益气活血方对阿霉素肾病影响的实验研究
作者：汪贤聪 邵朝弟 王小琴
单位：汪贤聪 武警湖北总队医院(430061)；邵朝弟 王小琴 湖北中医学院附属医院
关键词：益气活血方；阿霉素；肾病；氧自由基
湖北中医杂志/990236 摘要：通过一次性尾静脉注射阿霉素的方法，复制出阿霉素肾病模型，并观察中药益气活血方对该模型的影响。结果表明：益气活血方能减少尿蛋白，改善白蛋白血症及肾组织病变，即对阿霉素肾病有防治作用。其作用机制可能是通过抗氧化，能保护肾组织免受脂质过氧化损伤。
1 材料和方法
1.1 实验材料：(1)实验动物：同龄健康雄性Sprague-Dawley系大白鼠18只，体重170～220g，由中国医学科学院提供。以市售饲料及自来水饲养。
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(2)实验药品：①益气活血方：生黄芪、益母草等，生药饮片由湖北中医学院附属医院提供。药物制备方法：将上药置于药罐中，加水适量，浸泡30分钟后加热煮沸，开始用武火，沸后用文火，保持煮沸时间40分钟，过滤。再加水适量再煎1次后过滤。然后将两次滤液浓缩至每毫升含生药0.54g。
②阿霉素(Adriamycin，ADR)为意大利爱宝大药厂(Farmitala Carlo Erbr)产品，批号为5010BA。
1.2 实验方法：
(1)动物分组：先用普通方法喂养动物1周后，按体重大小随机将18只大白鼠分为3组(每组6只)：正常对照组(A组)、病理对照组(B组)、实验组(C组)。
(2)模型制作：B组及C组大鼠，于实验第1天按5mg/kg剂量1次性尾静脉注射ADR(用生理盐水配成0.1%溶液)，而A组大鼠，则按上述方法及同等剂量注射生理盐水。自注射当天起，C组按1ml/100g/d给予中药煎剂灌胃1次，A组及B组，则按上述方法及剂量给予自来水灌胃1次。三组大鼠均观察28天后处死。
, 百拇医药
1.3 观察指标
(1)24小时尿蛋白定量：禁食后收集大鼠24小时尿量，用磺柳酸法测定尿蛋白含量。于造模前、造模后第7天、14天、21天、28天各测定一次；
(2)血清总蛋白、白蛋白：总蛋白用双缩脲法测定，白蛋白用溴甲酚绿法测定；
(3)血清总胆固醇：用胆固醇氧化酶法测定；
(4)血清肌酐、尿素氮：血清肌酐用苦味酸动力学法测定，尿素氮用二乙酰一肟法测定；
(5)血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)：SOD用邻苯二酚法测定，MDA用TBA比色法测定。
上述血液生化指标在实验结束时经眼眶采血留取血清标本测定。
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(6)光镜：取左肾组织，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。
(7)电镜：取右肾组织，用2%戊二醛固定30分钟，再用1%锇酸固定1小时，脱水，Epron812常规包埋，制作超薄切片，铀-铅双染色，用日本H-600型透射电镜观察(拍片条件为50～70KV，X8000)。
1.4 统计学处理
所有数据均以均数±标准差表示(
±SD)，并用单因素方差分析，组间比较用q检验。
2 结果
2.1 动物一般情况：造模后第4天开始，B组及C组分别有5只和1只老鼠出现一过性轻度腹泻，且活动量及进食量减少，至第7天腹泻停止，进食及活动亦恢复正常。整个实验过程无动物死亡。各组动物均未出现明显皮下水肿及腹水。
, 百拇医药
2.2 24小时尿蛋白定量比较(见表1)。
表1 各组大鼠24小时尿蛋白结果(±SD) n=6 组 别
尿 蛋 白(mg/24h)
造模前
7d
14d
21d
28d
A组
2.12±0.18
2.10±0.18
, 百拇医药
2.10±0.16
2.22±0.38
2.13±0.18
B组
2.07±0.14
4.16±1.62
12.21±2.50*
25.42±5.99*
35.69±5.52*
C组
2.09±0.20
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3.35±1.11
10.90±1.61*
18.23±2.28*
26.49±4.17*#
注：* 与A组比较P<0.01；# 与B组比较P<0.01
2.3 血清总胆固醇、总蛋白、白蛋白结果比较(见表2)。表2 血清总胆固醇、总蛋白、白蛋白比较(±SD) 组别
总胆固醇
Cho(mmol/L)
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总蛋白
Tp(g/l)
白蛋白
Alb(g/l)
A组
1.71±
0.17
76.93±
8.57
32.76±
4.02
A组
3.17±
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0.61*
68.44±
3.79
22.44±
2.29*
C组
3.70±
0.54*
72.86±
8.81
29.00±
5.90#
