脊髓伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化及其意义*
作者：周初松 靳安民 张 辉 杨建成
单位：第一军医大学珠江医院骨科，广州，510282
关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；一氧化氮；大鼠
第一军医大学学报990313 摘要： 目的 探讨脊髓损伤后早期伤段脊髓组织一氧化氮合酶 (NOS)活性的动态变化规律。方法 通过伤段脊髓组织催化[3H]标记的精氨酸转化生成[3H]标记的瓜氨酸的量，测定脊髓压迫伤后0～60min伤段脊髓组织NOS的活性。结果 脊髓压迫伤后，NOS活性明显增加，伤后5min达最高点; 然后又迅速下降,于伤后1h恢复至正常水平。结论 在脊髓伤后1h内，伤段脊髓组织NOS活性迅速而短暂升高。
中图分类号: Q571; Q461
Dynamical changes of nitric oxide synthase activity in injured spinal cord tissue after spinal cord injury
, http://www.100md.com
Zhou Chusong, Jin Anmin, Zhang Hui, Yang Jiancheng
Department of Orthopaedics, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
Abstract: Objective In order to explore dynamical changes of nitric oxide synthase (NOS) activity in injured spinal cord tissue at early phase of spinal cord injury. Method NOS activity was determined by the rate of conversion of [3H]-arginine to [3H]-citrulline in injured spinal cord tissue 0 to 60 min after spinal cord compression. Results The activity of NOS was sharply increased after spinal cord compression injury and reached the highest level at 5 min,then decreased rapidly to normal level in one hour. Conclusion These results suggest that there is a sharp transient increase of NOS activity during the first hour of spinal cord compression.
, 百拇医药
Key words: spinal cord injury; nitric oxide synthase; nitric oxide; rat
一氧化氮(Nitric oxide, NO)是由一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)催化左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)而产生，在生物体内具有广泛而多样的生物学效应，在生理状态下能传递信使、调节血管张力；在病理状态下参与脑缺血损害，具有神经毒性作用[1]。然而它在脊髓损伤中的作用尚不清楚。由于NO半衰期极短，难以直接测定,加之它在体内不能贮存，所以本实验通过测定大鼠脊髓压迫伤后NOS活性的动态变化来间接反应NO的变化规律，以利于进一步探讨NO与脊髓继发性损伤的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康、封闭群SD大鼠42只,体质量 (280±30)g，随机分为假手术组及根据后路压迫伤后取材的时间分为0、5、10、20、30和60min组，每组6只。
, http://www.100md.com
1.2 试剂及器材 L-[2,3,4,5-3H]-arginine、Dowex AG50w-X8、NADPH、钙调蛋白均购自Sigma公司,其余试剂为国产AR级。Megafuge1.0R低温离心机为日本产品，Beckman LS5000 CE液体闪烁仪为美国产品，CPS-1A超声波粉碎机为上海超声波仪器厂产品。
