UV-C诱导体外平滑肌细胞凋亡的相关信号机理的研究
作者：李晓丹 李 进 张 薇 鲍永耀
单位：
关键词：血管平滑肌细胞；细胞凋亡；紫外线；细胞内游离钙；细胞骨架；信号传递
第一军医大学学报990206 摘要：目的 观察经UV-C照射诱导的体外凋亡动脉中膜平滑肌细胞(SMC)内Ca2+浓度及actin表达的变化。方法 应用SP免疫组织化学技术和图像分析技术检测凋亡SMC内actin的表达；应用粘附细胞分析及筛选激光细胞仪观察凋亡SMC内Ca2+浓度的变化。结果 UV-C照射后，SMC出现典型的凋亡形态学和生化指标上的改变。UV-C动态照射10 min引起胞浆内Ca2+浓度的快速升高；并引起照射后不同时期SMC中Ca2+浓度的持续升高。凋亡SMC 内actin表达较正常大大加强，并出现从胞内向核周、从胞内向核内的迁移和再分布。结论 Ca2+浓度升高和actin表达的改变可能是参与UV-C诱导的SMC凋亡信号传递过程中的重要因素。
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中图分类号：Q233
Study on signaling mechanisms in apoptotic smooth muscle cells induced by ultraviolet-C radiation in vitroLi Xiaodan1, Li Jin2, Zhang Wei3, Pao Yongyao3
1Department of Internal Medical, Guangzhou Medical College of PLA, Guangzhou, 510315; 2Department of Histology, 3Central Laboratory, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: Objective To observe the changes in cytosolic free calcium and expression of actin in apoptotic artery smooth muscle cells (SMCs) induced by ultraviolet-C. Methods SP immunohistochemistry and image analysis were used to determine the expression of actin in apoptotic SMCs. Adherent Cell Analysis and Sorting Interative Laser Cytometer (ACAS 570) was used to observe the changes of cytosolic free calcium concentration in the SMCs. Results Cultured SMCs were found to undergo apoptosis which was characterized by morphological changes and DNA ladder in agarose gel after exposure to UV-C. UV-C radiation for 10 min led to a rapid increase of cytosolic free calcium level and with the elapse of the time, the calcium levels tended to increase progressively. The expression of actin in apoptotic SMCs was distinctly higher than that in normal SMCs and had a trend of migration from pericytial to perinuclear region and from cytoplasm to nucleoplasm. Conclusion Changes in cytosolic free calcium concentration and expression of actin in apoptotic SMCs perhaps are important factors in SMC's apoptosis-signaling transduction process induced by UV-C.
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Key words: smooth muscle cells; apoptosis; ultraviolet; cytosolic free calcium; cytoskeleton; signaling transmission Objective To observe the changes in cytosolic free calcium and expression of actin in apoptotic artery smooth muscle cells (SMCs) induced by ultraviolet-C. Methods SP immunohistochemistry and image analysis were used to determine the expression of actin in apoptotic SMCs. Adherent Cell Analysis and Sorting Interative Laser Cytometer (ACAS 570) was used to observe the changes of cytosolic free calcium concentration in the SMCs. Results Cultured SMCs were found to undergo apoptosis which was characterized by morphological changes and DNA ladder in agarose gel after exposure to UV-C. UV-C radiation for 10 min led to a rapid increase of cytosolic free calcium level and with the elapse of the time, the calcium levels tended to increase progressively. The expression of actin in apoptotic SMCs was distinctly higher than that in normal SMCs and had a trend of migration from pericytial to perinuclear region and from cytoplasm to nucleoplasm. Conclusion Changes in cytosolic free calcium concentration and expression of actin in apoptotic SMCs perhaps are important factors in SMC's apoptosis-signaling transduction process induced by UV-C.