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注：* 与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05
2.4 血清肌酐、尿素氮结果 (见表3)。表3 血清肌酐、尿素氮结果表(±SD) n=6 组 别
肌酐
Scr(umol/L)
尿素氮
Bun(mmol/L)
A组
86.19±5.50
8.93±0.93
B组
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79.85±4.90
10.65±1.42
C组
80.02±5.18
9.95±1.24
注：各组间比较无显著性意义(P>0.05)
2.5 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)结果(见表4)。表4 血清SOD、MDA结果(±SD) 组 别
SOD
(u/mi)
, 百拇医药 MDA
(nmol/L)
A组
1.95±0.27
3.29±0.58
B组
0.62±0.18**
6.78±1.69**
C组
1.61±0.21*△
4.46±1.10#
, 百拇医药
注：*与A组比较，P<0.05；**与B组比较，P<0.01；#与C组比较，P<0.05；*△与B组比较，P<0.01。
2.6 肾组织病理改变
光镜：A组、B组及C组光镜下，肾小球及肾小管均未见明显病理改变。
电镜：电镜下B组可见大鼠肾小球上皮细胞肿胀，足突广泛融合，胞浆未见空泡；肾小管上皮细胞肿胀，核肿大，胞浆中空泡较多，浅粒体数目减少，排列紊乱，溶酶体电子密度增加。C组肾小球上皮细胞肿胀明显减轻，足突轻度融合；肾小管上皮细胞核增大，胞浆中空泡较少，线粒体排列较整齐，数目未见明显减少。A组肾小球、肾小管无明显病理改变。
3 讨论
ADR肾病模型制备简便，现已成为肾病综合征的常见研究模型之一[1]。近来，国内外对活性氧的研究表明，ADR肾病模型的形成与氧自由基有着密切的关系[1，2，3，4]。ADR属于蒽环类抗生素，含有醌式结构，在体内通过线粒体NADA脱氢酶的作用还原成半醌自由基，产生O-2、H2O2及*OH，进一步损伤DNA，使线粒体膜脂质过氧化，使氧化磷酸化脱偶联，破坏线粒体功能及结构，结果使肾小球滤过膜通透性增加而产生蛋白尿，进而出现肾病综合征的表现[5]。
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本实验结果显示：病理对照组SOD含量比正常对照组显著性降低(P<0.01)，MDA含量则较正常对照组显著性升高(P<0.01)。这一结果与上述文献报道一致，说明氧自由基及脂质过氧化作用可能是ADR肾病形成的机理之一。
益气活血方由黄芪、益母草等组成，具有益气活血利水之功效。现代药理研究表明，黄芪有抗氧化作用[6～7]。益母草有改变血液流变学及保护急性肾小管坏死的作用[8～9]。从表1、表2及电镜结果可以看出：益气活血方具有明显的减轻蛋白尿、改善白蛋白及肾脏组织病变的作用，说明该方能防治ADR肾病。由表4可知，实验组SOD含量明显高于病理对照组(P<0.01)，MDA则明显低于病理对照组(P<0.05)。SOD含量高低，代表清除自由基的能力；MDA为脂质过氧化的降解产物，其含量高低则代表脂质过氧化的程度。由此可见，益气活血方通过提高SOD的含量，改善抗氧化能力，并抑制脂质过氧化，保护肾组织免受脂质过氧化损伤，从而起到防治ADR肾病的作用。 参考文献
, 百拇医药
[1] 李保春等.大鼠阿霉素肾病模型的建立.第二军医大学学报，1992，13(5)：485
[2] Bertani T et al Adriamycin cin-induced nepnrotic Syndrome in rats.Lab Invest 1982，46(1)：16
[3] 李玲嶙等.雷公藤治疗阿霉素肾病的实验研究.湖南医科大学学报，1994，19(2)：111
[4] 吴升华等.活性氧在阿霉素肾病中致病作用的实验研究.中国病理生理杂志，1991，7(3)：306
[5] Minnaμgh EG.et al.Enhancement of reactive oxygen-dependent mitochondrial membrane lipid peroxidation by the anticancer adrμg adriamycin.Biochem pharmacol.1985，34(6)：847
, 百拇医药
[6] 汪德清等.黄芪的三种提取成分对氧自由基作用的影响.中国药理学通报，1994，10(2)：129～132
[7] 汪德清等.黄芪有效成分对氧自由基清除作用的实验研究.生物化学与生物物理进展，1996，23(3)：260
[8] 魏文太.益母草膏降低血液粘度疗效观察.中国血液流变学杂志，1993，(1)：49
[9] 夏晓红等.益母草防治初发期急性肾小管坏死的实验研究.中国病理生理杂志，1994，10(2)：147
(收稿日期：1998-04-08), 百拇医药
