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编号:10253334
一氧化氮对实验性肾炎中肾小球花生四烯酸产物的影响
http://www.100md.com 《肾脏病与透析肾移植杂志》 1999年第2期
     作者:吴升华 张淑英 林致华 Elias A.Lianos

    单位:南京医科大学第一附属医院儿科(南京,210029);Elias A.Lianos △美国威斯康辛医学院肾科

    关键词:一氧化氮;花生四烯酸产物;肾小球肾炎

    摘 要 目的

    摘 要 目的:探讨一氧化氮(NO)在实验性肾小球肾炎中对肾小球花生四烯酸(AA)产物合成的调节作用。方法: 制备大鼠加速性肾毒性肾炎(NSN)模型,应用高效液相层析及放免法测定肾小球合成的前列腺素(PG)E2、6-酮-PGF、血栓素(TX)B2、白三烯(LT)B4、LTC4、5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)、12-HETE、15-HETE。对NSN大鼠应用诱生型NO合成酶(iNOS)抑制剂L-NIL处理。 结果:在NSN大鼠,肾小球合成的上述AA产物中除LTC4外均升高,应用L-NIL可抑制其中PGE2、6-酮-PGF、LTB4、5-HETE、15-HETE的升高。 结论:iNOS衍生的NO激活肾小球的环氧化酶、5-脂氧化酶及15-脂氧化酶,促进部分AA产物合成,从而参与肾小球肾炎的发病,证实NO为肾小球AA产物合成的调节因子。
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    THE EFFECTS OF NITRIC OXIDE ON GLOMERULAR SYNTHESIS OF EICOSANOIDS IN NEPHROTOXIC SERUM NEPHRITIS IN RATS

    Wu Shenghua,Zhang Shuying,Lin Zhihua,Elias A.Lianos

    Department of Pediatrics,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing,210029

    OBJECTIVE To investigate the effect of nitric oxide(NO)on glomerular synthesis of eicosanoids in accelerated nephrotoxic serum nephritis(NSN)in rats.
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    METHODOLOGY Glomerular synthesis of prostaglandin(PG)E2,6-keto-PGF12,thromboxane(TX)B2,leukotries(LT)B4,LTC4,5-hydroxyeicosatetraenoic acid(5-HETE),12-HETE,15-HETE were determined with high pressure liquid chromatography and radioimmunoassay.Rats of NSN were treated with L-NIL,an inhibitor of inducible nitric oxide synthase(iNOS).

    RESULTS Glomerular synthesis of PGE2,6-keto-PGF12,TXB2,LTB4,5-HETE and 15-HETE1 were enhanced in rats of NSN except LTC4.The enhanced glomerular synthesis of the eicosanoids were inhibited by the treatment with L-NIL.
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    CONCLUSION iNOS derived NO stimulates glomerular activity of cyclooxygenase,5-and 15-lipoxygenases,promotes the syntheses of PEG2,PGI2,LTB4,5-HETE and 15 HETE that might be involved in the pathogenesis of NSN.

    Key words nitric oxide eicosanoid nephritis

    一氧化氮(NO)作为第二信使广泛参与机体生理功能的调节,参与肾脏疾病的发生与发展。目前,在肾小球疾病中,尚不清楚NO对肾小球花生四烯酸(AA)产物是否具有调节作用。本文利用大鼠的加速性肾毒性肾炎(NSN)模型,研究NO对AA产物的影响。

    1 材料和方法
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    1.1 制备NSN模型 对象为SD雄性大鼠,体重150~200g。给大鼠腹腔注射兔IgG1mg与Freund完全佐剂1∶1的混合乳剂,5天后静注兔抗鼠肾小球基底膜(GBM)抗体1.5ml/kg(EA Lianos Lab),对照组静注等剂量兔血清。静注后收集24h尿,然后处死,处死前进行右股动脉插管并联接于数字血压计,以测定平均动脉压(MAP)。

    1.2 肾组织检查 取小部分肾皮质作免疫荧光检查以明确抗GBM抗体在肾小球的沉积[1]。应用异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠ED1单克隆抗体(Accurate Co,U.S.A)进行肾皮质的免疫荧光染色,阳性细胞为浸润于肾小球的巨噬细胞,每只鼠计数25~30个肾小球。

    1.3 尿液检查 以Lowry法测定尿蛋白,苦味酸法测定尿肌酐。尿NO-2测定应用Griess[2],在0.1ml尿液中加入0.1ml Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺,0.1%萘乙二胺溶于5%磷酸中),室温中放置10min后在酶标仪上以550nm波长测定吸光度,以亚硝酸盐为标准制作标准曲线。
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    1.4 肾小球合成的AA产物测定[3] 用系列过筛法分离大鼠的肾小球,混悬于2ml的RPMI-1640培养液中,在37℃中孵育30min,加入磷脂酶A2活化剂A23187,再孵育45min后加入甲酸及乙醇,在4℃下抽提18h,用Lowry法测定肾小球沉淀物的蛋白量,将抽提物在真空下干燥,加入甲醇合剂后注入梯度高效液相层析仪(Beckman 112型),用可变波长吸附检验器(Spectroflow 773型)检出及分离各种AA产物,用放免法测定PGE2、6-酮-PGF、TXB2、LTB4、LTC4、5-HETE、12-HETE、15-HETE[3]。结果表示为ng或pg/mg肾小球蛋白。

