细胞凋亡过程中核碎裂形成的方式及其意义
作者：邓丽英 张云汉 许平 张红新
单位：邓丽英(山西长治医学院病理教研室，长治 046000)；张云汉 许平 张红新(河南医科大学病理学教研室、河南省肿瘤病理学重点实验室，郑州 450052)
关键词：食管肿瘤；凋亡；抗肿瘤药；核碎裂
临床与实验病理学杂志990316摘要 目的：观察抗癌药物诱导的肿瘤细胞凋亡中核碎裂的形式并探讨其意义。方法：用光镜和电镜观察人食管癌Eca-109细胞经顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理后的形态学改变。结果：肿瘤细胞的死亡特征符合凋亡，这两种抗癌药物引起的细胞后期的改变(如核碎裂、细胞出芽、凋亡小体形成以及凋亡小体被吞噬)相同，然而细胞核的早期改变有所不同。DDP处理后核染色质呈粗网状、出芽，而5-Fu处理后核染色质呈粗块状聚集于核膜下、核膜崩解。结论：细胞凋亡过程中核碎裂可通过多种途径发生，这对于机体可能具有重要的生理学意义。
, http://www.100md.com
分类号 R735.1 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0233-02
Forms of nuclear fragmentation and its meanings in apoptosis
Deng Liying
(Dept of Pathol, Changzhi Medical College, Changzhi 046000)
Zhang Yunhan Xu Ping
(Dept of Pathol, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
, http://www.100md.com
ABSTRACT Purpose To observe the forms of nuclear fragmentation in apoptosis induced by antitumor drugs and explore its meanings. Methods Morphological changes of human esophageal carcinoma Eca-109 cells after treated with cisplatin (DDP) and 5-fluorouracil (5-Fu) were observed by light and electron microscopes. Results The features of tumor cell death corresponded to apoptosis. The late changes induced by the two antitumor drugs, such as nuclear fragmentation, budding, the formation of apoptotic bodies and further being phagocytosed, were same, however the early nuclear changes were different. After tumor cells were treated with DDP, the chromatin became rough netlike, budding, while after treated with 5-Fu, chromatin collected under the nuclear membrane in rough cakes and then the nuclear membrane ruptured. Conclusion Apoptotic nuclear fragmentation may occured through multiple pathways. It may have important physiological meanings.
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KEY WORDS esophageal neoplasms; apoptosis; antineoplastic agents; nuclear fragmentation
细胞凋亡是一种常见的细胞死亡形式，对于维持机体的自身稳定具有重要意义。细胞凋亡时其核心变化是DNA发生进行性降解，它与细胞坏死时DNA的随机降解截然不同，而是发生于某些特殊部位，因此形成300 kbp和50 kbp的大分子〔1〕或200 bp及其倍数的小分子〔2〕。与此同时或以后则出现肌动蛋白依赖性细胞出芽(budding)、出芽泡渐与细胞体分离及凋亡小体形成〔3〕。凋亡细胞在后期较易识别，但是由于细胞凋亡过程较迅速，其中间步骤不易观察到，尤其是在体内的细胞及体外培养的悬浮型生长细胞。因此本实验用光镜、电镜方法观察和分析了顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的人食管癌Eca-109细胞(贴壁型生长)凋亡过程中的形态学变化，尤其是细胞核的改变，以探讨细胞凋亡时核碎裂的方式及其意义。
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1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞培养 人食管癌Eca-109细胞用RPMI1640培养液(补充以10%新生牛血清、1×105 U。L-1青霉素、100 mg。L-1链霉素)将细胞置于37℃、含5%CO2、充分饱和湿度的培养箱(美国Forma Scientific公司产品)内进行培养，部分为细胞爬片培养。