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Key words: smooth muscle cells; apoptosis; ultraviolet; cytosolic free calcium; cytoskeleton; signaling transmission
动脉中膜平滑肌细胞(Smooth muscle cell, SMC)向内膜迁移并大量增生被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)核心病理过程。近年来研究发现，SMC的凋亡也参与了AS的发生发展，无论在正常血管调节数量平衡还是在早期血管损伤方面及在血栓性病变的发生过程中，SMC的凋亡均起到了重要作用。但目前对SMC凋亡的研究主要仍限于描述性，对其内在信号机制尚不清楚，国内对SMC凋亡的研究尚未见报道。本文应用紫外线-C波段(Ultraviolet C, UV-C)照射诱导体外SMC凋亡，并探讨了此凋亡过程的两个可能信号机制的改变：钙离子和细胞微丝骨架蛋白的表达，以期今后进一步深入研究凋亡的内在机制。
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1 材料和方法
1.1 体外血管SMC培养及鉴定 选取重150～200 g的成年SD大鼠，无菌条件下取出胸主动脉，剥离中膜，参照传统的组织贴块法进行SMC原代及传代培养，应用SP免疫组织化学方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM actin)的表达。
1.2 UV-C诱导体外SMC凋亡模型的建立及其检测 取第4～7代生长良好的SMC，胰蛋白酶消化，以108/L浓度接种于D(直径)100 mm平皿中的盖玻片上，应用细胞培养超净台紫外消毒灯发射的UV-C波段光源垂直照射距离其10 cm处的SMC 10 min(照射时去盖，0.5 ml D-Hank液湿润)后，继续培养，动态观察细胞形态变化，并分别取照后24、48、72 h的细胞，行HE染色；于24和48 h提取细胞总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。
1.3 UV-C诱导的凋亡SMC内actin 蛋白表达的研究
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1.3.1 SP免疫组织化学方法 参照SP试剂盒(福州迈新公司)提供的方法，并以PBS缓冲液代替一抗，设立相应的阴性对照片。UV-C照射体外培养的大鼠SMC，方法同上。分别取照射后24、48 h细胞及相应的正常细胞，D-Hank液冲洗1～2次，10 mmol/L PBS冲洗2～3次；纯丙酮固定10 min，自然干燥，PBS冲洗3次，每次3～5 min；3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；加50 μl 10%非免疫性动物血清，室温下孵育10 min，吸出多余液体，加入50 μl一抗(抗微丝骨架蛋白多克隆抗体，Sigma公司)，4 ℃过夜，一抗稀释度为1:40，PBS冲洗，共3次；加入50 μl生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；加入50 μl链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；100 μl新鲜配制的DAB-H2O2溶液，显色3～10 min，显微镜观察，待显色完成后用自来水冲洗3 min，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
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1.3.2 形态计量学方法 每组标本测定3张切片，每张切片测定视野数分别为：24 h 实验组13个，对照组16个；48 h实验组12个，对照组13个；每张切片共测50个细胞，3张切片共计150个细胞，用Quantimet 520图像分析仪进行测量，选择平均光密度值为定量参数。
1.3.3 统计学处理 检测结果以
±s表示，采用两均数间比较的t检验。
1.4 UV-C诱导的凋亡SMC内游离Ca2+浓度变化的研究
1.4.1 SMC内游离钙离子浓度的动态变化 常规消化细胞，以2×108/ L浓度接种于Petri培养皿中，48 h时，吸去培养基，D-Hank液洗2次；加入50 μl 20 μmol/L的Fluo-3-AM染料，37 ℃避光染色1 h，D-Hank液洗3次；加入0.5 ml D-Hank液，上ACAS 570，以移动式UV-C光源照射皿内细胞，去盖，距离10 cm，照射10 min，整个照射过程中Ca2+浓度动态变化均由ACAS 570微机系统测定。荧光标记后，ACAS 570开始动态扫描。记录处于静息状态下的SMC经预扫描3 min，UV-C照射10 min及照射后继续扫描10 min全过程中单个细胞内Ca2+水平的变化，以处理前预扫描所测得的值为基数1，扫描全过程中所得荧光值与预扫描值的比值即为细胞内Ca2+浓度的相对荧光值。
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1.4.2 UV-C照射后不同时期细胞内游离Ca2+浓度的变化 UV-C照射接种于Petri培养皿中的大鼠SMC，方法同前，分别于照射后0、5、25 min 25 mi、1、2、6、18、24、36、48、54 h测定SMC内Ca2+浓度，并设置各时间点的相应对照组。整个检测过程中所用试剂不含Ca2+，保证无外源性Ca2+的影响。
1.4.3 统计学处理 数据以±sD表示，随机设计方差分析，并用Scheffe统计量行均数间两两比较。
