF 1-CNE 2细胞、空载体-CNE 2细胞及CNE 2细胞培养24 h后，用8 Gy的60Co照射；(2)将培养液吸去，PBS冲洗，70%乙醇固定，烘片；(3)将细胞置2×SSC液中，80 ℃ 20 min；(4)蒸馏水冲洗，胃蛋白酶消化60 min；(5)缓冲液A液漂洗5 min；(6)滴加50 μl标记液，25 ℃ 1 h，PBS漂洗；(7)置内源酶阻断剂内15 min，PBS漂洗；(8)HRP-avidin点片，室温30 min，PBS冲洗；(9)DAB-H2O2显色，冲洗，脱水，透明，封片，镜检。(10)凋亡指数计算：凋亡指数=凋亡细胞数/1000个细胞。
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结 果
一、重组BHRF 1高表达载体的酶切鉴定 将重组BHRF 1-pcDNA 3质粒及BHRF 1-pSG 5质粒分别用XBaⅠ和EcoRⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，检查发现其均有大小约0.9 kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)
图1 重组BHRF 1-pcDNA 3表达质粒的酶切鉴定电泳图
A pcDNA 3 质粒
B XBal和EcoRⅠ酶切后提纯的pcDNA 3片段
C BHRF 1片段
D BHRF 1-pcDNA 3重组质粒(XBal、EcoRⅠ酶切后)
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E λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers
F BHRF 1-psG 5质粒(XBal、EcoRⅠ酶切后)
G BHRF 1-psG 5质粒
二、转染细胞中BHRF 1表达的检测 BHRF 1-CNE 2细胞的mRNA为阳性，而CNE 2和含空载体的对照细胞的mRNA未显影，说明BHRF 1在转染细胞中已经表达(图2)
图2 Northern杂交检测转染细胞BHRF 1的mRNA
B：BHRF 1探针杂交检测BHRF 1表达
a：BHRF 1-CNE2细胞
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b：空载体-CNE2细胞
c：CNE2细胞
三、BHRF 1表达对细胞增殖指数的影响 PCNA阳性反应呈棕褐色，位于细胞核内。增殖指数(
±3s)分别为：CNE 2细胞58.70±7.20，空载体-CNE 2细胞60.27±10.80，BHRF 1-CNE 2细胞18.50±6.15。经统计学处理(t检验)，BHRF 1-CNE 2与CNE 2和空载体-CNE 2的增殖指数间的差异有非常显著意义(P<0.01)；CNE 2与空载体-CNE 2的增殖指数间的差异无显著意义(P>0.05)
四、BHRF 1表达对细胞周期分布的影响
表1 BHRF 1表达与细胞周期分布的关系
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G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
CNE 2
46.6±8.6
17.2±5.9
36.2
空载体-CNE 2
48.5±9.7
18.4±4.4
33.1
BHRF 1-CNE 2
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59.2±11.3
23.2±6.4
17.6
从表1可见，BHRF 1-CNE 2细胞位于G1期和G2期的比率较CNE 2及空载体-CNE 2细胞为高，而位于S期的细胞数下降，其间的差异有显著的意义(0.010.05，χ2检验)。
五、原位末端标记法检测BHRF 1表达对CNE 2抗辐射诱发凋亡的能力的影响 阳性凋亡细胞表现为细胞核内有棕褐色颗粒。凋亡指数分别为，BHRF 1-CNE 2细胞：31.4±1.32；空载体-CNE 2细胞：68.5±2.75；CNE 2细胞：71.3±1.90。经统计学处理(t检验)，BHRF 1-CNE 2细胞与空载体-CNE 2和CNE 2细胞间的差异有非常显著的意义(P<0.01)；空载体-CNE 2细胞与CNE 2细胞间的差异无显著意义(P>0.05)。 讨 论
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通过转基因研究发现，BHRF 1表达可抑制细胞的终末分化、并通过抑制细胞凋亡的发生而促进其在无血清情况下生存及抵抗DNA损伤药物的潜力[3，4]。
本研究发现，BHRF 1表达可导致鼻咽癌细胞，处于G1的细胞数增多，而S期的细胞数下降。提示BHRF 1的表达可抑制鼻咽癌细胞从G1期向S期的发展。由于细胞周期各个时期的辐射敏感性是不同的，其敏感性为：M
*本课题为全军医药卫生基金资助项目，批准号：96Q060
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第一作者简介 黄 海，男，博士，主治医师。
参 考 文 献
1 Monaghan P, Robertson D, Amos TA, et al. Ultrastructural localisation of bcl-2 protein. Histochem Cytochem，1992，40：1819
2 Hickish T, Robertson D, Clarke P,et al.Ultrastructural localization of BHRF1: An Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res，1994，54：2808
3 Dawson CW, Eliopoulos AG, Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene, 1995, 9：69
