脑组织乙酰胆碱酯酶染色的体会
作者：魏艳华 杨枫
单位：魏艳华 杨枫(安徽医科大学病理学教研室，合肥 230023)
关键词：乙酰胆碱酯酶；脑；染色法
临床与实验病理学杂志990332分类号 R446.8；R361.2 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0266-02
酶是活细胞生成的具有催化作用的蛋白质，其反应是机体生理活动的基础。组织内的代谢过程需要酶的参与，其功能状态决定了组织代谢的正常或异常，酶的调节及其代谢对维持机体生理过程的平衡十分重要。
胆碱酯酶属神经系统中的羧基酯酶，可分为两大类，一类为乙酰胆碱酯酶(AChE)，又称真性胆碱酯酶，其功能是水解乙酰胆碱；另一类为胆碱酯酶，又称假性胆碱酯酶(PsChE)，其功能是水解胆碱的酯，而不是水解乙酰胆碱酯。在中枢神经和周围神经都有乙酰胆碱酯酶的存在，利用乙酰胆碱酯酶染色可检测该酶在疾病时的变化，对病理诊断及科研有一定帮助。目前常用的胆碱酶法〔1，2〕显示乙酰胆碱酯酶活性，常规不衬染细胞核以及用甘油明胶封片，不利于切片的观察，本实验通过核固红衬染细胞核以及用中性树胶封片，改善了切片的清晰度，而利于乙酰胆碱酯酶的观察。
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1 材料与方法
1.1 材料 大白鼠脑组织。经药物试验的大白鼠，杀死后取脑组织，立即作冷冻切片或立即放入冰箱冷冻。
1.2 方法 Snell-Garrett胆碱酶法：①0.1 mol。L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.3)。储备液：A液，冰醋酸(纯)0.6 ml，蒸馏水100 ml；B液，醋酸钠(无水)1.36克，蒸馏水100 ml；应用液：A液73 ml，B液27 ml两液混合。②2.5%硫酸铜液：硫酸铜2.5 g，蒸馏水100 ml。③3.7%甘氨酸液：甘氨酸3.7 g，蒸馏水100 ml。④底物溶液：碘化乙酰硫代胆碱15 mg，蒸馏水0.7 ml，2.5%硫酸铜液0.3 ml。
取洁净烘干的离心管1支，加入碘化乙酰硫代胆碱15 mg，蒸馏水0.7 ml，完全溶解后加入2.5%硫酸铜液0.3 ml，此时形成咖啡色碘化铜混浊，离心15 min后取其黄色上清(约0.8 ml)即为底物溶液。
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⑤孵育液：底物溶液0.8 ml，0.1 mol。L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.3) 5 ml，蒸馏水3.8 ml，3.7%甘氨酸液0.2 ml，2.5%硫酸铜液0.2 ml，按序混合。
⑥核固红液：核固红0.1 g，5%硫酸铝液100 ml，加热溶解，冷却后过滤。
1.3 染色步骤 ①冷冻切片5～7 μm，丙酮(4℃)固定20～30 min；②切片入预温的孵育液中，37℃恒温孵育2 h；③流水冲洗5 min，蒸馏水洗；④2%硫化铵1 min；⑤同③；⑥核固红衬染1～2 min(染细胞核)；⑦蒸馏水洗；⑧风干，二甲苯透明，中性树胶封片。
2 结果
乙酰胆碱酯酶活性部位呈黄棕色至深棕色(图1，2)。图1示衬染细胞核，图2示未衬染细胞核。
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图1 衬染细胞核(核固红)，酶的活性部位显标棕黄色。×200
图2 末衬梁细胞核，酶的活性部位显标棕黄色。×200
3 讨论
由于酶是一种有活性的蛋白质，所以其活性的保存较为困难，为能最大限度地保存酶活性及防止酶扩散，组织须立即冷冻切片(或冷冻)。酶的显示方法与其它组化技术不同，一般组化方法为试剂和组织成分反应，反应产物直接来自组织成分。而酶必须显示其活性，看不到酶本身，只看见对底物的作用，最终反应产物来自底物。在配制试剂和底物液时要准确，所用器皿要用蒸馏水洗净、烘干，以免降低酶活性。组织片切好后，放入预冷的丙酮(4℃)中固定30 min后染色，这样可以保存酶的最高活性(酯酶活性可保存68%)。不同种类的酶有其最适合的pH值，乙酰胆碱酯酶的最适pH值是4.3，在配制缓冲液时如稍有误差，可用A液和B液调整。大部分酶反应的最适温度为37℃，在孵育时可将切片放入立式染色缸内，在恒温箱内孵育2 h，以保证酶的活性和进行充分反应。
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一般认为酶活性被显示后，基本上不做细胞核衬染，以防止酶的活性处受干扰，本实验通过衬染细胞核，并不影响酶的显示，在底物液的作用下，酶的活性部位最终形成一种不溶性物质被显示出来，核固红只作用于细胞核，对已显示出来的酶无作用，由于衬染了细胞核，更利于切片的观察。另外，切片常规用甘油明胶封片不仅透明度不好，，而且镜下观察模糊不清，又容易退色，可将切片封干，二甲苯透明，中性树胶封片，这样切片透明清晰，利于酶活性处的观察。
作者简介：魏艳华，女，46岁，主管技师
参考文献
1，龚志锦，詹钅容洲.病理组织制片和染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994：10
2，凌启波.实用病理特殊染色和组化技术.广州：广东高等教育出版社，1989：7
收稿日期：1999-01-05, http://www.100md.com