2 结果
2.1 体外SMC培养 细胞生长状态具典型“峰与谷”结构，SP免疫组织化学方法观察细胞内α-SM actin表达阳性，证明所得细胞为SMC。
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2.2 UV-C形态学变化 照射后经约3 h细胞体积开始缩小，12 h部分细胞变圆，上浮，随时间推移上浮细胞增多。24 h将爬片生长的细胞经HE染色。光镜下观察可见：细胞体积变小，胞质收缩、深染，核染色质浓缩，聚集于核膜下呈境界分明的颗粒状小体，细胞形态完整。48 h可见多数细胞表现同24 h，亦可见部分细胞膜出泡；72 h可见细胞膜包裹碎裂的核成为凋亡小体。
2.2.1 生化指标检测 于UV-C照射后24、48 h分别提取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳。经UV-C照射后24、48 h的细胞DNA图谱为180～200 bp 的亚单位片段，呈梯子状(ladder)，未经处理的正常细胞其DNA图谱不呈梯状带，说明经UV-C照射后SMC DNA在核小体连接部发生了断裂。
2.3 UV-C诱导的凋亡SMC内actin的表达
2.3.1 免疫组织化学观察 光镜下，SMC经actin免疫组织化学显色后，免疫反应产物呈棕黄色细颗粒位于胞质内，阴性对照片未见阳性细胞。正常平滑肌细胞actin在胞浆中成片均匀表达，弱阳性，胞核内表达阴性。凋亡细胞的actin表达较正常大大增强，在胞浆中分布不均。部分细胞的actin从核旁中心区向细胞周边呈放射状分布，核内强阳性表达，说明actin合成增加，并出现了从胞周到核周、胞浆向核内的迁移和再分布，提示其发生了解聚和重排。UV-C照射后24 h与48 h凋亡细胞微丝骨架蛋白表达情况基本一致。
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2.3.2 形态计量学观察 正常、经UV-C照射10 min后24、48 h大鼠主动脉SMC actin平均光密度值变化见表1。
表1 UV-C 照射后24、48 h SMC内actin的平均Dλ nm值(±s)
Tab. 1 Dλ nm Value of Acin in SMC at 24 h and 48 h after exposure to UV-C (Mean±SD)
Time after Exposure to UV-C
24 h
48 h
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Control
0.045±0.001
0.046±0.002
UV-C
0.073±0.003**
0.071±0.006**
** P<0.01 as compared with control group
与正常对照组相比，UV-C照射后24 h实验组、48 h实验组大鼠主动脉SMC actin表达显著增强(P<0.01)，24 h与48 h实验组比较则无明显差异(P>0.05)。
2.4 UV-C诱导的凋亡SMC内游离Ca2+浓度的变化 细胞处于静息状态时(0～180 s)达峰值16.8，之后开始降低，第780 s停止照射时，荧光值降为6.4，之后有一个小的峰值，第1 020 s时迅速降低，第1 080 s恢复至2，荧光值为照射前基值的两倍。
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UV-C照射后0、5、25 min mi,1、2、6、18、24、36、48、54 h及各时间点相应对照组的测定SMC内游离钙离子浓度由ACAS 570测定，各时间点测定3～4个视野，>200个细胞，荧光值结果以±s表示，n为细胞数。并行各均数间两两比较。各对照组荧光值稳定，行方差分析，P>0.05，无显著差异。
所测荧光值为检测器1与检测器2的比值，无单位，与细胞内Ca2+浓度呈线性关系。
与正常对照组相比，各实验组SMC内钙离子浓度均显著升高(P<0.01)，照射完毕后与照后5 min钙离子浓度无明显差异(P>0.05)，25 min、1 h有明显升高，2 h又较25 min、1 h有一较大的升高(P<0.01)，之后在较长的一段时间内即照后6、18、24、36、48 h均比较稳定，与2 h无明显差异(P>0.05)。可见，UV-C照射SMC后可引起胞浆内游离钙离子浓度的持续升高，且在照后早期随着时间的推移，钙离子浓度有逐步升高的趋势，在照后2 h之后，则稳定维持在较高水平，至54 h方明显降低，但仍高于照后初期Ca2+水平。
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3 讨论
包括UV在内的许多致凋亡因素可引起凋亡细胞内Ca2+浓度升高[1]，这些凋亡过程常伴有凋亡的重要生化标志即染色质的有控降解，此被认为与内源性Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶(endonuclease)有关，且内源性核酸内切酶有选择性地被破坏不仅仅与DNA的有序断裂有关，也是凋亡时细胞形态变化的重要原因[2]。依赖于钙离子的酶还有钙蛋白酶(calpain)和谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)，它们被认为分别与细胞骨架紊乱与细胞皱缩、胞浆蛋白质交联和维持凋亡小体完整、防止细胞内含物外溢有关[1~3]；Bennett等[4]研究发现，位于SMC表面的磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)对于凋亡的SMC被周围的细胞识别及吞噬清除是必不可少的，此过程也是Ca2+依赖性的；另外，Ca2+还可能激活多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)，后者有改变染色质结构的作用，使聚合的核小体松解，减弱组蛋白-DNA相互接触，以使DNA更易被核酸内切酶接近[5]。可见，胞浆内Ca2+的浓度是凋亡发生的重要信号机制之一。
