白血病细胞株K562和K-HHT系列P-糖蛋白功能逆转的研究
作者：顾静文 Ollivier Legrand Jean-Pierre Marie 林果为
单位：顾静文 林果为(上海医科大学华山医院血液研究室(上海200040)；Ollivier Legrand Jean-Pierre Marie(法国巴黎Hotel-Dieu医院血液实验室)
关键词：白血病，幼红细胞；多药耐药性；P-糖蛋白；逆转；细胞株
肿瘤990208 克服白血病细胞的多药耐药性是当今白血病治疗中的一个热点和难点。多药耐药的发生机制主要是mdr 1基因及其表达产物P-糖蛋白(Pgp)的膜泵作用[1]。有证据表明一些药物能够逆转Pgp，使细胞内药物浓度增高，从而达到杀灭白血病细胞的目的[2]。本实验运用流式细胞仪方法对白血病细胞株K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400进行逆转Pgp的试验，以期探索白血病MDR及其逆转的机理。
, http://www.100md.com
材料和方法
细胞株 K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400为红白血病细胞株及其相应的耐高三尖杉酯碱(HHT)的耐药株，耐药浓度分别为30 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml，由法国巴黎Hotel-Dieu医院血液实验提供。
培养基 RPMI 1640培养基为含有10%胎牛血清、2 mmol青霉素和100 kU/L链霉素的RPMI 1640培养液(Gibco公司)。培养条件为37 ℃和5% CO2培养箱。
其他主要试剂 环孢菌素(CsA)、丙磺舒(Pbc)浓度为10 μg/L和3 μg/L。荧光素R123浓度为0.2 μg/L。
功能性试验及Pgp的逆转
, 百拇医药 1.K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400每株分置5管(组)，每管细胞数400，000个，离心弃上清。
2.在每管中加入250 μl的RPMI 1640培养液。第一管为空白对照，第二管加R123，第三管加R123和CsA，第四管加R123、CsA和Pbc，第五管加R123和Pbc。
3.每管分别放入37 ℃水浴中温育50 min，用RPMI 1640洗涤2次，再加入250 μl的RPMI 1640放入37℃水浴中温育1 h和3 h。
4.在流式细胞仪上分析每管每次温育后的细胞内的荧光强度。
统计学处理 结果采用t检验，用医学统计软件Stata 5.0处理。
结 果
, 百拇医药
细胞内R123检测结果 以流式细胞仪检测细胞内R123被激发的相对荧光强度来代表R123的细胞内含量，结果见附表。
1.在无CsA和Pbc(无逆转剂)组，5种细胞株摄取R123的量随耐药性的增强而减少，1 h和3 h的滞留量也随耐药性的增强而减少。
2.在CsA(一种逆转剂)组，与无逆转剂组相比，耐药株对R123的摄取量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100增加2倍，K-HHT200增加5倍，K-HHT400增加10倍。在1 h和3 h，耐药株对R123的滞留量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400增加约20倍。
3.在CsA和Pbc(两种逆转剂)组，耐药株对R123的摄取量，K-HHT30增加约1倍，K-HHT100增加2倍，K-HHT200增加5倍，K-HHT 400增加10倍。在1 h和3 h，耐药株对R123的滞留量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400增加约20倍。此组细胞株的摄取和滞留R123的量与单用CsA组相仿。
, 百拇医药
4.在Pbc组，各组细胞株对R123的摄取和滞留量与无逆转剂组相仿，细胞内浓度没有增加。
附表 流式细胞仪测得各组细胞株摄取和滞留R123所得荧光强度 细胞株
R123
R123+CsA
R123+CsA+Pbc
R123+Pbc
K562u
227.90±738.64
2725.29±1002.22
2978.55±1092.85
, 百拇医药
2922.02±944.87
1 h
2028.62±702.33
2335.39±925.46
2666.23±1068.57
2601.13±943.79
3 h
2188.07±838.07
2336.80±922.42
2748.26±1060.34
2693.58±1049.80
, 百拇医药
K-HHT30u
1792.25±655.25
2368.27±892.61*
2777.09±1011.71*
1930.97±858.07
1 h
1228.02±732.89
1967.06±812.43*
2444.14±952.77*
1302.90±929.53
, 百拇医药
3 h
1214.59±972.14