    1.5 选择性抑制iNOS 应用L-N6(1-亚氨乙基)-赖氨酸,简称L-NIL,抑制iNOS的IC50为3.3μmol(Calbiochem,San Diego,U.S.A)[4]。在大鼠静注抗GBM抗体之前30min及之后8h分别静注L-NIL(15mg/kg.次)一次,以抑制肾小球iNOS活性[4]
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    1.6 实验分组 20只大鼠随机分为正常对照组(6只)、NSN组(8只)、应用L-NIL的NSN组即NSN+L-NIL组(8只)。

    1.7 统计方法 结果以均数±标准差表示。应用单因素方差分析及非配对t检验。

    2 结 果

    如附表所示,NSN发病后24h内尿蛋白及尿NO-2增加,肾小球巨噬细胞即ED1(+)细胞增多,MAP无变化,尿肌酐无变化。对NSN大鼠应用L-NIL,使尿NO-2减少,尿肌酐减少,MAP升高,不影响肾小球巨噬细胞的浸润。在NSN发病1天时,肾小球合成的前列腺素(PG)E2、6-酮-PGF、血栓素(TX)B2、5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)、白三烯(LT)B4、15-HETE、12-HETE均升高,而LTC4无明显升高。应用L-NIL后抑制了PGE2、6-酮-PGF、5-HETE、LTB4、15-HETE的升高,不能抑制TXB2、12-HETE的升高。
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    附表 各组大鼠尿液检查结果、肾小球巨噬细胞及AA产物合成的比较

    正常对照组

    NSN组

    NSN+L-NIL组

    例数

    6

    8

    8

    尿蛋白(mg/24h)

    15.8±2.5

    114.4±9.4*

    102.4±12.2*
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    尿肌酐(mmol/24h)

    0.57±0.18

    0.46±0.26

    0.23±0.10*△

    尿NO-2(μmol/24h)

    0.21±0.10

    8.22±2.45*

    3.26±1.58*△

    MAP(kPa)

    16.7±0.4
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    16.8±0.6

    18.2±0.8*△

    ED1(+)细胞/肾小球

    3.2±1.1

    25.1±2.6*

    23.0±1.8*

    PGE2(ng/mg肾小球蛋白)

    7.8±1.2

    12.8±0.9*

    9.9±1.1
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    6-酮-PGF(ng/mg肾小球蛋白)

    5.4±1.1

    10.0±1.2*

    6.9±0.9

    TXB2(ng/mg肾小球蛋白)

    4.1±0.9

    25.0±2.9*

    21.9±3.8*

    5-HETE(ng/mg肾小球蛋白)

    1.4±0.4
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    2.7±0.7*

    1.5±0.1

    LTB4(ng/mg肾小球蛋白)

    0.6±0.1

    4.7±1.1*

    2.5±0.6*△

    LTC4(pg/mg肾小球蛋白)

    73.2±18.0

    104.1±20.4

    94.4±16.4
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    15-HETE(ng/mg肾小球蛋白)

    0.3±0.1

    2.1±0.7*

    1.1±0.1*△

    12-HETE(ng/mg肾小球蛋白)

