胆囊结石患者胆囊胆汁细菌群同步培养分析
作者：方驰华 高 鹏
单位：第一军医大学珠江医院肝胆外科(广州 510282)
关键词：胆囊结石；胆囊炎；胆汁；细菌
中国普外基础与临床杂志990210 摘要 为研究胆汁细菌变迁，探讨胆结石核心形成与细菌感染的关系，采用X、Y及L型培养液对98例胆囊结石患者胆汁中细菌群进行了检测。结果：98例之胆汁中有细菌生长者88例，其中单菌生长54例，多菌生长34例；细菌系X型83例，L型23例，Y型5例。本检测结果提示：胆道感染时胆汁中细菌发生了变迁，主要以粘质沙雷氏菌、大肠杆菌为主。胆囊结石核心形成与细菌感染密切相关。
SYNCHRONIC ANALYSIS OF BILIARY BACTERIAL FLORA IN PATIENTS WITH GALLSTONES
, 百拇医药
Fang Chihua, Gao Peng.
Department of Hepatic-Biliary Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282
Abstract To study bacterial changes of bile, to detect relationship between formation of core of gallstones and bacterial infection. Floras of bacteria in bile were studied in patients with gallstones by using aerobic, anaerobic and L-forms (X, Y,L) culturing system.Results: Bacterial growth positive was found in 88 of 98 patients in which single bacterial growth accounted for 54 cases, multiple growth 34 including type X 83, type L 23 and type Y 5. The results show that some alteration of bacteria flora exists during biliary infection and S. Liguefaoiens and E. Coli are the most frequent bacteria present. Formation of the core of gallstone might be related with bacterial infection.
, 百拇医药
Key words Gallstone Cholecystitis Bile Bacteria
胆道细菌感染一直是人们所关注的问题。胆汁中细菌的菌株也在不断发生变化，细胞壁缺陷菌(L型菌)由于特殊的致病作用引起广泛兴趣。本实验采用需氧菌、厌氧菌、L型菌(X、Y、L)培养液对胆囊结石患者胆囊胆汁进行同步细菌培养，旨在为临床应用抗生素提供参考依据。
1 对象和方法
1.1 对象
98例胆囊结石患者，男21例，女77例，年龄16～73岁，平均46.21±12.78岁。均经B超及CT检查确诊为单纯胆囊结石，且近半年来无急性胆囊炎发作史和抗生素应用史，均施行腹腔镜胆囊切除术。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 标本的采集 腹腔镜胆囊切除术中在经脐穿刺孔取出胆囊后，术者立即用无菌注射器穿刺胆囊，抽取胆汁4～5ml，分别滴3滴于X、Y及L型细菌培养液中，混匀后将针孔无菌封好送检。
1.2.2 培养 将已接种的培养基置35℃温箱中培养，分别于6～8、18～24及48小时不同时间观察各培养瓶液体变化。一旦发现有混浊、絮状、颗粒状或挂壁生长现象，即取培养物转种相应分离培养基。
1.2.3 鉴定 对X瓶中分离的不同类型细菌，按细菌常规进行鉴定。Y瓶中采用Y型菌鉴定的不同生化系列鉴定板，将其鉴定到种。L型菌首先在低倍镜下观察菌落形态特征，取L型菌株连续转种于回复培养基，传2～5代不等，返祖为细菌型，并鉴定到
种。
2 结果
2.1 胆汁细菌培养结果
, 百拇医药
检测98例胆囊结石患者之胆囊胆汁，有细菌生长者88例，占89.80%，其中单种细菌生长54例，两种以上细菌生长34例。X型菌生长13种，83例，其中粘质沙雷氏菌36例，大肠埃氏杆菌13例，产气肠杆菌9例，产硷假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌各5例，金葡菌和表皮葡萄球菌各3例，阴沟肠杆菌、施氏假单胞菌、消化沙雷氏菌各2例，近平滑念球菌、木糖氧化无色杆菌、弗劳地氏枸橼酸杆菌各1例。厌氧菌生长2种，5例，其中脆弱类杆菌2例，消化链球菌3例。单纯L型菌生长7种，23例，其中粘质沙雷氏菌9例，大肠埃氏杆菌5例，金葡菌、表皮葡萄球菌各3例，G-丝状菌、近平滑念球菌、阴沟肠杆菌各1例。
2.2 5种主要细菌药敏试验
结果见附表。
附表 胆汁中5种细菌药敏试验结果*(例，n＝68) 细菌种类
, 百拇医药 n
氯霉素
丁胺卡那
卡那霉素
庆大霉素
先锋霉素Ⅵ
粘质沙雷氏菌