2129.23±856.32*
2504.21±987.84*
1324.78±1123.11
K-HHT 100u
932.96±574.62
2858.69±1017.63*
3400.09±1150.07*
732.32±459.25
, 百拇医药
1 h
180.41±289.65
2524.94±900.89*
2933.21±1051.85*
96.89±40.43
3 h
132.39±111.75
2524.50±979.07*
2865.99±1078.91*
78.53±23.29
, http://www.100md.com
K-HHT 200 u
359.32±232.11
2050.83±748.36*
2419.41±860.19*
322.98±217.39
1 h
41.18±26.58
1549.80±585.77*
1926.60±712.16*
31.03±39.67
, 百拇医药
3 h
39.48±20.90
1517.16±583.86*
1837.93±695.77*
34.27±31.48
K-HHT 400 u
336.42±231.65
3567.32±1059.76*
3619.66±1096.39*
346.90±223.87
, 百拇医药
1 h
36.53±19.63
1386.26±600.78*
1818.67±734.20*
32.10±15.87
3 h
42.60±23.30
1109.40±569.52*
1345.99±767.57*
38.06±17.84
, http://www.100md.com
u为细胞株摄取R123时的荧光强度，1 h为细胞株滞留R123 1小时的荧光强度，3 h为细胞株滞留R123 3小时的荧光强度；*表示与R123组相比细胞株内荧光强度增加有显著性。讨 论
近年来发现耐HHT的肿瘤细胞株也对阿霉素、长春新碱、马法兰等化疗药物有交叉耐药。K562的耐药株K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400在mRNA和蛋白质水平均高度表达MDR1和Pgp，且细胞株耐药浓度越高，MDR1表达越强[3]。脂质体染料R123和柔红霉素(DNR)已被证实为Pgp最好的底物[4]，很多研究报告证明用R123在流式细胞仪上分析肿瘤细胞的Pgp功能是非常有价值的。本文中，功能性试验(即无逆转剂组)，5种细胞株摄取R123的量随细胞株耐药性的增强而减少，滞留量亦随细胞株的耐药性增强而减少。细胞株耐药性的强弱与细胞株摄取和滞留药物的浓度呈负相关。这说明Pgp的膜泵作用越强，K-HHT泵出R123的量越多，细胞内药物浓度越低，耐药性越强，与文献报道一致；在CsA组，与无逆转剂组相比，K-HHT系列摄取R123的量大大增加，尤以K-HHT200和K-HHT400为著，从K-HHT30浓度增加不到1倍至K-HHT400浓度增加超过10倍。在1h和3h的滞留中，细胞内浓度亦从K-HHT30的增加不到1倍到K-HHT400的浓度增加约20倍，说明CsA在体外具有很强的增加耐药细胞株对R123的摄取和滞留浓度。其作用机理主要是通过抑制耐药细胞株上P-糖蛋白的膜泵作用，从而使耐药细胞株逆转成敏感细胞株，达到杀伤肿瘤细胞的作用；在CsA和Pbc组，耐药细胞株摄取R123的量也大大增加，在1h和3h的滞留中，细胞内浓度也大大增加，细胞内摄取和滞留R123的增加量与细胞的耐药性成正相关，此组逆转耐药性的作用与单用CsA组相仿，即Pbc并没有增强CsA的逆转作用。在Pbc组，各组细胞株摄取和滞留R123的浓度又远低于CsA组及CsA和Pbc组，与无逆转剂组相近，即并没有增加耐药细胞株对R123的摄取和滞留浓度，这说明Pbc不能增加耐药细胞株摄取和滞留底物R123的能力，因此Pbc不能逆转耐药株上的Pgp。本试验可以提示CsA在体外具有很强的逆转多药耐药细胞株上的Pgp的作用，而另一个逆转剂Pbc则不能逆转Pgp。有证据表明Pbc对多药耐药相关蛋白(MRP)具有抑制作用，而不能抑制Pgp[5]，这与本实验Pbc不能逆转K-HHT的结果相一致。
, http://www.100md.com
CsA是一种从真菌属中提取的天然药物，具有选择性的免疫抑制功能，已广泛用于器官移植后的抗排斥反应及治疗免疫性血液系统疾病。它能竞争性地和Pgp结合，阻断Pgp泵出药物功能从而逆转MDR[2]，与本文报道一致。List[6]对难治性急性髓细胞性白血病用阿糖胞苷(Ara-C)，DNR和CsA进行了Ⅰ/Ⅱ期临床试验，其中每天Ara-C 3 g/m2第1～5天，DNR 每天45 mg/m2和CsA第6～8天，CsA剂量逐步递增，先1～2小时用负荷量1.4 mg/kg～6 mg/kg，然后每天1.5 mg/kg～20 mg/kg连续给药72 小时。42例病人中70% Pgp阳性，完全缓解或回到慢性期62%，3人部分缓解，总有效率为69%。CsA的毒性有恶心、呕吐(22%)，低镁血症(61%)，感觉迟钝(21%)，高胆红素(62%)与CsA剂量有关，3人发生可逆性的氮质血症。在连续给药每天≥16 mg/kg的病人，稳态血浓度≥1500 ng/mg。在发生高胆红素血症的病人中血浆DNR浓度明显升高。List认为在Ⅱ/Ⅲ期临床试验中大剂量的CsA(负荷量6 mg/kg，连续给药每天16 mg/kg)可以达到体外逆转Pgp的血浓度，其毒性作用具可耐受性和可逆性。因此，CsA在逆转多药耐药性的临床研究中具有一定的前景。
