虎杖蒽醌化合物抗CVB3病毒的实验研究
作者：王志洁
单位：湖北医科大学病毒研究所，湖北 武汉 430071
关键词：虎杖蒽醌化合物；晶Ⅰ、晶Ⅳ；3型B组柯萨基病毒(CVB3)；药理学
成都中医药大学学报990222 摘 要： 目的：为了解虎杖蒽醌化合物晶Ⅰ、晶Ⅳ抗CVB3病毒的药效，从而明确虎杖的抗病毒性能并开发利用。方法：以病毒唑为阳性对照，利用空斑减数实验进行研究。结果：在HEP-2细胞系统中，晶Ⅰ对CVB3直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50分别为1.54μg/mL、8.34μg/mL、3.06μg/mL，晶Ⅳ的相应系数分别为1.79μg/mL、7.05μg/mL、3.17μg/mL，而病毒唑的相应系数分别为6.26μg/mL、7.55μg/mL、7.50μg/mL。结论：晶Ⅰ对CVB3的治疗指数(TI)为病毒唑对CVB3的TI的4.7、1.0、2.9倍；晶Ⅳ对CVB3的治疗指数(TI)为病毒唑对CVB3的TI的27.5、8.4、18.8倍，提示晶Ⅰ、晶Ⅳ的抗CVB3方面有一定优势。
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中图分类号： R285.5;R978.7 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0041-03
柯萨基病毒B组可引起流行性胸痛、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎和心包炎，尤其是3型B组柯萨基病毒(CVB3)引起的人类心肌炎及扩张性心肌病，给人类带来了极大的威胁[1]。病毒唑可延长患CVB3心肌炎小鼠的寿命，但有一定毒性。CVB3疫苗虽然可抑制小鼠CVB3心肌炎，可是需要制备大量的病毒抗原，成本过高，难以推广及大量使用[2]。因而，筛选研制抗CVB3的新药一直受到重视。
虎杖为一种抗病毒谱范围较广的中药，据报道，虎杖大黄素(Emodin)cfHSV-1、HSV-2、假狂犬病毒、流感及副流感病毒等均有抑制作用[3～4]。我们从虎杖中抽取到蒽醌类化合物晶Ⅰ、晶Ⅳ，并对其抗CVB3的药效进行了研究，现将实验结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药 虎杖由湖北医科大学附属第二医院中药房提供。
1.1.2 病毒唑(ribavirin) 批号980612-1，武汉滨湖制药厂生产。
1.1.3 细胞与病毒 HEP-2细胞购自湖北省医学科学院病毒研究所。CVB3由本室保存。按本室常规培养细胞，繁殖病毒。CVB3TCID50为109/0.1mL。
1.2 方法
1.2.1 蒽醌类化合物分离 采用水提法[5]。具体方法为：将虎杖根茎片用适量去离子水煎煮3次，合并水煎液，加入无水乙醇，使乙醇浓度分别达60%、75%、80%，过滤沉淀以除去杂质。减压浓缩回收乙醇。剩下的水液用苯萃取，回收苯，用冰乙酸重结晶得橙红色针晶，暂称晶Ⅰ。水液用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解，放置，过滤，有红棕色沉淀析出，重结晶得到的晶体暂称晶Ⅳ。使晶Ⅰ、晶Ⅳ室温自然挥发至干，用含1%Tween-80(分析纯)的PBS配制晶Ⅰ、晶Ⅳ母液，浓度分别为4200μg/mL(晶Ⅰ)、4190μg/mL(晶Ⅳ)。G6漏斗抽滤分装待用。实验时培养液含Tween-80为0.001%。
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1.2.2 空斑减数实验 本研究所有抗CVB3试验均以病毒唑为阳性对照，并设置正常细胞对照以及单用CVB3感染实验时加入等体积含Tween-80的PBS阴性对照组。所用感染复数为1PFu/细胞。实验以3种方式进行。①药物对CVB3的直接杀灭：CVB3悬液与含药培养液37℃孵1h以后，感染细胞；②药物对CVB3感染细胞的阻断作用：以含药培养液预先与细胞孵2h，再以CVB3感染细胞；③药物对CVB3增殖的抑制作用：先感染CVB3，再以含药培养液孵育。经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羟甲基纤维素)，观察15h[6]。弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)÷病毒对照组空斑数。
1.2.3 细胞毒性试验 长成单层的细胞加入含药培养液孵育达72h后，以苔盼蓝拒染法计数死活细胞数。