X型
36
21
16
22
17
, 百拇医药 20
L型
9
8
5
4
4
4
产硷假单胞菌
5
-
-
-
-
, 百拇医药
-
产气肠杆菌
9
4
2
4
2
5
大肠埃氏杆菌
X型
13
13
7
9
, 百拇医药
-
7
L型
5
5
2
4
4
2
肺炎克雷伯氏菌
5
3
2
3
, 百拇医药
2
4
*表中均为敏感结果，不包括中度敏感和耐药结果
3 讨论
3.1 胆汁中细菌菌种变迁
胆汁检测细菌分为两大类，即需氧菌和厌氧菌，前者从菌株上以大肠杆菌为主，其次为克雷伯氏菌属、肠球菌属、假单孢菌属、肠道杆菌属等；后者从菌株上以类杆菌属为主。本组细菌生长阳性者88例，占89.80%，显著高于文献报道〔1〕，可能与采用X、Y及L细菌群同步检测有关。在83例需氧菌中，菌株也与以往文献报道的不相同，本组中粘质沙雷氏菌占43.37%(36/83)，大肠埃氏杆菌占15.66%(13/83)，产气肠杆菌占10.84%(9/83)，产硷假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌各占6.02%(5/83)，其它占19.28%(16/83)。
, http://www.100md.com
3.2 胆汁细菌L型及意义
细菌L型或称细胞壁缺陷型细菌，是缺乏了细胞壁的G+和G-细菌。它可以是自发的，也可以是人工诱导的。采用免疫组化方法研究慢性胆囊炎组织切片，发现80.30%患者感染细菌为L型〔2〕。原因可能是在于胆汁是细菌变为L型的诱导剂。在体外试验中，发现去氧胆酸钠能溶解G-细菌的脂质外膜而引起细胞壁破坏，故胆盐和胆汁常作为L型菌的诱导剂。当胆囊收缩、胆盐含量增高时，有利于细菌L型的形成和生长。慢性胆囊炎患者的胆汁中分离出细菌L型，可在胆汁中长期存活并能回复，成为胆囊慢性损害的重要因素或病原体的伴存与携带形式〔3〕。另一方面，由于L型菌细胞壁缺损，可造成某些细胞壁(抗原)成分的丢失，逃避机体免疫系统攻击，形成免疫耐受状态在宿主体内长期存在，引起持续性和反复发作的慢性疾病〔4〕。本组资料中，检测L型菌23例，占26.14%(23/88)。
, 百拇医药
3.3 胆道感染与胆囊结石形成
张启宇等〔5〕研究发现，在正常胆汁中加入大肠杆菌，孵育后形成的胆汁沉淀物中胆红素含量高于正常胆汁放置后形成的沉淀物，说明细菌在胆红素沉淀中的作用。本研究中，胆汁的细菌生长率为89.80%。这些细菌酶可以将卵磷脂及结合胆汁酸降解为脂肪酸和游离脂肪酸，从而消耗了胆汁的胆盐和卵磷脂，使得胆固醇析出沉积。此外，由于L型菌有细胞壁缺陷，易粘集成堆并可能与脱落的粘膜上皮细胞共同构成胆结石的核心。
3.4 胆汁细菌群同步培养的意义
在以往的胆汁细菌研究中，只注意需氧菌和厌氧菌，没有注意胆汁中L型菌研究，而胆汁中L型菌存在和回复对抗生素选择十分重要。细菌变成L型之后，对作用于细胞壁生物合成的抗生素均表现为耐药，但对作用于细胞膜、核酸和抑制蛋白质合成抗生素的敏感性不变〔4〕。本组分析了粘质沙雷氏菌、产硷假单胞菌、产硷肠杆菌、大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌5种细菌共68例中，对青霉素耐药65例，占97.05%；对氨苄青霉素耐药63例，占94.11%；而对氯霉素敏感43例，占63.24%；卡那霉素敏感37例，占54.41%；丁胺卡那霉素敏感28例，占41.18%；庆大霉素敏感21例，占30.88%；头孢类抗生素敏感36例，占52.94%。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 王洪江，郭仁宣. 急性胆道感染胆汁细菌学调查和抗生素选用研究. 中国实用外科杂志， 1994； 10(9)∶551
2 黄谷良，林特夫，郭秉兰等编著. 细菌L型与疾病. 第1版. 北京：学苑出版社， 1991∶153
3 王 和，余秀清，徐 英. 用非高渗透压培养基从慢性胆囊炎胆囊分离细菌L型. 中华医学检验杂志， 1994； 17(5)∶263
4 倪涪星，殷常红，蓝鸿泰. 细菌L型研究的某些进展. 中华医学检验杂志， 1994； 17(5)∶305
5 张启宇， 孙春洪，朱 唏等. 细菌污染对胆汁中晶体沉淀的影响. 中华内科杂志， 1993； 32(12)∶829
(1998-01-11收稿，1998-06-17修回), 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院肝胆外科(广州 510282)
关键词：胆囊结石；胆囊炎；胆汁；细菌
中国普外基础与临床杂志990210 摘要 为研究胆汁细菌变迁，探讨胆结石核心形成与细菌感染的关系，采用X、Y及L型培养液对98例胆囊结石患者胆汁中细菌群进行了检测。结果：98例之胆汁中有细菌生长者88例，其中单菌生长54例，多菌生长34例；细菌系X型83例，L型23例，Y型5例。本检测结果提示：胆道感染时胆汁中细菌发生了变迁，主要以粘质沙雷氏菌、大肠杆菌为主。胆囊结石核心形成与细菌感染密切相关。
SYNCHRONIC ANALYSIS OF BILIARY BACTERIAL FLORA IN PATIENTS WITH GALLSTONES
, 百拇医药
Fang Chihua, Gao Peng.