单位：汪贤聪 武警湖北总队医院(430061)；邵朝弟 王小琴 湖北中医学院附属医院
关键词：益气活血方；阿霉素；肾病；氧自由基
湖北中医杂志/990236 摘要：通过一次性尾静脉注射阿霉素的方法，复制出阿霉素肾病模型，并观察中药益气活血方对该模型的影响。结果表明：益气活血方能减少尿蛋白，改善白蛋白血症及肾组织病变，即对阿霉素肾病有防治作用。其作用机制可能是通过抗氧化，能保护肾组织免受脂质过氧化损伤。
1 材料和方法
1.1 实验材料：(1)实验动物：同龄健康雄性Sprague-Dawley系大白鼠18只，体重170～220g，由中国医学科学院提供。以市售饲料及自来水饲养。
, http://www.100md.com
(2)实验药品：①益气活血方：生黄芪、益母草等，生药饮片由湖北中医学院附属医院提供。药物制备方法：将上药置于药罐中，加水适量，浸泡30分钟后加热煮沸，开始用武火，沸后用文火，保持煮沸时间40分钟，过滤。再加水适量再煎1次后过滤。然后将两次滤液浓缩至每毫升含生药0.54g。
②阿霉素(Adriamycin，ADR)为意大利爱宝大药厂(Farmitala Carlo Erbr)产品，批号为5010BA。
1.2 实验方法：
(1)动物分组：先用普通方法喂养动物1周后，按体重大小随机将18只大白鼠分为3组(每组6只)：正常对照组(A组)、病理对照组(B组)、实验组(C组)。
(2)模型制作：B组及C组大鼠，于实验第1天按5mg/kg剂量1次性尾静脉注射ADR(用生理盐水配成0.1%溶液)，而A组大鼠，则按上述方法及同等剂量注射生理盐水。自注射当天起，C组按1ml/100g/d给予中药煎剂灌胃1次，A组及B组，则按上述方法及剂量给予自来水灌胃1次。三组大鼠均观察28天后处死。
, 百拇医药
1.3 观察指标
(1)24小时尿蛋白定量：禁食后收集大鼠24小时尿量，用磺柳酸法测定尿蛋白含量。于造模前、造模后第7天、14天、21天、28天各测定一次；
(2)血清总蛋白、白蛋白：总蛋白用双缩脲法测定，白蛋白用溴甲酚绿法测定；
(3)血清总胆固醇：用胆固醇氧化酶法测定；
(4)血清肌酐、尿素氮：血清肌酐用苦味酸动力学法测定，尿素氮用二乙酰一肟法测定；
(5)血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)：SOD用邻苯二酚法测定，MDA用TBA比色法测定。
上述血液生化指标在实验结束时经眼眶采血留取血清标本测定。
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(6)光镜：取左肾组织，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。
(7)电镜：取右肾组织，用2%戊二醛固定30分钟，再用1%锇酸固定1小时，脱水，Epron812常规包埋，制作超薄切片，铀-铅双染色，用日本H-600型透射电镜观察(拍片条件为50～70KV，X8000)。
1.4 统计学处理
所有数据均以均数±标准差表示(
±SD)，并用单因素方差分析，组间比较用q检验。2 结果
2.1 动物一般情况：造模后第4天开始，B组及C组分别有5只和1只老鼠出现一过性轻度腹泻，且活动量及进食量减少，至第7天腹泻停止，进食及活动亦恢复正常。整个实验过程无动物死亡。各组动物均未出现明显皮下水肿及腹水。
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2.2 24小时尿蛋白定量比较(见表1)。
表1 各组大鼠24小时尿蛋白结果(
±SD) n=6 组 别尿 蛋 白(mg/24h)
造模前
7d
14d
21d
28d
A组
2.12±0.18
2.10±0.18
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2.10±0.16
2.22±0.38
2.13±0.18
B组
2.07±0.14
4.16±1.62
12.21±2.50*
25.42±5.99*
35.69±5.52*
C组
2.09±0.20
, http://www.100md.com
3.35±1.11
10.90±1.61*
18.23±2.28*
26.49±4.17*#
注：* 与A组比较P<0.01；# 与B组比较P<0.01
2.3 血清总胆固醇、总蛋白、白蛋白结果比较(见表2)。表2 血清总胆固醇、总蛋白、白蛋白比较(
±SD) 组别总胆固醇
Cho(mmol/L)
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总蛋白
Tp(g/l)
白蛋白
Alb(g/l)
A组
1.71±
0.17
76.93±
8.57
32.76±
4.02
A组
3.17±
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0.61*
68.44±
3.79
22.44±
2.29*
C组
3.70±
0.54*
72.86±
8.81
29.00±
5.90#