1.2 药物处理细胞 于接种培养Eca-109细胞24 h后加入DDP(10 mg。L-1)、5-Fu(100 mg。
L-1)分别作用12、24、48及24、48、72 h，获取细胞，以未用药物处理细胞作为对照。
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1.3 光镜、电镜分析 将药物处理后的一部分细胞制成涂片，涂片与细胞爬片经HE染色后置光镜下观察。获取的部分细胞经2.5%戊二醛固定30 min、1%锇酸后固定1 h、梯度乙醇脱水、包埋、制成超薄切片，在透射电镜(日立H600A型)下观察。
2 结果
2.1 肿瘤细胞发生凋亡 从细胞爬片可以看出，对照细胞贴壁较紧，充分生长且连接成片，细胞核较规则，核仁明显，电镜下可见肿瘤细胞表面的微绒毛分布均匀，核染色质细小、分布均匀。DDP处理12 h时即可见到少数肿瘤细胞皱缩变形，与相邻细胞分离，24 h时明显，凋亡细胞分散存在，细胞外形不规则，胞浆着色加深，细胞核固缩或碎裂，凋亡小体大小不等，有的已被邻近的肿瘤细胞吞噬(图1)；涂片上可见凋亡的肿瘤细胞核碎裂，核碎片连同部分胞浆突向细胞表面，使细胞呈出芽状。5-Fu处理肿瘤细胞24 h的标本中几乎见不到凋亡细胞，处理48 h时细胞凋亡才较明显，细胞回缩、变圆，少数为不规则形，细胞核染色质呈粗块状聚集于核膜下，核碎裂，细胞出芽、凋亡小体形成(图2)。DDP与5-Fu作用后可见到明显的肿瘤细胞吞噬现象，电镜下可见肿瘤细胞微绒毛稀少，当凋亡小体形成时微绒毛消失。
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图1 可见多个大小不等的凋亡小体，有的小体内含有核碎片，凋亡小体被相邻的肿瘤细胞包绕，吞噬现象明显(DDP处理后的肿瘤细胞爬片)。HE×400
图2 调亡细胞呈出芽状,核碎裂(5-Fu处理后的透射电镜照片)。×600
2.2 细胞核的改变 DDP作用后肿瘤细胞较为早期的变化是核染色质由均匀分布的细尘状变为粗而不规则的线网状，核仁消失，电镜下可见核染色质呈出芽状向胞浆内突出(图3)，此时细胞外形尚无明显改变；较为后期的改变是核碎裂，核碎片大小不等散于胞浆内，有的凋亡细胞呈出芽状，核碎片由胞浆包绕呈半圆形或圆形突向细胞表面(图4)。5-Fu作用后较为早期的变化是核染色质浓集于核膜下方(图5)，核仁消失，核中心深红染，染色质凝聚成多个粗块状，粗块之间的核膜变薄、核膜消失，发生核碎裂(图6)。
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图3细胞凋亡早期核染色质呈出芽状突向胞浆，使核外形术不规则(DDP处理后的透射电镜照片)。×15000
图4多个凋亡细胞呈出芽状，伴凋亡小体形成，有的小体内含有核碎片(DDP处理后的肿瘤细胞涂片)。HE×400
图5 肿瘤细胞凋亡早期核染色质呈粗块状聚集于核膜下方(5-Fu处理后的电镜照片)。×10 000
图6肿瘤细胞核碎裂，核碎片在细胞核原有的轮子廓之内(5-Fu处理后的肿瘤细胞涂片)。HE×400
3 讨论
, 百拇医药
食管癌Eca-109细胞在DDP与5-Fu作用后均可以细胞凋亡形式死亡。DDP与5-Fu的抗癌机制不同，DDP是通过插入DNA链间干扰DNA的转录和复制，5-Fu则是一种抗代谢药，干扰DNA的生物合成，但最终均能激活细胞凋亡程序。目前许多研究认为抗癌药并非直接引起肿瘤细胞凋亡，而是要通过细胞产生的某些信号，其中有多种基因参与凋亡的调控〔4，5〕。细胞核变化在凋亡时表现最为突出，但是从细胞核一系列变化尤其是在出现典型凋亡形态及凋亡小体形成之前的变化中可以看出，DDP与5-Fu作用后肿瘤细胞核的变化是有差别的。DDP作用后细胞凋亡及细胞核变化出现较早，核染色质变为粗网状，染色质出芽与胞浆出芽现象明显相一致，核碎片以凋亡小体的形式被迅速排出，而核染色质边集现象较少见。5-Fu作用后细胞凋亡及核改变出现较晚，核染色质边集且逐渐聚成块状较明显，核中心红染，核碎片在细胞核原有的轮廓之内，这可能与核膜在此之前发生崩解有关。由此可见这两种不同抗癌药作用于肿瘤细胞后诱导凋亡的过程尤其是早期不完全一致，核碎裂发生的方式也不一致，但最终的结局是一致的，即凋亡小体形成并被相邻的肿瘤细胞吞噬。本研究中只观察了两种凋亡诱导因子引起的变化，Dini等〔6〕采用多种凋亡诱导因子后发现核碎裂的方式至少有4种。核碎裂是细胞凋亡过程中的晚期表现，核碎裂可通过多途径发生表明了一种生物进化的会聚，这对于机体可能有重要的生理学意义〔6〕。本实验中观察到凋亡小体被相邻的肿瘤细胞吞噬现象较为活跃，核碎裂为凋亡小体形成奠定了基础，凋亡小体形成使凋亡细胞迅速解体并便于被吞噬清除，这对于机体也具有重要的生理学和病理学意义。
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作者简介：邓丽英，女，37岁，硕士，讲师
张云汉，男，59岁，博士生导师，教授。研究方向：食管肿瘤病理
参考文献
1，Broun DG, Sun XM, Cohen GM. Dexamethasone induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J Biol Chem, 1993;269:3037