Department of Hepatic-Biliary Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282
Abstract To study bacterial changes of bile, to detect relationship between formation of core of gallstones and bacterial infection. Floras of bacteria in bile were studied in patients with gallstones by using aerobic, anaerobic and L-forms (X, Y,L) culturing system.Results: Bacterial growth positive was found in 88 of 98 patients in which single bacterial growth accounted for 54 cases, multiple growth 34 including type X 83, type L 23 and type Y 5. The results show that some alteration of bacteria flora exists during biliary infection and S. Liguefaoiens and E. Coli are the most frequent bacteria present. Formation of the core of gallstone might be related with bacterial infection.
, 百拇医药
Key words Gallstone Cholecystitis Bile Bacteria
胆道细菌感染一直是人们所关注的问题。胆汁中细菌的菌株也在不断发生变化，细胞壁缺陷菌(L型菌)由于特殊的致病作用引起广泛兴趣。本实验采用需氧菌、厌氧菌、L型菌(X、Y、L)培养液对胆囊结石患者胆囊胆汁进行同步细菌培养，旨在为临床应用抗生素提供参考依据。
1 对象和方法
1.1 对象
98例胆囊结石患者，男21例，女77例，年龄16～73岁，平均46.21±12.78岁。均经B超及CT检查确诊为单纯胆囊结石，且近半年来无急性胆囊炎发作史和抗生素应用史，均施行腹腔镜胆囊切除术。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 标本的采集 腹腔镜胆囊切除术中在经脐穿刺孔取出胆囊后，术者立即用无菌注射器穿刺胆囊，抽取胆汁4～5ml，分别滴3滴于X、Y及L型细菌培养液中，混匀后将针孔无菌封好送检。
1.2.2 培养 将已接种的培养基置35℃温箱中培养，分别于6～8、18～24及48小时不同时间观察各培养瓶液体变化。一旦发现有混浊、絮状、颗粒状或挂壁生长现象，即取培养物转种相应分离培养基。
1.2.3 鉴定 对X瓶中分离的不同类型细菌，按细菌常规进行鉴定。Y瓶中采用Y型菌鉴定的不同生化系列鉴定板，将其鉴定到种。L型菌首先在低倍镜下观察菌落形态特征，取L型菌株连续转种于回复培养基，传2～5代不等，返祖为细菌型，并鉴定到
种。
2 结果
2.1 胆汁细菌培养结果
, 百拇医药
检测98例胆囊结石患者之胆囊胆汁，有细菌生长者88例，占89.80%，其中单种细菌生长54例，两种以上细菌生长34例。X型菌生长13种，83例，其中粘质沙雷氏菌36例，大肠埃氏杆菌13例，产气肠杆菌9例，产硷假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌各5例，金葡菌和表皮葡萄球菌各3例，阴沟肠杆菌、施氏假单胞菌、消化沙雷氏菌各2例，近平滑念球菌、木糖氧化无色杆菌、弗劳地氏枸橼酸杆菌各1例。厌氧菌生长2种，5例，其中脆弱类杆菌2例，消化链球菌3例。单纯L型菌生长7种，23例，其中粘质沙雷氏菌9例，大肠埃氏杆菌5例，金葡菌、表皮葡萄球菌各3例，G-丝状菌、近平滑念球菌、阴沟肠杆菌各1例。
2.2 5种主要细菌药敏试验
结果见附表。
附表 胆汁中5种细菌药敏试验结果*(例，n＝68) 细菌种类
, 百拇医药 n
氯霉素
丁胺卡那
卡那霉素
庆大霉素
先锋霉素Ⅵ
粘质沙雷氏菌
X型
36
21
16
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17
, 百拇医药 20
L型
9
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5
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4