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注：* 与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05
2.4 血清肌酐、尿素氮结果 (见表3)。表3 血清肌酐、尿素氮结果表(
±SD) n=6 组 别肌酐
Scr(umol/L)
尿素氮
Bun(mmol/L)
A组
86.19±5.50
8.93±0.93
B组
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79.85±4.90
10.65±1.42
C组
80.02±5.18
9.95±1.24
注：各组间比较无显著性意义(P>0.05)
2.5 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)结果(见表4)。表4 血清SOD、MDA结果(
±SD) 组 别SOD
(u/mi)
, 百拇医药 MDA
(nmol/L)
A组
1.95±0.27
3.29±0.58
B组
0.62±0.18**
6.78±1.69**
C组
1.61±0.21*△
4.46±1.10#
, 百拇医药
注：*与A组比较，P<0.05；**与B组比较，P<0.01；#与C组比较，P<0.05；*△与B组比较，P<0.01。
2.6 肾组织病理改变
光镜：A组、B组及C组光镜下，肾小球及肾小管均未见明显病理改变。
电镜：电镜下B组可见大鼠肾小球上皮细胞肿胀，足突广泛融合，胞浆未见空泡；肾小管上皮细胞肿胀，核肿大，胞浆中空泡较多，浅粒体数目减少，排列紊乱，溶酶体电子密度增加。C组肾小球上皮细胞肿胀明显减轻，足突轻度融合；肾小管上皮细胞核增大，胞浆中空泡较少，线粒体排列较整齐，数目未见明显减少。A组肾小球、肾小管无明显病理改变。
3 讨论
ADR肾病模型制备简便，现已成为肾病综合征的常见研究模型之一[1]。近来，国内外对活性氧的研究表明，ADR肾病模型的形成与氧自由基有着密切的关系[1，2，3，4]。ADR属于蒽环类抗生素，含有醌式结构，在体内通过线粒体NADA脱氢酶的作用还原成半醌自由基，产生O-2、H2O2及*OH，进一步损伤DNA，使线粒体膜脂质过氧化，使氧化磷酸化脱偶联，破坏线粒体功能及结构，结果使肾小球滤过膜通透性增加而产生蛋白尿，进而出现肾病综合征的表现[5]。
, http://www.100md.com
本实验结果显示：病理对照组SOD含量比正常对照组显著性降低(P<0.01)，MDA含量则较正常对照组显著性升高(P<0.01)。这一结果与上述文献报道一致，说明氧自由基及脂质过氧化作用可能是ADR肾病形成的机理之一。
益气活血方由黄芪、益母草等组成，具有益气活血利水之功效。现代药理研究表明，黄芪有抗氧化作用[6～7]。益母草有改变血液流变学及保护急性肾小管坏死的作用[8～9]。从表1、表2及电镜结果可以看出：益气活血方具有明显的减轻蛋白尿、改善白蛋白及肾脏组织病变的作用，说明该方能防治ADR肾病。由表4可知，实验组SOD含量明显高于病理对照组(P<0.01)，MDA则明显低于病理对照组(P<0.05)。SOD含量高低，代表清除自由基的能力；MDA为脂质过氧化的降解产物，其含量高低则代表脂质过氧化的程度。由此可见，益气活血方通过提高SOD的含量，改善抗氧化能力，并抑制脂质过氧化，保护肾组织免受脂质过氧化损伤，从而起到防治ADR肾病的作用。 参考文献
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[1] 李保春等.大鼠阿霉素肾病模型的建立.第二军医大学学报，1992，13(5)：485
[2] Bertani T et al Adriamycin cin-induced nepnrotic Syndrome in rats.Lab Invest 1982，46(1)：16
[3] 李玲嶙等.雷公藤治疗阿霉素肾病的实验研究.湖南医科大学学报，1994，19(2)：111
[4] 吴升华等.活性氧在阿霉素肾病中致病作用的实验研究.中国病理生理杂志，1991，7(3)：306
[5] Minnaμgh EG.et al.Enhancement of reactive oxygen-dependent mitochondrial membrane lipid peroxidation by the anticancer adrμg adriamycin.Biochem pharmacol.1985，34(6)：847
, 百拇医药
[6] 汪德清等.黄芪的三种提取成分对氧自由基作用的影响.中国药理学通报，1994，10(2)：129～132
[7] 汪德清等.黄芪有效成分对氧自由基清除作用的实验研究.生物化学与生物物理进展，1996，23(3)：260
[8] 魏文太.益母草膏降低血液粘度疗效观察.中国血液流变学杂志，1993，(1)：49
[9] 夏晓红等.益母草防治初发期急性肾小管坏死的实验研究.中国病理生理杂志，1994，10(2)：147
(收稿日期：1998-04-08), 百拇医药