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1.2.4 ED50及细胞毒IC50的计算 采用“加权直线回归法”进行计算。
2 结果
2.1 晶Ⅰ、晶Ⅳ的基本性质
晶Ⅰ溶点255～257℃，不溶于水，略溶于乙醇，微溶于苯，能溶于碳酸钠溶液。菲林反应阴性，氨显色为红色，即Borntrger反应阳性。与醋酸镁甲醇溶液反应显粉红色。紫外吸收光谱红外吸收光谱、CMC硅胶板薄层层析结果与文献[7]报道一致，故确定为大黄素。晶Ⅳ难溶于冷水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮。遇氨水显红色，即Borntrger反应阳性，与醋酸镁的甲醇溶液反应显粉红色，说明晶Ⅳ可能是一种蒽醌化合物。
2.2 晶Ⅰ(大黄素)抗CVB3空斑减数试验结果
从图1可见，在晶Ⅰ(大黄素)对CVB3的直接杀灭、对增殖抑制及感染阻断的试验中，随着晶Ⅰ剂量的增加，CVB3的空斑减数率也随之增加并与之成正比。病毒唑对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50分别为6.26μg/mL、7.55μg/mL、7.50μg/mL，ED90分别为22.95μg/mL、23.42μg/mL、19.99μg/mL。晶Ⅰ对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50依次为1.54μg/mL、8.34μg/mL、3.06μg/mL，ED90则依次为12.23μg/mL、13.76μg/mL、15.01μg/mL，比病毒唑的相应数值小，说明晶Ⅰ抗CVB3的药效比病毒唑强。
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图1：晶Ⅰ抗CVB3空斑减数实验结果。
代表Ⅰ对
CVB3的直接杀灭。
代表晶Ⅰ对CVB3增殖
的抑制。
代表晶Ⅰ对CVB3感染的阻断。
2.3 晶Ⅳ抗CVB3空斑减数试验结果
从图2可见，在晶Ⅳ对CVB3的直接杀灭、对增殖抑制及感染阻断的试验中，随着晶Ⅳ剂量的增加，CVB3的空斑减数率也随之增加并与之成正比。晶Ⅳ对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50依次为1.79μg/mL、7.05μg/mL、3.17μg/mL，ED90则依次为9.20μg/mL、11.61μg/mL、9.34μg/mL，比病毒唑的相应数值为小，说明晶Ⅳ抗CVB3的药效比病毒唑强。
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图2：晶Ⅵ抗CVB3空斑减数实验结果。
代表Ⅳ
对CVB3的直接杀灭。
代表晶Ⅳ对CVB3增
殖的抑制。
代表晶Ⅳ对CVB3感染的阻断。
2.4 晶Ⅰ、晶Ⅳ的细胞毒作用
病毒唑对HEP-2的细胞的IC50为289.60μg/mL。晶Ⅰ的IC50为332.90μg/mL，晶Ⅳ的IC502266μg/mL。
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3 讨论
比较上述实验结果，不难得出以下结论：①晶Ⅰ除了对CVB3增殖抑制的ED50剂量比病毒唑稍大之外，对CVB3直接杀灭、感染阻断的ED50、ED90以及对CVB3增殖抑制的ED90均比病毒唑小，说明晶Ⅰ抗CVB3的药药效比病毒唑强；②晶Ⅳ对CVB3直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50、ED90均比病毒唑小，抗CVB3的药效也比病毒唑强；③在晶Ⅰ、晶Ⅳ抗CVB3的3种实验中，随着晶Ⅰ、晶Ⅳ剂量的加大，CVB3空斑减数率也随之加大并与之成正比关系；④晶Ⅰ与晶Ⅳ抗CVB3的药效相近。
治疗指数(TreatmentIndex，TI)=IC50/ED50。如果统一按直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的顺序排列，病毒唑对CVB3的TI为46、38、38。晶Ⅰ对CVB3的TI为216、39、109，为病毒唑TI的4.7、1.0、2.9倍；晶Ⅳ对CVB3的TI为1266、321、715，为病毒唑TI的27.5、8.4、18.8倍，为晶ⅠTI的5.9、8.2、6.6倍。从细胞毒性考虑，晶Ⅳ比晶Ⅰ更有开发前景。
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我们将进一步在动物实验中检测我们的结果，并对晶Ⅳ的理化性质进行研究。