单位：魏艳华 杨枫(安徽医科大学病理学教研室，合肥 230023)
关键词：乙酰胆碱酯酶；脑；染色法
临床与实验病理学杂志990332分类号 R446.8；R361.2 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0266-02
酶是活细胞生成的具有催化作用的蛋白质，其反应是机体生理活动的基础。组织内的代谢过程需要酶的参与，其功能状态决定了组织代谢的正常或异常，酶的调节及其代谢对维持机体生理过程的平衡十分重要。
胆碱酯酶属神经系统中的羧基酯酶，可分为两大类，一类为乙酰胆碱酯酶(AChE)，又称真性胆碱酯酶，其功能是水解乙酰胆碱；另一类为胆碱酯酶，又称假性胆碱酯酶(PsChE)，其功能是水解胆碱的酯，而不是水解乙酰胆碱酯。在中枢神经和周围神经都有乙酰胆碱酯酶的存在，利用乙酰胆碱酯酶染色可检测该酶在疾病时的变化，对病理诊断及科研有一定帮助。目前常用的胆碱酶法〔1，2〕显示乙酰胆碱酯酶活性，常规不衬染细胞核以及用甘油明胶封片，不利于切片的观察，本实验通过核固红衬染细胞核以及用中性树胶封片，改善了切片的清晰度，而利于乙酰胆碱酯酶的观察。
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1 材料与方法
1.1 材料 大白鼠脑组织。经药物试验的大白鼠，杀死后取脑组织，立即作冷冻切片或立即放入冰箱冷冻。
1.2 方法 Snell-Garrett胆碱酶法：①0.1 mol。L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.3)。储备液：A液，冰醋酸(纯)0.6 ml，蒸馏水100 ml；B液，醋酸钠(无水)1.36克，蒸馏水100 ml；应用液：A液73 ml，B液27 ml两液混合。②2.5%硫酸铜液：硫酸铜2.5 g，蒸馏水100 ml。③3.7%甘氨酸液：甘氨酸3.7 g，蒸馏水100 ml。④底物溶液：碘化乙酰硫代胆碱15 mg，蒸馏水0.7 ml，2.5%硫酸铜液0.3 ml。
取洁净烘干的离心管1支，加入碘化乙酰硫代胆碱15 mg，蒸馏水0.7 ml，完全溶解后加入2.5%硫酸铜液0.3 ml，此时形成咖啡色碘化铜混浊，离心15 min后取其黄色上清(约0.8 ml)即为底物溶液。
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⑤孵育液：底物溶液0.8 ml，0.1 mol。L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.3) 5 ml，蒸馏水3.8 ml，3.7%甘氨酸液0.2 ml，2.5%硫酸铜液0.2 ml，按序混合。
⑥核固红液：核固红0.1 g，5%硫酸铝液100 ml，加热溶解，冷却后过滤。
1.3 染色步骤 ①冷冻切片5～7 μm，丙酮(4℃)固定20～30 min；②切片入预温的孵育液中，37℃恒温孵育2 h；③流水冲洗5 min，蒸馏水洗；④2%硫化铵1 min；⑤同③；⑥核固红衬染1～2 min(染细胞核)；⑦蒸馏水洗；⑧风干，二甲苯透明，中性树胶封片。
2 结果
乙酰胆碱酯酶活性部位呈黄棕色至深棕色(图1，2)。图1示衬染细胞核，图2示未衬染细胞核。
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图1 衬染细胞核(核固红)，酶的活性部位显标棕黄色。×200
图2 末衬梁细胞核，酶的活性部位显标棕黄色。×200
3 讨论
由于酶是一种有活性的蛋白质，所以其活性的保存较为困难，为能最大限度地保存酶活性及防止酶扩散，组织须立即冷冻切片(或冷冻)。酶的显示方法与其它组化技术不同，一般组化方法为试剂和组织成分反应，反应产物直接来自组织成分。而酶必须显示其活性，看不到酶本身，只看见对底物的作用，最终反应产物来自底物。在配制试剂和底物液时要准确，所用器皿要用蒸馏水洗净、烘干，以免降低酶活性。组织片切好后，放入预冷的丙酮(4℃)中固定30 min后染色，这样可以保存酶的最高活性(酯酶活性可保存68%)。不同种类的酶有其最适合的pH值，乙酰胆碱酯酶的最适pH值是4.3，在配制缓冲液时如稍有误差，可用A液和B液调整。大部分酶反应的最适温度为37℃，在孵育时可将切片放入立式染色缸内，在恒温箱内孵育2 h，以保证酶的活性和进行充分反应。
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一般认为酶活性被显示后，基本上不做细胞核衬染，以防止酶的活性处受干扰，本实验通过衬染细胞核，并不影响酶的显示，在底物液的作用下，酶的活性部位最终形成一种不溶性物质被显示出来，核固红只作用于细胞核，对已显示出来的酶无作用，由于衬染了细胞核，更利于切片的观察。另外，切片常规用甘油明胶封片不仅透明度不好，，而且镜下观察模糊不清，又容易退色，可将切片封干，二甲苯透明，中性树胶封片，这样切片透明清晰，利于酶活性处的观察。
作者简介：魏艳华，女，46岁，主管技师
参考文献
1，龚志锦，詹钅容洲.病理组织制片和染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994：10
2，凌启波.实用病理特殊染色和组化技术.广州：广东高等教育出版社，1989：7
收稿日期：1999-01-05, http://www.100md.com