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4 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr Virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection. Virology, 1994, 201：404
5 Mathews MB, Bernsein RM, Franza BR, et al. Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin. Nature, 1984, 309：374
(收稿：1997-08-03 修回：1997-10-27), 百拇医药
单位：黄 海 周水淼 李兆基(第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(上海 200433)；潘星华(第二军医大学生物学教研室)；余 龙(复旦大学遗传学研究所基因工程国家重点实验室)；孔宪涛(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心)
关键词：基因，BHRF 1；鼻咽肿瘤；细胞周期
肿瘤990213 EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明显相关。近来研究发现，EB病毒编码基因的表达与病毒介导的细胞转化与恶变有关。BHRF 1为EB病毒编码的一个早期基因，其与原癌基因Bcl-2具有部分相同的序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细胞程序性死亡、维持其持续生长的能力[1，2]。本研究通过构建BHRF 1的高表达载体并利用转基因技术将BHRF 1基因转入鼻咽癌细胞株CNE 2细胞中，以检测BHRF 1的表达对癌细胞的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期分布和辐射敏感性的影响，以探讨EB病毒的致癌机制。
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材料与方法
一、BHRF 1重组表达载体构建和鉴定 分别将BHRF 1-pSG 5(英国Dawson教授惠赠)和pcDNA 3质粒用XBaⅠ和EcoRⅠ(Pharmacia公司)酶切，低融点凝胶回收0.9 kb的BHRF 1的5.4 kb的pcDNA 3片段，3 mol/L乙酸钠、无水乙醇提纯，70%乙醇漂洗，晾干后溶于纯水中，凝胶电泳鉴定。将50 ng的BHRF 1与50 ng的pcDNA 3混合，T4连接酶16 ℃连接过夜，转化到感受态细胞中扩增。柱抽提法提取质粒，酶切鉴定。
二、脂质体介导载体转染 转染前先将细胞培养24 h；分别将2 μg的质粒(重组表达质粒或空载体质粒)和6 μl的脂质体与100 μl无血清的培养基混匀，再将两者混匀，室温温育45 min；将细胞用无血清的培养基洗2遍；向质粒与脂质体形成的复合物中加入800 μl的无血清培养基并混匀后，加到转染细胞的表面，温育5 h；将细胞用PBS冲洗2遍后加入含血清的培养基温育72 h；加入G 418选择稳定表达新霉素抗性基因的细胞，并进行扩增。
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三、Northern杂交检测转染细胞 收取培养24 h的CNE 2细胞、含空载体的CNE 2细胞及BHRF 1-CNE 2细胞，利用细胞总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提细胞的总RNA。于1%的甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶中的总RNA转移到尼龙膜上，80 ℃烘烤2 h、预杂交。取酶切提纯的BHRF 1片段，随机引物扩增法制备32P标记探针，检测标记率约为80%，G50柱过滤标记物，煮沸后注入杂交盒中杂交18 h，反复洗膜，-80 ℃放射自显影，洗片。
四、PCNA检测 将含有细胞的玻片，用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min；加50 μl过氧化酶阻断溶液，室温温育10 min；PBS冲洗；每张玻片加50 μl非免疫性动物血清，室温下温育10 min；加50 μl的第一抗体，室温下温育60 min；PBS冲洗；加50 μl生物素标记的第二抗体，室温下温育10 min；PBS冲洗；加50 μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下温育10 min；PBS冲洗：100 μl新鲜配制的DAB溶液浸泡10 min；自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固，镜检。结果判定及增殖指数统计：随机选择视野，每例计数1000个癌细胞中的阳性细胞数，如下计算增殖指数：增殖指数=阳性细胞数/1000×100%，结果经t检验。
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五、流式细胞仪检测细胞周期分布情况 细胞传代培养24 h，胰酶消化，生理盐水漂洗，70%酒精固定，0.05%碘化丙啶染色，取106细胞/ml用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
六、原位末端标记法检测凋亡细胞 (1)BHRF 1-CNE 2细胞、空载体-CNE 2细胞及CNE 2细胞培养24 h后，用8 Gy的60Co照射；(2)将培养液吸去，PBS冲洗，70%乙醇固定，烘片；(3)将细胞置2×SSC液中，80 ℃ 20 min；(4)蒸馏水冲洗，胃蛋白酶消化60 min；(5)缓冲液A液漂洗5 min；(6)滴加50 μl标记液，25 ℃ 1 h，PBS漂洗；(7)置内源酶阻断剂内15 min，PBS漂洗；(8)HRP-avidin点片，室温30 min，PBS冲洗；(9)DAB-H2O2显色，冲洗，脱水，透明，封片，镜检。(10)凋亡指数计算：凋亡指数=凋亡细胞数/1000个细胞。