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微丝(microfilament)是细胞骨架的一种，其主要成分是肌动蛋白(actin)，对细胞表面的特性具有很大影响，是维持细胞形状和影响细胞质运动的重要因素，细胞凋亡是一种固缩性死亡，体积缩小、细胞膜出泡、凋亡小体等形态学改变被认为与微丝骨架蛋白的改变密切相关。有研究发现细胞内钙离子浓度变化可导致细胞骨架结构的破裂，微丝的肌动蛋白弯曲，这被认为可能是凋亡时胞膜出泡的原因[6]；以细胞骨架为靶器官的物质则可抑制UV导致的人黑色素瘤M14和A431内皮细胞系凋亡[7]；因此，细胞骨架也被认为是凋亡信号传递过程中的重要因素。
笔者发现UV-C可诱导体外大鼠SMC凋亡，且UV-C动态照射可使胞浆内Ca2+浓度快速升高；照射后及不同时期SMC中Ca2+浓度的持续升高，可能Ca2+参与了UV-C诱导的体外SMC凋亡的信号传递过程。另外，凋亡SMC的actin表达较正常大大增强，且有从胞周向核周迁移的趋势，并出现从胞内向核内的迁移和再分布，提示其发生了解聚和重排，这可能与细胞膜皱缩、出泡、胞浆浓缩及核内染色质的形态变化有关。
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由此看来，UV-C照射引起的SMC内Ca2+浓度升高和actin表达的改变可能均是参与SMC凋亡信号传递的重要因素，二者在时间点上量的变化有相似的趋势，可能存在着一定的联系。
参考文献
1 Carson DA, Ribero JM. Apotosis and disease. Lancet,1993, 341:1251
2 Wyllie AH, Arends MJ, Morris RG et al. The apoptosis endonuclease and its regulation. Semin Immuno, 1992, 4:389
3 Schwartzman PA, Cidlowski JA. The biochemistrine and molecular biology of programmed cell death. Endocrine Rev, 1993,14:133
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4 Bennett MR, Gibcon DF, Schwartz SW et al. Binding and phagocytosis of apoptotic vascular smooth muscle cells is mediated in part by exposure of phosphatidylserine. Circ Res, 1995, 77(6):1136
5 Grassilli E. Tremblay J et al. Studies of relationship between cell proliferation and cell death. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 188: 1261
6 Arends MJ, Mortis R, Wyllie AH. Apoptosis The role of the endonuclease. Am J Pathol , 1990, 136(3):593
7 Malorni W, Rivabene R, Straface E et al. 3-Aminobenzamide protects cells from UV-B induced apoptosis by acting on cytoskeleton and substrate adhesion. Biochem Biophys Res Commun , 1995, 207(2):715
(收稿日期：1998-10-17), 百拇医药
单位：
关键词：血管平滑肌细胞；细胞凋亡；紫外线；细胞内游离钙；细胞骨架；信号传递
第一军医大学学报990206 摘要：目的 观察经UV-C照射诱导的体外凋亡动脉中膜平滑肌细胞(SMC)内Ca2+浓度及actin表达的变化。方法 应用SP免疫组织化学技术和图像分析技术检测凋亡SMC内actin的表达；应用粘附细胞分析及筛选激光细胞仪观察凋亡SMC内Ca2+浓度的变化。结果 UV-C照射后，SMC出现典型的凋亡形态学和生化指标上的改变。UV-C动态照射10 min引起胞浆内Ca2+浓度的快速升高；并引起照射后不同时期SMC中Ca2+浓度的持续升高。凋亡SMC 内actin表达较正常大大加强，并出现从胞内向核周、从胞内向核内的迁移和再分布。结论 Ca2+浓度升高和actin表达的改变可能是参与UV-C诱导的SMC凋亡信号传递过程中的重要因素。
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中图分类号：Q233
Study on signaling mechanisms in apoptotic smooth muscle cells induced by ultraviolet-C radiation in vitroLi Xiaodan1, Li Jin2, Zhang Wei3, Pao Yongyao3