    13.7±6.2

    123.1±37.5*

    96.8±12.8*

    *:P<0.05与正常对照组比较,:P<0.05与NSN组比较。3 讨 论
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    我们曾证实,在NSN发病后24h内,肾小球合成的AA产物增多,如PGE2、TXB2、LTB4、5-HETE、12-HETE及15-HETE[1,3,5,6]。在肾脏疾病中,PGE2及PGI2可扩张肾血管及抗凝,而TXA2作用与之相反,LTB4及12-HETE可趋化白细胞,TXA2、LTC4及12-HETE可收缩肾小球系膜细胞及血管,导致肾功能减退,TXA2、LTC4、12-HETE及15-HETE均有促进肾小球细胞增殖的作用,15-HETE有抑制LTB4,减少白细胞浸润的作用[1,3,5~7]。在NSN中,肾小球合成的PG、TX、LT、5-HETE及15-HETE可来源于在肾小球浸润的白细胞[3,6],有许多因素可促进这些AA产物合成增多,尚不清楚NO是否调节肾小球AA产物的合成。在加速性肾毒性肾炎发病后24h,肾小球iNOS表达及NO合成达到高峰,其来源主要为巨噬细胞[2,8]。肾小球合成的AA产物与NO同时升高,提示二者有相互促进作用。在本文中,选择性抑制iNOS可减少肾炎大鼠尿NO-2的排泄,同时抑制了肾小球合成的PGE2、6-酮-PGF、LTB4、5-HETE、15-HETE,说明NO有促进这些AA产物合成的作用。
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    NO促进AA产物合成的机制尚不清楚。NO与含铁的酶或蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白有高度亲和力而发生相互作用。NO与鸟苷酸环化酶的血红素铁结合使其活化,而促进合成环磷酸鸟苷;NO可与呼吸链的铁硫中心结合而产生细胞毒性。AA的环氧化酶(COX)具有血红素铁中心而发挥氢过氧化物酶的作用,AA的脂氧化酶具有非血红素铁,因此均可能与NO反应。Tetsuka[9]发现,在大鼠系膜细胞,NO通过激活诱生型COX(COX-2)而使PGE2合成增多。Salvemini[10]证实在肾盂积水模型中,iNOS衍生的NO可活化COX-2,使PGE2合成增加。本文在肾小球免疫炎症的模型中,证实抑制iNOS可减少肾小球合成的PGE2,与Salvemini发现相一致。此外,本文应用L-NIL可减少肾炎鼠的6-酮-PGF的合成,说明NO也可通过激活COX-2促进PGI2的合成。至于L-NIL不抑制TXB2合成的原因,可能是除COX外,TXA2的生成还需血栓素合成酶的作用,NO可能不影响该酶的活性,所以对TXA2合成影响不大。本研究中抑制iNOS可减少肾炎鼠合成5-HETE、LTB4及15-HETE,但不影响12-HETE的合成,提示NO可激活5-脂氧化酶及15-脂氧化酶,不激活12-脂氧化酶。
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    在肾小球肾炎的早期应用NOS抑制剂,可限制NO的细胞毒性,减少炎症进展,但同时可使肾血流量下降,促进肾功能恶化。也使NO防止胞外基质合成的作用减弱,促进肾小球硬化的发展[11,12]。如前所述,有多种AA产物可影响肾小球血液动力学及细胞增殖,因此,在本文中抑制NO合成,进而减少肾小球AA产物的合成,这对肾小球的血液动力学、细胞增殖等的综合效应将是复杂的,取决于各种因子作用的平衡。本研究中在抑制NO合成后,使肾炎大鼠的尿肌酐排出减少,MAP升高,提示NO的减少可促进肾小球血管收缩,肾小球滤过减少,通过某种机制使血压升高,同时,应用L-NIL后尿蛋白无变化,这些与Bremer[13]的报道相类似。NO有抑制巨噬细胞浸润及粘附的作用[11],而LTB4可促进白细胞浸润于肾小球,本文中抑制NO合成,理论上肾小球巨噬细胞浸润应增多,但同时也抑制了肾小球LTB4的合成,LTB4促进巨噬细胞浸润的作用减少,这一效应与NO减少的作用相抵,从而使肾小球巨噬细胞无变化。Bremer也报道,单纯抑制iNOS不改变NSN大鼠肾小球的巨噬细胞浸润。肾小球AA产物主要来源于肾小球浸润的白细胞,本文中应用L-NIL后肾炎鼠肾小球巨噬细胞无变化,说明肾小球AA产物的减少并非是由于肾小球浸润的白细胞减少所致,而是这些产物合成的减少。
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    江苏省自然科学基金资助课题(编号:94048)

    参考文献

    1 Wu SH,Bresnahan BA,Lianos EA.Hemodynamic role of arachidonate 12- and 5-lipoxygenases in nephrotoxic serum nephritis.Kidney Int,1993,43:1280

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    3 吴升华,Hucke B.花生四烯酸氧化产物对肾毒性肾炎血液动力学的影响.中国病理生理杂志,1995,11:66
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    4 Moore WM,Webber RK,Jerome GM et al.L-N6-(1-Iminoethy1)lysine:a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase.J Med Chem,1994,37:3886

    5 Wu SH,Lianos EA.Modulatory effect of arachidonate 5-lipoxygenation on glomerular cell proliferation in nephrotoxic serum nephritis.J Lab Clin Med,1993,122:703

    6 吴升华.花生四烯酸非环氧合酶产物与肾脏疾病.国外医学泌尿系统分册,1994,14:208

    7 吴升华,林致华,练棣华等.系膜增殖性肾炎中花生四烯酸产物对系膜细胞增殖的作用.中国病理生理杂志,1995,11:263
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    8 Cook HT,Ebrahim H,Jansen AS et al.Expression of the gene for inducible nitric oxide synthase in experimental glomerulonephritis in the rat.Clin Exp Immunol,1994,97:315

    9 Tetsuka T,Daphnalken D,Miller BW et al.Nitric oxide amplifies interleukin 1-induced cyclooxygenase-2 expression in rat mesangial cells.J Clin Invest,1996,97:2051

    10 Salvemini D,Seibert K,Masferrer JL et al.Endogenous nitric oxide enhances prostaglandin production in a model of renal inflammation.J Clin Invest,1994,93:1940
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    11 唐锦辉.一氧化氮与肾脏疾病研究进展.国外医学泌尿系统分册,1996,16:216

    12 王东红.一氧化氮与肾小球硬化.国外医学泌尿系统分册,1998,18:6

    13 Bremer V,Tojo A,Kimura K et al.Role of nitric oxide in rat nephrotoxic nephritis:comparison between inducible and constitutive nitric oxide synthase.J Am Soc Nephrol,1997,8:1712

    (1999-12-09收稿,1999-03-15修回), 百拇医药