, 百拇医药
第一作者简介 顾静文，女，硕士，主治医师。
参 考 文 献
1 Marie JP.P-glycoprotein in adult hematologic malignancies.Hematology/Oncology Clinics North America,1995,9(2):239
2 List AF.The role of multidrug resistance and its pharmacological modulation in acute myeloid leukemia.Leukemia,1996,10(Suppl.1):S36
3 Zhou DC,Ramond S,Viguie F, et al. Sequential emergence of MRP- and MDR1-gene over-expression as well as MDR1-gene translocation in homoharringtonine-selected K562 human leukemia cell lines. Int J Cancer,1996,65:365
, 百拇医药
4 Witherspoon SM,Emerson DL,Kerr BM, et al. Flow cytometric assay of modulation of P-glycoprotein function in whole blood by the multidrug resistance inhibitor GG918.Clinical Cancer Res,1996,2:7
5 Evers R,Zaman GJ,van-Deemter L, et al. Basolateral localization and export activity of the human multidrug resistance-associated protein in polarized pig kidney cells.J Clin Invest,1996,97(5):1211
6 List AF,Apier C,Greer J, et al. Phase Ⅰ/Ⅱ trial of cyclosporine as a chemotherapy-resistance modifier in acute leukemia.J Clin Oncol,1993,11(9):1652
(收稿：1998-05-04 修回：1998-08-06), 百拇医药
单位：顾静文 林果为(上海医科大学华山医院血液研究室(上海200040)；Ollivier Legrand Jean-Pierre Marie(法国巴黎Hotel-Dieu医院血液实验室)
关键词：白血病，幼红细胞；多药耐药性；P-糖蛋白；逆转；细胞株
肿瘤990208 克服白血病细胞的多药耐药性是当今白血病治疗中的一个热点和难点。多药耐药的发生机制主要是mdr 1基因及其表达产物P-糖蛋白(Pgp)的膜泵作用[1]。有证据表明一些药物能够逆转Pgp，使细胞内药物浓度增高，从而达到杀灭白血病细胞的目的[2]。本实验运用流式细胞仪方法对白血病细胞株K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400进行逆转Pgp的试验，以期探索白血病MDR及其逆转的机理。
, http://www.100md.com
材料和方法
细胞株 K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400为红白血病细胞株及其相应的耐高三尖杉酯碱(HHT)的耐药株，耐药浓度分别为30 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml，由法国巴黎Hotel-Dieu医院血液实验提供。
培养基 RPMI 1640培养基为含有10%胎牛血清、2 mmol青霉素和100 kU/L链霉素的RPMI 1640培养液(Gibco公司)。培养条件为37 ℃和5% CO2培养箱。
其他主要试剂 环孢菌素(CsA)、丙磺舒(Pbc)浓度为10 μg/L和3 μg/L。荧光素R123浓度为0.2 μg/L。
功能性试验及Pgp的逆转
, 百拇医药 1.K562，K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400每株分置5管(组)，每管细胞数400，000个，离心弃上清。
2.在每管中加入250 μl的RPMI 1640培养液。第一管为空白对照，第二管加R123，第三管加R123和CsA，第四管加R123、CsA和Pbc，第五管加R123和Pbc。