1Department of Internal Medical, Guangzhou Medical College of PLA, Guangzhou, 510315; 2Department of Histology, 3Central Laboratory, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: Objective To observe the changes in cytosolic free calcium and expression of actin in apoptotic artery smooth muscle cells (SMCs) induced by ultraviolet-C. Methods SP immunohistochemistry and image analysis were used to determine the expression of actin in apoptotic SMCs. Adherent Cell Analysis and Sorting Interative Laser Cytometer (ACAS 570) was used to observe the changes of cytosolic free calcium concentration in the SMCs. Results Cultured SMCs were found to undergo apoptosis which was characterized by morphological changes and DNA ladder in agarose gel after exposure to UV-C. UV-C radiation for 10 min led to a rapid increase of cytosolic free calcium level and with the elapse of the time, the calcium levels tended to increase progressively. The expression of actin in apoptotic SMCs was distinctly higher than that in normal SMCs and had a trend of migration from pericytial to perinuclear region and from cytoplasm to nucleoplasm. Conclusion Changes in cytosolic free calcium concentration and expression of actin in apoptotic SMCs perhaps are important factors in SMC's apoptosis-signaling transduction process induced by UV-C.
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Key words: smooth muscle cells; apoptosis; ultraviolet; cytosolic free calcium; cytoskeleton; signaling transmission Objective To observe the changes in cytosolic free calcium and expression of actin in apoptotic artery smooth muscle cells (SMCs) induced by ultraviolet-C. Methods SP immunohistochemistry and image analysis were used to determine the expression of actin in apoptotic SMCs. Adherent Cell Analysis and Sorting Interative Laser Cytometer (ACAS 570) was used to observe the changes of cytosolic free calcium concentration in the SMCs. Results Cultured SMCs were found to undergo apoptosis which was characterized by morphological changes and DNA ladder in agarose gel after exposure to UV-C. UV-C radiation for 10 min led to a rapid increase of cytosolic free calcium level and with the elapse of the time, the calcium levels tended to increase progressively. The expression of actin in apoptotic SMCs was distinctly higher than that in normal SMCs and had a trend of migration from pericytial to perinuclear region and from cytoplasm to nucleoplasm. Conclusion Changes in cytosolic free calcium concentration and expression of actin in apoptotic SMCs perhaps are important factors in SMC's apoptosis-signaling transduction process induced by UV-C.
