一种简易的肺泡Ⅱ型上皮细胞染色方法
作者：蒋海鹰 曾庆富
单位：蒋海鹰 曾庆富(湖南医科大学病理学教研室，长沙 410078)
关键词：染色法；肺泡；巨噬细胞；肺泡；上皮细胞；大鼠
临床与实验病理学杂志990339分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0276-01
肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称Ⅱ型细胞)能合成分泌肺表面活性物质、生长因子，参与肺损伤修复，与多种生理及病理情况下肺的呼吸功能和非呼吸功能密切相关，近年来对Ⅱ型细胞的研究颇为活跃。分离Ⅱ型细胞进行体外实验，其细胞鉴定至关重要。现介绍一种简便的Ⅱ型细胞鉴定方法——碱性磷酸酶(AKP)染色一步法。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 分离的大鼠肺细胞 用胰蛋白酶和DNase Ⅰ肺内灌注消化20 min，制备单细胞悬液，离心后获沉淀细胞涂片。
1.1.2 大鼠肺泡灌洗细胞 用平衡盐溶液经气管插管灌洗肺泡腔，收集灌洗液，离心后细胞涂片。
1.1.3 大鼠肾组织 大鼠处死后立即取出肾脏，纯胶水包埋，冷冻切片。
1.2 试剂 BCIP/NBT试剂盒为Maxim Biotech公司产品；丹宁酸为Sigma公司产品。
1.3 染色步骤 细胞涂片或冷冻切片风干15～30 min；按BCIP/NBT试剂盒提供的方法新配制孵育液(加A、B、C液各1滴于1 ml蒸馏水中即可)，滴加于细胞涂片或组织切片上，37℃孵育15 min，蒸馏水洗2次，核固红复染1 min；水洗后封片。
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1.4 对照染色
1.4.1 阳性对照 大鼠肾组织近曲小管。
1.4.2 阴性对照 大鼠肺泡灌洗细胞，主要为肺泡巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。
1.4.3 AKP灭活 大鼠肾组织冷冻切片和分离的肺细胞涂片，100℃ 3 min热处理。
2 结果
分离的肺细胞和肺泡灌洗液细胞经AKP染色后，Ⅱ型细胞胞浆内有深蓝色酶阳性反应产物，呈细颗粒状(图1)，肺泡巨噬细胞，淋巴细胞为阴性；中性粒细胞可有阳性反应，但其细胞体积小，核为分叶状，易与Ⅱ型细胞区别(图2)。大鼠肾脏冷冻切片AKP染色近曲小管上皮细胞呈强阳性。肾组织冷冻切片及分离肺细胞涂片经热处理后，AKP染色均为阴性。
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图1 Ⅱ型细胞内有深蓝色阳性反应物。AKP染色，未复染×200
图2 Ⅱ型细胞(Ⅱ)和中性粒细胞(N)阳性反应，巨噬细胞(M)淋巴细胞(L)为阴性。AKP染色，核固红复染×200
3 讨论
已有研究表明，AKP是Ⅱ型细胞分化的标记物，Ⅰ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞AKP染色均呈阴性反应〔1〕。AKP染色用于鉴定Ⅱ型细胞有较高的实用价值，可与电镜相媲美。
我们采用商品化AKP检测系统，肾近曲小管AKP染色呈强阳性，而肺泡巨噬细胞、淋巴细胞为阴性；高热处理后的肾组织切片AKP染色转为阴性，故AKP染色适用于Ⅱ型细胞的鉴定。
丹宁酸染色和改良巴氏染色是另外两种应用较早、适用于光镜鉴定Ⅱ型细胞的方法〔2，3〕。我们在使用该两种方法鉴定分离的肺细胞中的Ⅱ型细胞时，发现经丹宁酸染色后的Ⅱ型细胞浆内有明确的黑色颗粒，但有时巨噬细胞也可有黑色颗粒存在，与Ⅱ型细胞不易区别〔2〕。而且丹宁酸染色的稳定性欠佳，染色时间较长，至少12 h左右后观察结果。改良巴氏染色的最大缺陷是Ⅱ型细胞内颗粒不明显，辨认困难。与梁成华等〔3〕报道的结果相同。我们用AKP染色一步法鉴定Ⅱ型细胞与经典的AKP染色钙 -钴法和偶联法以及与丹宁酸和巴氏染色法比较，可见其下列优点：(1)配制孵育液简便；(2)反应产物为深蓝色，非常鲜艳，经核固红衬染后，极易与其它细胞区别；(3)稳定性好，特异性较强，虽然中性粒细胞可呈阳性，但易与Ⅱ型细胞区别；(4)染色时间短，能迅速得到鉴定结果。作者认为该方法是鉴定Ⅱ型细胞的一种简便有效的、特异的快速方法，特别适用于体外分离的Ⅱ型细胞纯度鉴定。
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作者简介：蒋海鹰，女，32岁，主管技师
参考文献
1，Edesson JD, Shannon JM, Masson RJ. Alkaline phosphatase: A marker of alveolar type Ⅱ cell differentiation, Am Rev Respir Dis，1988；138：1268
2，Masson RJ, Walker SR, Shields BA et al. Identification of rat alveolar type Ⅱ epithelial cells with tannic acid and polychrome stain, Am Rev Respir Dis,1985;131:786
3，梁成华，刘静敏，张丽红等. Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离与简易标记研究. 中国医科大学学报，1991；20：19