基金项目：湖北省自然科学基金资助课题。
作者简介：王志洁，女，1945年5月生；硕士，副研究员；人体生化专业；研究方向：宫颈癌与病毒病因的关系及中草药在抗癌抗病毒中的应用。
参考文献
1 Martino T A,Liu P,Sole M J.Viral infection and the pathogenesis of dilated cardiomypathy.Circ Res，1994，74(2)：182
2 Fohlman J，Parlkson K，Morein B，et al.High yield production of an inactivated coxsackie B3 and juvant vaccind with protective effect against experimenta-1 myocarditis.Scand J Infect Dis Suppl，1993，88：103
, 百拇医药
3 Dougl-as O A，Norbert D W，Steven G W，et al.In vitro virucidal activity of selected anthraquinones and with anthraquinone derivatives.Antiviral Res，1991，16：185
4 Sydiskis R J，Owen D G，Lohr J L，et al.Inactivation of enveloped viruses by anthraquinones extracted from pla-nts.Antimicrb Agents Chemother，1991，35(12)：2463
5 林启寿.中草药成分化学.北京：科学技术出版社，1977.194
6 陈福祥，刘晶星，陆德源.苦参总碱体外抗柯萨基B病毒3型作用测定及其机理的初步研究.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(2)：115
7 中国人民解放军广字173部队防治慢性气管炎中草药研究组.阴阳莲治疗慢性气管炎有效成分的研究.中草药通讯，1974，2：6
(收稿日期：1999-02-03), 百拇医药
单位：湖北医科大学病毒研究所，湖北 武汉 430071
关键词：虎杖蒽醌化合物；晶Ⅰ、晶Ⅳ；3型B组柯萨基病毒(CVB3)；药理学
成都中医药大学学报990222 摘 要： 目的：为了解虎杖蒽醌化合物晶Ⅰ、晶Ⅳ抗CVB3病毒的药效，从而明确虎杖的抗病毒性能并开发利用。方法：以病毒唑为阳性对照，利用空斑减数实验进行研究。结果：在HEP-2细胞系统中，晶Ⅰ对CVB3直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50分别为1.54μg/mL、8.34μg/mL、3.06μg/mL，晶Ⅳ的相应系数分别为1.79μg/mL、7.05μg/mL、3.17μg/mL，而病毒唑的相应系数分别为6.26μg/mL、7.55μg/mL、7.50μg/mL。结论：晶Ⅰ对CVB3的治疗指数(TI)为病毒唑对CVB3的TI的4.7、1.0、2.9倍；晶Ⅳ对CVB3的治疗指数(TI)为病毒唑对CVB3的TI的27.5、8.4、18.8倍，提示晶Ⅰ、晶Ⅳ的抗CVB3方面有一定优势。
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中图分类号： R285.5;R978.7 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0041-03
柯萨基病毒B组可引起流行性胸痛、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎和心包炎，尤其是3型B组柯萨基病毒(CVB3)引起的人类心肌炎及扩张性心肌病，给人类带来了极大的威胁[1]。病毒唑可延长患CVB3心肌炎小鼠的寿命，但有一定毒性。CVB3疫苗虽然可抑制小鼠CVB3心肌炎，可是需要制备大量的病毒抗原，成本过高，难以推广及大量使用[2]。因而，筛选研制抗CVB3的新药一直受到重视。
虎杖为一种抗病毒谱范围较广的中药，据报道，虎杖大黄素(Emodin)cfHSV-1、HSV-2、假狂犬病毒、流感及副流感病毒等均有抑制作用[3～4]。我们从虎杖中抽取到蒽醌类化合物晶Ⅰ、晶Ⅳ，并对其抗CVB3的药效进行了研究，现将实验结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药 虎杖由湖北医科大学附属第二医院中药房提供。