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Key words: smooth muscle cells; apoptosis; ultraviolet; cytosolic free calcium; cytoskeleton; signaling transmission
动脉中膜平滑肌细胞(Smooth muscle cell, SMC)向内膜迁移并大量增生被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)核心病理过程。近年来研究发现，SMC的凋亡也参与了AS的发生发展，无论在正常血管调节数量平衡还是在早期血管损伤方面及在血栓性病变的发生过程中，SMC的凋亡均起到了重要作用。但目前对SMC凋亡的研究主要仍限于描述性，对其内在信号机制尚不清楚，国内对SMC凋亡的研究尚未见报道。本文应用紫外线-C波段(Ultraviolet C, UV-C)照射诱导体外SMC凋亡，并探讨了此凋亡过程的两个可能信号机制的改变：钙离子和细胞微丝骨架蛋白的表达，以期今后进一步深入研究凋亡的内在机制。
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1 材料和方法
1.1 体外血管SMC培养及鉴定 选取重150～200 g的成年SD大鼠，无菌条件下取出胸主动脉，剥离中膜，参照传统的组织贴块法进行SMC原代及传代培养，应用SP免疫组织化学方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM actin)的表达。
1.2 UV-C诱导体外SMC凋亡模型的建立及其检测 取第4～7代生长良好的SMC，胰蛋白酶消化，以108/L浓度接种于D(直径)100 mm平皿中的盖玻片上，应用细胞培养超净台紫外消毒灯发射的UV-C波段光源垂直照射距离其10 cm处的SMC 10 min(照射时去盖，0.5 ml D-Hank液湿润)后，继续培养，动态观察细胞形态变化，并分别取照后24、48、72 h的细胞，行HE染色；于24和48 h提取细胞总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。
1.3 UV-C诱导的凋亡SMC内actin 蛋白表达的研究
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1.3.1 SP免疫组织化学方法 参照SP试剂盒(福州迈新公司)提供的方法，并以PBS缓冲液代替一抗，设立相应的阴性对照片。UV-C照射体外培养的大鼠SMC，方法同上。分别取照射后24、48 h细胞及相应的正常细胞，D-Hank液冲洗1～2次，10 mmol/L PBS冲洗2～3次；纯丙酮固定10 min，自然干燥，PBS冲洗3次，每次3～5 min；3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；加50 μl 10%非免疫性动物血清，室温下孵育10 min，吸出多余液体，加入50 μl一抗(抗微丝骨架蛋白多克隆抗体，Sigma公司)，4 ℃过夜，一抗稀释度为1:40，PBS冲洗，共3次；加入50 μl生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；加入50 μl链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗，共3次；100 μl新鲜配制的DAB-H2O2溶液，显色3～10 min，显微镜观察，待显色完成后用自来水冲洗3 min，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
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1.3.2 形态计量学方法 每组标本测定3张切片，每张切片测定视野数分别为：24 h 实验组13个，对照组16个；48 h实验组12个，对照组13个；每张切片共测50个细胞，3张切片共计150个细胞，用Quantimet 520图像分析仪进行测量，选择平均光密度值为定量参数。
1.3.3 统计学处理 检测结果以
±s表示，采用两均数间比较的t检验。1.4 UV-C诱导的凋亡SMC内游离Ca2+浓度变化的研究
1.4.1 SMC内游离钙离子浓度的动态变化 常规消化细胞，以2×108/ L浓度接种于Petri培养皿中，48 h时，吸去培养基，D-Hank液洗2次；加入50 μl 20 μmol/L的Fluo-3-AM染料，37 ℃避光染色1 h，D-Hank液洗3次；加入0.5 ml D-Hank液，上ACAS 570，以移动式UV-C光源照射皿内细胞，去盖，距离10 cm，照射10 min，整个照射过程中Ca2+浓度动态变化均由ACAS 570微机系统测定。荧光标记后，ACAS 570开始动态扫描。记录处于静息状态下的SMC经预扫描3 min，UV-C照射10 min及照射后继续扫描10 min全过程中单个细胞内Ca2+水平的变化，以处理前预扫描所测得的值为基数1，扫描全过程中所得荧光值与预扫描值的比值即为细胞内Ca2+浓度的相对荧光值。