收稿日期：1998-05-03, 百拇医药
单位：蒋海鹰 曾庆富(湖南医科大学病理学教研室，长沙 410078)
关键词：染色法；肺泡；巨噬细胞；肺泡；上皮细胞；大鼠
临床与实验病理学杂志990339分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0276-01
肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称Ⅱ型细胞)能合成分泌肺表面活性物质、生长因子，参与肺损伤修复，与多种生理及病理情况下肺的呼吸功能和非呼吸功能密切相关，近年来对Ⅱ型细胞的研究颇为活跃。分离Ⅱ型细胞进行体外实验，其细胞鉴定至关重要。现介绍一种简便的Ⅱ型细胞鉴定方法——碱性磷酸酶(AKP)染色一步法。
1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 分离的大鼠肺细胞 用胰蛋白酶和DNase Ⅰ肺内灌注消化20 min，制备单细胞悬液，离心后获沉淀细胞涂片。
1.1.2 大鼠肺泡灌洗细胞 用平衡盐溶液经气管插管灌洗肺泡腔，收集灌洗液，离心后细胞涂片。
1.1.3 大鼠肾组织 大鼠处死后立即取出肾脏，纯胶水包埋，冷冻切片。
1.2 试剂 BCIP/NBT试剂盒为Maxim Biotech公司产品；丹宁酸为Sigma公司产品。
1.3 染色步骤 细胞涂片或冷冻切片风干15～30 min；按BCIP/NBT试剂盒提供的方法新配制孵育液(加A、B、C液各1滴于1 ml蒸馏水中即可)，滴加于细胞涂片或组织切片上，37℃孵育15 min，蒸馏水洗2次，核固红复染1 min；水洗后封片。
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1.4 对照染色
1.4.1 阳性对照 大鼠肾组织近曲小管。
1.4.2 阴性对照 大鼠肺泡灌洗细胞，主要为肺泡巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。
1.4.3 AKP灭活 大鼠肾组织冷冻切片和分离的肺细胞涂片，100℃ 3 min热处理。
2 结果
分离的肺细胞和肺泡灌洗液细胞经AKP染色后，Ⅱ型细胞胞浆内有深蓝色酶阳性反应产物，呈细颗粒状(图1)，肺泡巨噬细胞，淋巴细胞为阴性；中性粒细胞可有阳性反应，但其细胞体积小，核为分叶状，易与Ⅱ型细胞区别(图2)。大鼠肾脏冷冻切片AKP染色近曲小管上皮细胞呈强阳性。肾组织冷冻切片及分离肺细胞涂片经热处理后，AKP染色均为阴性。
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图1 Ⅱ型细胞内有深蓝色阳性反应物。AKP染色，未复染×200
图2 Ⅱ型细胞(Ⅱ)和中性粒细胞(N)阳性反应，巨噬细胞(M)淋巴细胞(L)为阴性。AKP染色，核固红复染×200
3 讨论
已有研究表明，AKP是Ⅱ型细胞分化的标记物，Ⅰ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞AKP染色均呈阴性反应〔1〕。AKP染色用于鉴定Ⅱ型细胞有较高的实用价值，可与电镜相媲美。
我们采用商品化AKP检测系统，肾近曲小管AKP染色呈强阳性，而肺泡巨噬细胞、淋巴细胞为阴性；高热处理后的肾组织切片AKP染色转为阴性，故AKP染色适用于Ⅱ型细胞的鉴定。
丹宁酸染色和改良巴氏染色是另外两种应用较早、适用于光镜鉴定Ⅱ型细胞的方法〔2，3〕。我们在使用该两种方法鉴定分离的肺细胞中的Ⅱ型细胞时，发现经丹宁酸染色后的Ⅱ型细胞浆内有明确的黑色颗粒，但有时巨噬细胞也可有黑色颗粒存在，与Ⅱ型细胞不易区别〔2〕。而且丹宁酸染色的稳定性欠佳，染色时间较长，至少12 h左右后观察结果。改良巴氏染色的最大缺陷是Ⅱ型细胞内颗粒不明显，辨认困难。与梁成华等〔3〕报道的结果相同。我们用AKP染色一步法鉴定Ⅱ型细胞与经典的AKP染色钙 -钴法和偶联法以及与丹宁酸和巴氏染色法比较，可见其下列优点：(1)配制孵育液简便；(2)反应产物为深蓝色，非常鲜艳，经核固红衬染后，极易与其它细胞区别；(3)稳定性好，特异性较强，虽然中性粒细胞可呈阳性，但易与Ⅱ型细胞区别；(4)染色时间短，能迅速得到鉴定结果。作者认为该方法是鉴定Ⅱ型细胞的一种简便有效的、特异的快速方法，特别适用于体外分离的Ⅱ型细胞纯度鉴定。
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作者简介：蒋海鹰，女，32岁，主管技师
参考文献
1，Edesson JD, Shannon JM, Masson RJ. Alkaline phosphatase: A marker of alveolar type Ⅱ cell differentiation, Am Rev Respir Dis，1988；138：1268
2，Masson RJ, Walker SR, Shields BA et al. Identification of rat alveolar type Ⅱ epithelial cells with tannic acid and polychrome stain, Am Rev Respir Dis,1985;131:786
3，梁成华，刘静敏，张丽红等. Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离与简易标记研究. 中国医科大学学报，1991；20：19
收稿日期：1998-05-03, 百拇医药