1.1.2 病毒唑(ribavirin) 批号980612-1，武汉滨湖制药厂生产。
1.1.3 细胞与病毒 HEP-2细胞购自湖北省医学科学院病毒研究所。CVB3由本室保存。按本室常规培养细胞，繁殖病毒。CVB3TCID50为109/0.1mL。
1.2 方法
1.2.1 蒽醌类化合物分离 采用水提法[5]。具体方法为：将虎杖根茎片用适量去离子水煎煮3次，合并水煎液，加入无水乙醇，使乙醇浓度分别达60%、75%、80%，过滤沉淀以除去杂质。减压浓缩回收乙醇。剩下的水液用苯萃取，回收苯，用冰乙酸重结晶得橙红色针晶，暂称晶Ⅰ。水液用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解，放置，过滤，有红棕色沉淀析出，重结晶得到的晶体暂称晶Ⅳ。使晶Ⅰ、晶Ⅳ室温自然挥发至干，用含1%Tween-80(分析纯)的PBS配制晶Ⅰ、晶Ⅳ母液，浓度分别为4200μg/mL(晶Ⅰ)、4190μg/mL(晶Ⅳ)。G6漏斗抽滤分装待用。实验时培养液含Tween-80为0.001%。
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1.2.2 空斑减数实验 本研究所有抗CVB3试验均以病毒唑为阳性对照，并设置正常细胞对照以及单用CVB3感染实验时加入等体积含Tween-80的PBS阴性对照组。所用感染复数为1PFu/细胞。实验以3种方式进行。①药物对CVB3的直接杀灭：CVB3悬液与含药培养液37℃孵1h以后，感染细胞；②药物对CVB3感染细胞的阻断作用：以含药培养液预先与细胞孵2h，再以CVB3感染细胞；③药物对CVB3增殖的抑制作用：先感染CVB3，再以含药培养液孵育。经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羟甲基纤维素)，观察15h[6]。弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)÷病毒对照组空斑数。
1.2.3 细胞毒性试验 长成单层的细胞加入含药培养液孵育达72h后，以苔盼蓝拒染法计数死活细胞数。
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1.2.4 ED50及细胞毒IC50的计算 采用“加权直线回归法”进行计算。
2 结果
2.1 晶Ⅰ、晶Ⅳ的基本性质
晶Ⅰ溶点255～257℃，不溶于水，略溶于乙醇，微溶于苯，能溶于碳酸钠溶液。菲林反应阴性，氨显色为红色，即Borntrger反应阳性。与醋酸镁甲醇溶液反应显粉红色。紫外吸收光谱红外吸收光谱、CMC硅胶板薄层层析结果与文献[7]报道一致，故确定为大黄素。晶Ⅳ难溶于冷水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮。遇氨水显红色，即Borntrger反应阳性，与醋酸镁的甲醇溶液反应显粉红色，说明晶Ⅳ可能是一种蒽醌化合物。
2.2 晶Ⅰ(大黄素)抗CVB3空斑减数试验结果
从图1可见，在晶Ⅰ(大黄素)对CVB3的直接杀灭、对增殖抑制及感染阻断的试验中，随着晶Ⅰ剂量的增加，CVB3的空斑减数率也随之增加并与之成正比。病毒唑对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50分别为6.26μg/mL、7.55μg/mL、7.50μg/mL，ED90分别为22.95μg/mL、23.42μg/mL、19.99μg/mL。晶Ⅰ对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50依次为1.54μg/mL、8.34μg/mL、3.06μg/mL，ED90则依次为12.23μg/mL、13.76μg/mL、15.01μg/mL，比病毒唑的相应数值小，说明晶Ⅰ抗CVB3的药效比病毒唑强。
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图1：晶Ⅰ抗CVB3空斑减数实验结果。
代表Ⅰ对CVB3的直接杀灭。
代表晶Ⅰ对CVB3增殖的抑制。
代表晶Ⅰ对CVB3感染的阻断。2.3 晶Ⅳ抗CVB3空斑减数试验结果
从图2可见，在晶Ⅳ对CVB3的直接杀灭、对增殖抑制及感染阻断的试验中，随着晶Ⅳ剂量的增加，CVB3的空斑减数率也随之增加并与之成正比。晶Ⅳ对CVB3的直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50依次为1.79μg/mL、7.05μg/mL、3.17μg/mL，ED90则依次为9.20μg/mL、11.61μg/mL、9.34μg/mL，比病毒唑的相应数值为小，说明晶Ⅳ抗CVB3的药效比病毒唑强。