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1.4.2 UV-C照射后不同时期细胞内游离Ca2+浓度的变化 UV-C照射接种于Petri培养皿中的大鼠SMC，方法同前，分别于照射后0、5、25 min 25 mi、1、2、6、18、24、36、48、54 h测定SMC内Ca2+浓度，并设置各时间点的相应对照组。整个检测过程中所用试剂不含Ca2+，保证无外源性Ca2+的影响。
1.4.3 统计学处理 数据以
±sD表示，随机设计方差分析，并用Scheffe统计量行均数间两两比较。2 结果
2.1 体外SMC培养 细胞生长状态具典型“峰与谷”结构，SP免疫组织化学方法观察细胞内α-SM actin表达阳性，证明所得细胞为SMC。
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2.2 UV-C形态学变化 照射后经约3 h细胞体积开始缩小，12 h部分细胞变圆，上浮，随时间推移上浮细胞增多。24 h将爬片生长的细胞经HE染色。光镜下观察可见：细胞体积变小，胞质收缩、深染，核染色质浓缩，聚集于核膜下呈境界分明的颗粒状小体，细胞形态完整。48 h可见多数细胞表现同24 h，亦可见部分细胞膜出泡；72 h可见细胞膜包裹碎裂的核成为凋亡小体。
2.2.1 生化指标检测 于UV-C照射后24、48 h分别提取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳。经UV-C照射后24、48 h的细胞DNA图谱为180～200 bp 的亚单位片段，呈梯子状(ladder)，未经处理的正常细胞其DNA图谱不呈梯状带，说明经UV-C照射后SMC DNA在核小体连接部发生了断裂。
2.3 UV-C诱导的凋亡SMC内actin的表达
2.3.1 免疫组织化学观察 光镜下，SMC经actin免疫组织化学显色后，免疫反应产物呈棕黄色细颗粒位于胞质内，阴性对照片未见阳性细胞。正常平滑肌细胞actin在胞浆中成片均匀表达，弱阳性，胞核内表达阴性。凋亡细胞的actin表达较正常大大增强，在胞浆中分布不均。部分细胞的actin从核旁中心区向细胞周边呈放射状分布，核内强阳性表达，说明actin合成增加，并出现了从胞周到核周、胞浆向核内的迁移和再分布，提示其发生了解聚和重排。UV-C照射后24 h与48 h凋亡细胞微丝骨架蛋白表达情况基本一致。
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2.3.2 形态计量学观察 正常、经UV-C照射10 min后24、48 h大鼠主动脉SMC actin平均光密度值变化见表1。
表1 UV-C 照射后24、48 h SMC内actin的平均Dλ nm值(
±s)Tab. 1 Dλ nm Value of Acin in SMC at 24 h and 48 h after exposure to UV-C (Mean±SD)
Time after Exposure to UV-C
24 h
48 h
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Control
0.045±0.001
0.046±0.002
UV-C
0.073±0.003**
0.071±0.006**
** P<0.01 as compared with control group
与正常对照组相比，UV-C照射后24 h实验组、48 h实验组大鼠主动脉SMC actin表达显著增强(P<0.01)，24 h与48 h实验组比较则无明显差异(P>0.05)。
2.4 UV-C诱导的凋亡SMC内游离Ca2+浓度的变化 细胞处于静息状态时(0～180 s)达峰值16.8，之后开始降低，第780 s停止照射时，荧光值降为6.4，之后有一个小的峰值，第1 020 s时迅速降低，第1 080 s恢复至2，荧光值为照射前基值的两倍。
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UV-C照射后0、5、25 min mi,1、2、6、18、24、36、48、54 h及各时间点相应对照组的测定SMC内游离钙离子浓度由ACAS 570测定，各时间点测定3～4个视野，>200个细胞，荧光值结果以
±s表示，n为细胞数。并行各均数间两两比较。各对照组荧光值稳定，行方差分析，P>0.05，无显著差异。所测荧光值为检测器1与检测器2的比值，无单位，与细胞内Ca2+浓度呈线性关系。
与正常对照组相比，各实验组SMC内钙离子浓度均显著升高(P<0.01)，照射完毕后与照后5 min钙离子浓度无明显差异(P>0.05)，25 min、1 h有明显升高，2 h又较25 min、1 h有一较大的升高(P<0.01)，之后在较长的一段时间内即照后6、18、24、36、48 h均比较稳定，与2 h无明显差异(P>0.05)。可见，UV-C照射SMC后可引起胞浆内游离钙离子浓度的持续升高，且在照后早期随着时间的推移，钙离子浓度有逐步升高的趋势，在照后2 h之后，则稳定维持在较高水平，至54 h方明显降低，但仍高于照后初期Ca2+水平。
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3 讨论