3.每管分别放入37 ℃水浴中温育50 min，用RPMI 1640洗涤2次，再加入250 μl的RPMI 1640放入37℃水浴中温育1 h和3 h。
4.在流式细胞仪上分析每管每次温育后的细胞内的荧光强度。
统计学处理 结果采用t检验，用医学统计软件Stata 5.0处理。
结 果
, 百拇医药
细胞内R123检测结果 以流式细胞仪检测细胞内R123被激发的相对荧光强度来代表R123的细胞内含量，结果见附表。
1.在无CsA和Pbc(无逆转剂)组，5种细胞株摄取R123的量随耐药性的增强而减少，1 h和3 h的滞留量也随耐药性的增强而减少。
2.在CsA(一种逆转剂)组，与无逆转剂组相比，耐药株对R123的摄取量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100增加2倍，K-HHT200增加5倍，K-HHT400增加10倍。在1 h和3 h，耐药株对R123的滞留量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400增加约20倍。
3.在CsA和Pbc(两种逆转剂)组，耐药株对R123的摄取量，K-HHT30增加约1倍，K-HHT100增加2倍，K-HHT200增加5倍，K-HHT 400增加10倍。在1 h和3 h，耐药株对R123的滞留量，K-HHT30增加不到1倍，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400增加约20倍。此组细胞株的摄取和滞留R123的量与单用CsA组相仿。
, 百拇医药
4.在Pbc组，各组细胞株对R123的摄取和滞留量与无逆转剂组相仿，细胞内浓度没有增加。
附表 流式细胞仪测得各组细胞株摄取和滞留R123所得荧光强度 细胞株
R123
R123+CsA
R123+CsA+Pbc
R123+Pbc
K562u
227.90±738.64
2725.29±1002.22
2978.55±1092.85
, 百拇医药
2922.02±944.87
1 h
2028.62±702.33
2335.39±925.46
2666.23±1068.57
2601.13±943.79
3 h
2188.07±838.07
2336.80±922.42
2748.26±1060.34
2693.58±1049.80
, 百拇医药
K-HHT30u
1792.25±655.25
2368.27±892.61*
2777.09±1011.71*
1930.97±858.07
1 h
1228.02±732.89
1967.06±812.43*
2444.14±952.77*
1302.90±929.53
, 百拇医药
3 h
1214.59±972.14
2129.23±856.32*
2504.21±987.84*
1324.78±1123.11
K-HHT 100u
932.96±574.62
2858.69±1017.63*
3400.09±1150.07*
732.32±459.25
, 百拇医药
1 h
180.41±289.65
2524.94±900.89*
2933.21±1051.85*
96.89±40.43
3 h
132.39±111.75
2524.50±979.07*
2865.99±1078.91*
78.53±23.29
, http://www.100md.com
K-HHT 200 u
359.32±232.11
2050.83±748.36*
2419.41±860.19*
322.98±217.39
1 h
41.18±26.58
1549.80±585.77*
1926.60±712.16*
31.03±39.67
, 百拇医药
3 h
39.48±20.90
1517.16±583.86*
1837.93±695.77*
34.27±31.48
K-HHT 400 u
336.42±231.65
3567.32±1059.76*
3619.66±1096.39*
346.90±223.87
, 百拇医药
1 h
36.53±19.63
1386.26±600.78*
1818.67±734.20*
32.10±15.87
3 h
42.60±23.30
1109.40±569.52*
1345.99±767.57*
38.06±17.84
, http://www.100md.com
u为细胞株摄取R123时的荧光强度，1 h为细胞株滞留R123 1小时的荧光强度，3 h为细胞株滞留R123 3小时的荧光强度；*表示与R123组相比细胞株内荧光强度增加有显著性。讨 论