产硷假单胞菌
5
-
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, 百拇医药
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产气肠杆菌
9
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大肠埃氏杆菌
X型
13
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, 百拇医药
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5
5
2
4
4
2
肺炎克雷伯氏菌
5
3
2
3
, 百拇医药
2
4
*表中均为敏感结果，不包括中度敏感和耐药结果
3 讨论
3.1 胆汁中细菌菌种变迁
胆汁检测细菌分为两大类，即需氧菌和厌氧菌，前者从菌株上以大肠杆菌为主，其次为克雷伯氏菌属、肠球菌属、假单孢菌属、肠道杆菌属等；后者从菌株上以类杆菌属为主。本组细菌生长阳性者88例，占89.80%，显著高于文献报道〔1〕，可能与采用X、Y及L细菌群同步检测有关。在83例需氧菌中，菌株也与以往文献报道的不相同，本组中粘质沙雷氏菌占43.37%(36/83)，大肠埃氏杆菌占15.66%(13/83)，产气肠杆菌占10.84%(9/83)，产硷假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌各占6.02%(5/83)，其它占19.28%(16/83)。
, http://www.100md.com
3.2 胆汁细菌L型及意义
细菌L型或称细胞壁缺陷型细菌，是缺乏了细胞壁的G+和G-细菌。它可以是自发的，也可以是人工诱导的。采用免疫组化方法研究慢性胆囊炎组织切片，发现80.30%患者感染细菌为L型〔2〕。原因可能是在于胆汁是细菌变为L型的诱导剂。在体外试验中，发现去氧胆酸钠能溶解G-细菌的脂质外膜而引起细胞壁破坏，故胆盐和胆汁常作为L型菌的诱导剂。当胆囊收缩、胆盐含量增高时，有利于细菌L型的形成和生长。慢性胆囊炎患者的胆汁中分离出细菌L型，可在胆汁中长期存活并能回复，成为胆囊慢性损害的重要因素或病原体的伴存与携带形式〔3〕。另一方面，由于L型菌细胞壁缺损，可造成某些细胞壁(抗原)成分的丢失，逃避机体免疫系统攻击，形成免疫耐受状态在宿主体内长期存在，引起持续性和反复发作的慢性疾病〔4〕。本组资料中，检测L型菌23例，占26.14%(23/88)。
, 百拇医药
3.3 胆道感染与胆囊结石形成
张启宇等〔5〕研究发现，在正常胆汁中加入大肠杆菌，孵育后形成的胆汁沉淀物中胆红素含量高于正常胆汁放置后形成的沉淀物，说明细菌在胆红素沉淀中的作用。本研究中，胆汁的细菌生长率为89.80%。这些细菌酶可以将卵磷脂及结合胆汁酸降解为脂肪酸和游离脂肪酸，从而消耗了胆汁的胆盐和卵磷脂，使得胆固醇析出沉积。此外，由于L型菌有细胞壁缺陷，易粘集成堆并可能与脱落的粘膜上皮细胞共同构成胆结石的核心。
3.4 胆汁细菌群同步培养的意义
在以往的胆汁细菌研究中，只注意需氧菌和厌氧菌，没有注意胆汁中L型菌研究，而胆汁中L型菌存在和回复对抗生素选择十分重要。细菌变成L型之后，对作用于细胞壁生物合成的抗生素均表现为耐药，但对作用于细胞膜、核酸和抑制蛋白质合成抗生素的敏感性不变〔4〕。本组分析了粘质沙雷氏菌、产硷假单胞菌、产硷肠杆菌、大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌5种细菌共68例中，对青霉素耐药65例，占97.05%；对氨苄青霉素耐药63例，占94.11%；而对氯霉素敏感43例，占63.24%；卡那霉素敏感37例，占54.41%；丁胺卡那霉素敏感28例，占41.18%；庆大霉素敏感21例，占30.88%；头孢类抗生素敏感36例，占52.94%。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 王洪江，郭仁宣. 急性胆道感染胆汁细菌学调查和抗生素选用研究. 中国实用外科杂志， 1994； 10(9)∶551
2 黄谷良，林特夫，郭秉兰等编著. 细菌L型与疾病. 第1版. 北京：学苑出版社， 1991∶153
3 王 和，余秀清，徐 英. 用非高渗透压培养基从慢性胆囊炎胆囊分离细菌L型. 中华医学检验杂志， 1994； 17(5)∶263
4 倪涪星，殷常红，蓝鸿泰. 细菌L型研究的某些进展. 中华医学检验杂志， 1994； 17(5)∶305
5 张启宇， 孙春洪，朱 唏等. 细菌污染对胆汁中晶体沉淀的影响. 中华内科杂志， 1993； 32(12)∶829
(1998-01-11收稿，1998-06-17修回), 百拇医药