包括UV在内的许多致凋亡因素可引起凋亡细胞内Ca2+浓度升高[1]，这些凋亡过程常伴有凋亡的重要生化标志即染色质的有控降解，此被认为与内源性Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶(endonuclease)有关，且内源性核酸内切酶有选择性地被破坏不仅仅与DNA的有序断裂有关，也是凋亡时细胞形态变化的重要原因[2]。依赖于钙离子的酶还有钙蛋白酶(calpain)和谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)，它们被认为分别与细胞骨架紊乱与细胞皱缩、胞浆蛋白质交联和维持凋亡小体完整、防止细胞内含物外溢有关[1~3]；Bennett等[4]研究发现，位于SMC表面的磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)对于凋亡的SMC被周围的细胞识别及吞噬清除是必不可少的，此过程也是Ca2+依赖性的；另外，Ca2+还可能激活多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)，后者有改变染色质结构的作用，使聚合的核小体松解，减弱组蛋白-DNA相互接触，以使DNA更易被核酸内切酶接近[5]。可见，胞浆内Ca2+的浓度是凋亡发生的重要信号机制之一。
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微丝(microfilament)是细胞骨架的一种，其主要成分是肌动蛋白(actin)，对细胞表面的特性具有很大影响，是维持细胞形状和影响细胞质运动的重要因素，细胞凋亡是一种固缩性死亡，体积缩小、细胞膜出泡、凋亡小体等形态学改变被认为与微丝骨架蛋白的改变密切相关。有研究发现细胞内钙离子浓度变化可导致细胞骨架结构的破裂，微丝的肌动蛋白弯曲，这被认为可能是凋亡时胞膜出泡的原因[6]；以细胞骨架为靶器官的物质则可抑制UV导致的人黑色素瘤M14和A431内皮细胞系凋亡[7]；因此，细胞骨架也被认为是凋亡信号传递过程中的重要因素。
笔者发现UV-C可诱导体外大鼠SMC凋亡，且UV-C动态照射可使胞浆内Ca2+浓度快速升高；照射后及不同时期SMC中Ca2+浓度的持续升高，可能Ca2+参与了UV-C诱导的体外SMC凋亡的信号传递过程。另外，凋亡SMC的actin表达较正常大大增强，且有从胞周向核周迁移的趋势，并出现从胞内向核内的迁移和再分布，提示其发生了解聚和重排，这可能与细胞膜皱缩、出泡、胞浆浓缩及核内染色质的形态变化有关。
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由此看来，UV-C照射引起的SMC内Ca2+浓度升高和actin表达的改变可能均是参与SMC凋亡信号传递的重要因素，二者在时间点上量的变化有相似的趋势，可能存在着一定的联系。
参考文献
1 Carson DA, Ribero JM. Apotosis and disease. Lancet,1993, 341:1251
2 Wyllie AH, Arends MJ, Morris RG et al. The apoptosis endonuclease and its regulation. Semin Immuno, 1992, 4:389
3 Schwartzman PA, Cidlowski JA. The biochemistrine and molecular biology of programmed cell death. Endocrine Rev, 1993,14:133
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4 Bennett MR, Gibcon DF, Schwartz SW et al. Binding and phagocytosis of apoptotic vascular smooth muscle cells is mediated in part by exposure of phosphatidylserine. Circ Res, 1995, 77(6):1136
5 Grassilli E. Tremblay J et al. Studies of relationship between cell proliferation and cell death. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 188: 1261
6 Arends MJ, Mortis R, Wyllie AH. Apoptosis The role of the endonuclease. Am J Pathol , 1990, 136(3):593
7 Malorni W, Rivabene R, Straface E et al. 3-Aminobenzamide protects cells from UV-B induced apoptosis by acting on cytoskeleton and substrate adhesion. Biochem Biophys Res Commun , 1995, 207(2):715
(收稿日期：1998-10-17), 百拇医药