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结 果
一、重组BHRF 1高表达载体的酶切鉴定 将重组BHRF 1-pcDNA 3质粒及BHRF 1-pSG 5质粒分别用XBaⅠ和EcoRⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，检查发现其均有大小约0.9 kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)
图1 重组BHRF 1-pcDNA 3表达质粒的酶切鉴定电泳图
A pcDNA 3 质粒
B XBal和EcoRⅠ酶切后提纯的pcDNA 3片段
C BHRF 1片段
D BHRF 1-pcDNA 3重组质粒(XBal、EcoRⅠ酶切后)
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E λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers
F BHRF 1-psG 5质粒(XBal、EcoRⅠ酶切后)
G BHRF 1-psG 5质粒
二、转染细胞中BHRF 1表达的检测 BHRF 1-CNE 2细胞的mRNA为阳性，而CNE 2和含空载体的对照细胞的mRNA未显影，说明BHRF 1在转染细胞中已经表达(图2)
图2 Northern杂交检测转染细胞BHRF 1的mRNA
B：BHRF 1探针杂交检测BHRF 1表达
a：BHRF 1-CNE2细胞
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b：空载体-CNE2细胞
c：CNE2细胞
三、BHRF 1表达对细胞增殖指数的影响 PCNA阳性反应呈棕褐色，位于细胞核内。增殖指数(
±3s)分别为：CNE 2细胞58.70±7.20，空载体-CNE 2细胞60.27±10.80，BHRF 1-CNE 2细胞18.50±6.15。经统计学处理(t检验)，BHRF 1-CNE 2与CNE 2和空载体-CNE 2的增殖指数间的差异有非常显著意义(P<0.01)；CNE 2与空载体-CNE 2的增殖指数间的差异无显著意义(P>0.05)四、BHRF 1表达对细胞周期分布的影响
表1 BHRF 1表达与细胞周期分布的关系
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G1期(%)
G2期(%)
S期(%)
CNE 2
46.6±8.6
17.2±5.9
36.2
空载体-CNE 2
48.5±9.7
18.4±4.4
33.1
BHRF 1-CNE 2
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59.2±11.3
23.2±6.4
17.6
从表1可见，BHRF 1-CNE 2细胞位于G1期和G2期的比率较CNE 2及空载体-CNE 2细胞为高，而位于S期的细胞数下降，其间的差异有显著的意义(0.01
五、原位末端标记法检测BHRF 1表达对CNE 2抗辐射诱发凋亡的能力的影响 阳性凋亡细胞表现为细胞核内有棕褐色颗粒。凋亡指数分别为，BHRF 1-CNE 2细胞：31.4±1.32；空载体-CNE 2细胞：68.5±2.75；CNE 2细胞：71.3±1.90。经统计学处理(t检验)，BHRF 1-CNE 2细胞与空载体-CNE 2和CNE 2细胞间的差异有非常显著的意义(P<0.01)；空载体-CNE 2细胞与CNE 2细胞间的差异无显著意义(P>0.05)。 讨 论
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通过转基因研究发现，BHRF 1表达可抑制细胞的终末分化、并通过抑制细胞凋亡的发生而促进其在无血清情况下生存及抵抗DNA损伤药物的潜力[3，4]。
本研究发现，BHRF 1表达可导致鼻咽癌细胞，处于G1的细胞数增多，而S期的细胞数下降。提示BHRF 1的表达可抑制鼻咽癌细胞从G1期向S期的发展。由于细胞周期各个时期的辐射敏感性是不同的，其敏感性为：M
*本课题为全军医药卫生基金资助项目，批准号：96Q060
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第一作者简介 黄 海，男，博士，主治医师。
参 考 文 献
1 Monaghan P, Robertson D, Amos TA, et al. Ultrastructural localisation of bcl-2 protein. Histochem Cytochem，1992，40：1819
2 Hickish T, Robertson D, Clarke P,et al.Ultrastructural localization of BHRF1: An Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res，1994，54：2808
3 Dawson CW, Eliopoulos AG, Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene, 1995, 9：69
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4 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr Virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection. Virology, 1994, 201：404
5 Mathews MB, Bernsein RM, Franza BR, et al. Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin. Nature, 1984, 309：374
(收稿：1997-08-03 修回：1997-10-27), 百拇医药