2，Arends MJ, Morris BG, Wyllie AH. Apoptosis: the role of the endonuclease. Am J Pathol, 1990;136:593
, 百拇医药
3，Cotter TG, Lennon SV, Glynn JM et al. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res, 1992;52:997
4，Vaux D, Cory S, Adams J. Bcl-2 gene promotes haemopietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells. Nature, 1988;335:440
5，Kondo S, Barna BP, Morimura T et al. Interleukin-1 β-converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells. Cancer Res, 1995;55:6166
6，Dini L, Coppola S, Ruzittu MT et al. Multiple pathways for apoptosis nuclear fragmentation. Exp Cell Res, 1996;223:340
收稿日期：1998-10-16, 百拇医药
单位：邓丽英(山西长治医学院病理教研室，长治 046000)；张云汉 许平 张红新(河南医科大学病理学教研室、河南省肿瘤病理学重点实验室，郑州 450052)
关键词：食管肿瘤；凋亡；抗肿瘤药；核碎裂
临床与实验病理学杂志990316摘要 目的：观察抗癌药物诱导的肿瘤细胞凋亡中核碎裂的形式并探讨其意义。方法：用光镜和电镜观察人食管癌Eca-109细胞经顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理后的形态学改变。结果：肿瘤细胞的死亡特征符合凋亡，这两种抗癌药物引起的细胞后期的改变(如核碎裂、细胞出芽、凋亡小体形成以及凋亡小体被吞噬)相同，然而细胞核的早期改变有所不同。DDP处理后核染色质呈粗网状、出芽，而5-Fu处理后核染色质呈粗块状聚集于核膜下、核膜崩解。结论：细胞凋亡过程中核碎裂可通过多种途径发生，这对于机体可能具有重要的生理学意义。
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分类号 R735.1 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0233-02
Forms of nuclear fragmentation and its meanings in apoptosis
Deng Liying
(Dept of Pathol, Changzhi Medical College, Changzhi 046000)
Zhang Yunhan Xu Ping
(Dept of Pathol, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
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ABSTRACT Purpose To observe the forms of nuclear fragmentation in apoptosis induced by antitumor drugs and explore its meanings. Methods Morphological changes of human esophageal carcinoma Eca-109 cells after treated with cisplatin (DDP) and 5-fluorouracil (5-Fu) were observed by light and electron microscopes. Results The features of tumor cell death corresponded to apoptosis. The late changes induced by the two antitumor drugs, such as nuclear fragmentation, budding, the formation of apoptotic bodies and further being phagocytosed, were same, however the early nuclear changes were different. After tumor cells were treated with DDP, the chromatin became rough netlike, budding, while after treated with 5-Fu, chromatin collected under the nuclear membrane in rough cakes and then the nuclear membrane ruptured. Conclusion Apoptotic nuclear fragmentation may occured through multiple pathways. It may have important physiological meanings.