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图2：晶Ⅵ抗CVB3空斑减数实验结果。
代表Ⅳ对CVB3的直接杀灭。
代表晶Ⅳ对CVB3增殖的抑制。
代表晶Ⅳ对CVB3感染的阻断。2.4 晶Ⅰ、晶Ⅳ的细胞毒作用
病毒唑对HEP-2的细胞的IC50为289.60μg/mL。晶Ⅰ的IC50为332.90μg/mL，晶Ⅳ的IC502266μg/mL。
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3 讨论
比较上述实验结果，不难得出以下结论：①晶Ⅰ除了对CVB3增殖抑制的ED50剂量比病毒唑稍大之外，对CVB3直接杀灭、感染阻断的ED50、ED90以及对CVB3增殖抑制的ED90均比病毒唑小，说明晶Ⅰ抗CVB3的药药效比病毒唑强；②晶Ⅳ对CVB3直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的ED50、ED90均比病毒唑小，抗CVB3的药效也比病毒唑强；③在晶Ⅰ、晶Ⅳ抗CVB3的3种实验中，随着晶Ⅰ、晶Ⅳ剂量的加大，CVB3空斑减数率也随之加大并与之成正比关系；④晶Ⅰ与晶Ⅳ抗CVB3的药效相近。
治疗指数(TreatmentIndex，TI)=IC50/ED50。如果统一按直接杀灭、增殖抑制、感染阻断的顺序排列，病毒唑对CVB3的TI为46、38、38。晶Ⅰ对CVB3的TI为216、39、109，为病毒唑TI的4.7、1.0、2.9倍；晶Ⅳ对CVB3的TI为1266、321、715，为病毒唑TI的27.5、8.4、18.8倍，为晶ⅠTI的5.9、8.2、6.6倍。从细胞毒性考虑，晶Ⅳ比晶Ⅰ更有开发前景。
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我们将进一步在动物实验中检测我们的结果，并对晶Ⅳ的理化性质进行研究。
基金项目：湖北省自然科学基金资助课题。
作者简介：王志洁，女，1945年5月生；硕士，副研究员；人体生化专业；研究方向：宫颈癌与病毒病因的关系及中草药在抗癌抗病毒中的应用。
参考文献
1 Martino T A,Liu P,Sole M J.Viral infection and the pathogenesis of dilated cardiomypathy.Circ Res，1994，74(2)：182
2 Fohlman J，Parlkson K，Morein B，et al.High yield production of an inactivated coxsackie B3 and juvant vaccind with protective effect against experimenta-1 myocarditis.Scand J Infect Dis Suppl，1993，88：103
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3 Dougl-as O A，Norbert D W，Steven G W，et al.In vitro virucidal activity of selected anthraquinones and with anthraquinone derivatives.Antiviral Res，1991，16：185
4 Sydiskis R J，Owen D G，Lohr J L，et al.Inactivation of enveloped viruses by anthraquinones extracted from pla-nts.Antimicrb Agents Chemother，1991，35(12)：2463
5 林启寿.中草药成分化学.北京：科学技术出版社，1977.194
6 陈福祥，刘晶星，陆德源.苦参总碱体外抗柯萨基B病毒3型作用测定及其机理的初步研究.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(2)：115
7 中国人民解放军广字173部队防治慢性气管炎中草药研究组.阴阳莲治疗慢性气管炎有效成分的研究.中草药通讯，1974，2：6
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