近年来发现耐HHT的肿瘤细胞株也对阿霉素、长春新碱、马法兰等化疗药物有交叉耐药。K562的耐药株K-HHT30，K-HHT100，K-HHT200，K-HHT400在mRNA和蛋白质水平均高度表达MDR1和Pgp，且细胞株耐药浓度越高，MDR1表达越强[3]。脂质体染料R123和柔红霉素(DNR)已被证实为Pgp最好的底物[4]，很多研究报告证明用R123在流式细胞仪上分析肿瘤细胞的Pgp功能是非常有价值的。本文中，功能性试验(即无逆转剂组)，5种细胞株摄取R123的量随细胞株耐药性的增强而减少，滞留量亦随细胞株的耐药性增强而减少。细胞株耐药性的强弱与细胞株摄取和滞留药物的浓度呈负相关。这说明Pgp的膜泵作用越强，K-HHT泵出R123的量越多，细胞内药物浓度越低，耐药性越强，与文献报道一致；在CsA组，与无逆转剂组相比，K-HHT系列摄取R123的量大大增加，尤以K-HHT200和K-HHT400为著，从K-HHT30浓度增加不到1倍至K-HHT400浓度增加超过10倍。在1h和3h的滞留中，细胞内浓度亦从K-HHT30的增加不到1倍到K-HHT400的浓度增加约20倍，说明CsA在体外具有很强的增加耐药细胞株对R123的摄取和滞留浓度。其作用机理主要是通过抑制耐药细胞株上P-糖蛋白的膜泵作用，从而使耐药细胞株逆转成敏感细胞株，达到杀伤肿瘤细胞的作用；在CsA和Pbc组，耐药细胞株摄取R123的量也大大增加，在1h和3h的滞留中，细胞内浓度也大大增加，细胞内摄取和滞留R123的增加量与细胞的耐药性成正相关，此组逆转耐药性的作用与单用CsA组相仿，即Pbc并没有增强CsA的逆转作用。在Pbc组，各组细胞株摄取和滞留R123的浓度又远低于CsA组及CsA和Pbc组，与无逆转剂组相近，即并没有增加耐药细胞株对R123的摄取和滞留浓度，这说明Pbc不能增加耐药细胞株摄取和滞留底物R123的能力，因此Pbc不能逆转耐药株上的Pgp。本试验可以提示CsA在体外具有很强的逆转多药耐药细胞株上的Pgp的作用，而另一个逆转剂Pbc则不能逆转Pgp。有证据表明Pbc对多药耐药相关蛋白(MRP)具有抑制作用，而不能抑制Pgp[5]，这与本实验Pbc不能逆转K-HHT的结果相一致。
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CsA是一种从真菌属中提取的天然药物，具有选择性的免疫抑制功能，已广泛用于器官移植后的抗排斥反应及治疗免疫性血液系统疾病。它能竞争性地和Pgp结合，阻断Pgp泵出药物功能从而逆转MDR[2]，与本文报道一致。List[6]对难治性急性髓细胞性白血病用阿糖胞苷(Ara-C)，DNR和CsA进行了Ⅰ/Ⅱ期临床试验，其中每天Ara-C 3 g/m2第1～5天，DNR 每天45 mg/m2和CsA第6～8天，CsA剂量逐步递增，先1～2小时用负荷量1.4 mg/kg～6 mg/kg，然后每天1.5 mg/kg～20 mg/kg连续给药72 小时。42例病人中70% Pgp阳性，完全缓解或回到慢性期62%，3人部分缓解，总有效率为69%。CsA的毒性有恶心、呕吐(22%)，低镁血症(61%)，感觉迟钝(21%)，高胆红素(62%)与CsA剂量有关，3人发生可逆性的氮质血症。在连续给药每天≥16 mg/kg的病人，稳态血浓度≥1500 ng/mg。在发生高胆红素血症的病人中血浆DNR浓度明显升高。List认为在Ⅱ/Ⅲ期临床试验中大剂量的CsA(负荷量6 mg/kg，连续给药每天16 mg/kg)可以达到体外逆转Pgp的血浓度，其毒性作用具可耐受性和可逆性。因此，CsA在逆转多药耐药性的临床研究中具有一定的前景。
, 百拇医药
第一作者简介 顾静文，女，硕士，主治医师。
参 考 文 献
1 Marie JP.P-glycoprotein in adult hematologic malignancies.Hematology/Oncology Clinics North America,1995,9(2):239
2 List AF.The role of multidrug resistance and its pharmacological modulation in acute myeloid leukemia.Leukemia,1996,10(Suppl.1):S36
3 Zhou DC,Ramond S,Viguie F, et al. Sequential emergence of MRP- and MDR1-gene over-expression as well as MDR1-gene translocation in homoharringtonine-selected K562 human leukemia cell lines. Int J Cancer,1996,65:365
, 百拇医药
4 Witherspoon SM,Emerson DL,Kerr BM, et al. Flow cytometric assay of modulation of P-glycoprotein function in whole blood by the multidrug resistance inhibitor GG918.Clinical Cancer Res,1996,2:7
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(收稿：1998-05-04 修回：1998-08-06), 百拇医药