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KEY WORDS esophageal neoplasms; apoptosis; antineoplastic agents; nuclear fragmentation
细胞凋亡是一种常见的细胞死亡形式，对于维持机体的自身稳定具有重要意义。细胞凋亡时其核心变化是DNA发生进行性降解，它与细胞坏死时DNA的随机降解截然不同，而是发生于某些特殊部位，因此形成300 kbp和50 kbp的大分子〔1〕或200 bp及其倍数的小分子〔2〕。与此同时或以后则出现肌动蛋白依赖性细胞出芽(budding)、出芽泡渐与细胞体分离及凋亡小体形成〔3〕。凋亡细胞在后期较易识别，但是由于细胞凋亡过程较迅速，其中间步骤不易观察到，尤其是在体内的细胞及体外培养的悬浮型生长细胞。因此本实验用光镜、电镜方法观察和分析了顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的人食管癌Eca-109细胞(贴壁型生长)凋亡过程中的形态学变化，尤其是细胞核的改变，以探讨细胞凋亡时核碎裂的方式及其意义。
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1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞培养 人食管癌Eca-109细胞用RPMI1640培养液(补充以10%新生牛血清、1×105 U。L-1青霉素、100 mg。L-1链霉素)将细胞置于37℃、含5%CO2、充分饱和湿度的培养箱(美国Forma Scientific公司产品)内进行培养，部分为细胞爬片培养。
1.2 药物处理细胞 于接种培养Eca-109细胞24 h后加入DDP(10 mg。L-1)、5-Fu(100 mg。
L-1)分别作用12、24、48及24、48、72 h，获取细胞，以未用药物处理细胞作为对照。
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1.3 光镜、电镜分析 将药物处理后的一部分细胞制成涂片，涂片与细胞爬片经HE染色后置光镜下观察。获取的部分细胞经2.5%戊二醛固定30 min、1%锇酸后固定1 h、梯度乙醇脱水、包埋、制成超薄切片，在透射电镜(日立H600A型)下观察。
2 结果
2.1 肿瘤细胞发生凋亡 从细胞爬片可以看出，对照细胞贴壁较紧，充分生长且连接成片，细胞核较规则，核仁明显，电镜下可见肿瘤细胞表面的微绒毛分布均匀，核染色质细小、分布均匀。DDP处理12 h时即可见到少数肿瘤细胞皱缩变形，与相邻细胞分离，24 h时明显，凋亡细胞分散存在，细胞外形不规则，胞浆着色加深，细胞核固缩或碎裂，凋亡小体大小不等，有的已被邻近的肿瘤细胞吞噬(图1)；涂片上可见凋亡的肿瘤细胞核碎裂，核碎片连同部分胞浆突向细胞表面，使细胞呈出芽状。5-Fu处理肿瘤细胞24 h的标本中几乎见不到凋亡细胞，处理48 h时细胞凋亡才较明显，细胞回缩、变圆，少数为不规则形，细胞核染色质呈粗块状聚集于核膜下，核碎裂，细胞出芽、凋亡小体形成(图2)。DDP与5-Fu作用后可见到明显的肿瘤细胞吞噬现象，电镜下可见肿瘤细胞微绒毛稀少，当凋亡小体形成时微绒毛消失。
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图1 可见多个大小不等的凋亡小体，有的小体内含有核碎片，凋亡小体被相邻的肿瘤细胞包绕，吞噬现象明显(DDP处理后的肿瘤细胞爬片)。HE×400
图2 调亡细胞呈出芽状,核碎裂(5-Fu处理后的透射电镜照片)。×600
2.2 细胞核的改变 DDP作用后肿瘤细胞较为早期的变化是核染色质由均匀分布的细尘状变为粗而不规则的线网状，核仁消失，电镜下可见核染色质呈出芽状向胞浆内突出(图3)，此时细胞外形尚无明显改变；较为后期的改变是核碎裂，核碎片大小不等散于胞浆内，有的凋亡细胞呈出芽状，核碎片由胞浆包绕呈半圆形或圆形突向细胞表面(图4)。5-Fu作用后较为早期的变化是核染色质浓集于核膜下方(图5)，核仁消失，核中心深红染，染色质凝聚成多个粗块状，粗块之间的核膜变薄、核膜消失，发生核碎裂(图6)。
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图3细胞凋亡早期核染色质呈出芽状突向胞浆，使核外形术不规则(DDP处理后的透射电镜照片)。×15000
图4多个凋亡细胞呈出芽状，伴凋亡小体形成，有的小体内含有核碎片(DDP处理后的肿瘤细胞涂片)。HE×400
图5 肿瘤细胞凋亡早期核染色质呈粗块状聚集于核膜下方(5-Fu处理后的电镜照片)。×10 000
图6肿瘤细胞核碎裂，核碎片在细胞核原有的轮子廓之内(5-Fu处理后的肿瘤细胞涂片)。HE×400
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食管癌Eca-109细胞在DDP与5-Fu作用后均可以细胞凋亡形式死亡。DDP与5-Fu的抗癌机制不同，DDP是通过插入DNA链间干扰DNA的转录和复制，5-Fu则是一种抗代谢药，干扰DNA的生物合成，但最终均能激活细胞凋亡程序。目前许多研究认为抗癌药并非直接引起肿瘤细胞凋亡，而是要通过细胞产生的某些信号，其中有多种基因参与凋亡的调控〔4，5〕。细胞核变化在凋亡时表现最为突出，但是从细胞核一系列变化尤其是在出现典型凋亡形态及凋亡小体形成之前的变化中可以看出，DDP与5-Fu作用后肿瘤细胞核的变化是有差别的。DDP作用后细胞凋亡及细胞核变化出现较早，核染色质变为粗网状，染色质出芽与胞浆出芽现象明显相一致，核碎片以凋亡小体的形式被迅速排出，而核染色质边集现象较少见。5-Fu作用后细胞凋亡及核改变出现较晚，核染色质边集且逐渐聚成块状较明显，核中心红染，核碎片在细胞核原有的轮廓之内，这可能与核膜在此之前发生崩解有关。由此可见这两种不同抗癌药作用于肿瘤细胞后诱导凋亡的过程尤其是早期不完全一致，核碎裂发生的方式也不一致，但最终的结局是一致的，即凋亡小体形成并被相邻的肿瘤细胞吞噬。本研究中只观察了两种凋亡诱导因子引起的变化，Dini等〔6〕采用多种凋亡诱导因子后发现核碎裂的方式至少有4种。核碎裂是细胞凋亡过程中的晚期表现，核碎裂可通过多途径发生表明了一种生物进化的会聚，这对于机体可能有重要的生理学意义〔6〕。本实验中观察到凋亡小体被相邻的肿瘤细胞吞噬现象较为活跃，核碎裂为凋亡小体形成奠定了基础，凋亡小体形成使凋亡细胞迅速解体并便于被吞噬清除，这对于机体也具有重要的生理学和病理学意义。
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作者简介：邓丽英，女，37岁，硕士，讲师
张云汉，男，59岁，博士生导师，教授。研究方向：食管肿瘤病理
参考文献
1，Broun DG, Sun XM, Cohen GM. Dexamethasone induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J Biol Chem, 1993;269:3037
2，Arends MJ, Morris BG, Wyllie AH. Apoptosis: the role of the endonuclease. Am J Pathol, 1990;136:593
, 百拇医药
3，Cotter TG, Lennon SV, Glynn JM et al. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res, 1992;52:997
4，Vaux D, Cory S, Adams J. Bcl-2 gene promotes haemopietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells. Nature, 1988;335:440
5，Kondo S, Barna BP, Morimura T et al. Interleukin-1 β-converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells. Cancer Res, 1995;55:6166
6，Dini L, Coppola S, Ruzittu MT et al. Multiple pathways for apoptosis nuclear fragmentation. Exp Cell Res, 1996;223:340
收稿日期：1998-10-16, 百拇医药