1.3 方法
1.3.1 动物模型的制备 动物用1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,取后正中切口，切除T 8～10椎板，暴露脊髓，按Nystrom方法[2]后路压迫脊髓(35.0g/10min)。假手术组仅行脊髓暴露而不致伤。
1.3.2 脊髓标本的采集 按分组时间要求处死动物后,立即浸入冰水中，取伤段脊髓或相应部位脊髓置于冰冷的HEPES缓冲液中 (20mmol/L，pH7.4)，匀浆，超声粉碎。立即置于4℃低温离心机中离心 (15000r/min×30min)。
, 百拇医药
1.3.3 [3H]Citrulline检测 将上述25ml上清液加于含有2mmol/L NADPH、0.5mmol/L CaCl2、10 g/L钙调蛋白的50mmol/L HEPES缓冲液中，pH为7.4。然后加入25ml[3H]L-arginine (25m ci/25 m l),置于24℃恒温水浴箱中30min。立即加入含有2mmol/LEDTA 的20mmol/L HEPES反应停止液中，过Dowex AG层析柱，于Beckman液闪仪中测定[3H]-citrulline的放射活性。
1.3.4 蛋白含量的测定 采用改良Lowry法[3]测定蛋白含量。
1.3.5 NOS活性表示 NOS活性表示为每分钟每毫克蛋白形成的[3H]-citrulline的量。创伤后各时相NOS活性以与假手术组相比而得的相对值表示。
, 百拇医药
1.3.6 统计学处理 采用F检验和t检验进行统计学处理。
2 结果
脊髓压迫伤后即刻，伤段脊髓组织NOS活性升高到正常脊髓的1.42倍，有显著差异 (P<0.01); 压迫伤后5 min达最高点，为正常脊髓组织NOS的3.24倍；之后迅速下降，至伤后60min，伤段脊髓组织NOS活性基本接近正常 (P<0.05，图1)
3 讨论
脊髓损伤包括原发性和继发性损伤。脊髓原发性损伤后引起了一系列级联放大的生化物质改变，从而造成了不可逆的继发性结构损害。现已发现许多因素都参与脊髓创伤后继发性损伤过程，诸如兴奋性氨基酸、单胺、神经肽、血小板活化因子等。然而通过逆转或阻止这些因素的变化并未能有效地阻断继发性脊髓损伤的发生。这可能是由于脊髓创伤后继发性损伤的发生是多因素参与的复杂过程，对其病理生理过程的认识尚不够深入，未能找到阻止其发生、发展的根本环节。近年来，人们认识到NO是一种机体内无处不有的小分子物质，具有广泛而多样的生物效应。为探讨其在脊髓创伤中的作用，本实验根据NOS催化同位素标记的L-Arg生成同位素标记的瓜氨酸(L-citrulline)和NO的原理，首次动态地观测了大鼠脊髓压迫伤后NOS活性的变化。结果发现脊髓压迫伤后NOS活性迅速升高，伤后5 min达最高点，此后又迅速下降，伤后60 min恢复至正常水平。脊髓压迫伤后NOS活性迅速而短暂升高,说明机体具有调节NOS活性的内在机制，然而目前对其调节的确切机制尚不清楚,可能有如下因素参与：(1)对缺血刺激的直接反应。NO的主要功能之一是调节血管张力和抗血小板粘附与聚集。在脑组织中，NO是调节血流的主要介质,脑缺血后导致了结构性NOS活性迅速升高[4]。在脊髓组织中, NO可能存在着同样的作用,当脊髓受压时导致局部缺血,从而需要大量的NO来维持局部血供, 以达到内环境的稳定。(2)结构性NOS是钙依赖性酶，而脊髓损伤后可导致大量的钙离子细胞内流[5]。(3)NOS的磷酸化与脱磷酸化。Bredt等发现脑NOS有两个基团，能被不同的蛋白激酶磷酸化，导致NOS活性下降[6]。脊髓创伤后缺血可使ATP迅速消耗而引起NOS脱磷酸，也将会导致NOS活化。(4)底物及辅助因子对NOS活性的影响。NOS催化底物L-Arg和O2反应需要大量的还原性辅助因子，如底物不足或缺少辅助因子,都将会影响反应的进行。脊髓损伤后由于NOS活性迅速升高使底物及辅助因子大量消耗，从而导致NOS活性下降。(5)反应产物对NOS活性的影响。NO具有强氧化性，能使NOS的巯基亚硝酰基化，从而使NOS[7] 失活。另外，NO尚能氧化NMDA受体中关键的巯基群,从而减少钙内流，降低NOS的活性[8]。
, 百拇医药
脊髓损伤后NOS活性早期迅速升高的意义何在，目前尚不清楚。一方面可能是对创伤和缺血刺激的反应，NOS活性升高催化产生大量的NO能扩张血管、阻抗血小板凝集，有利于改善缺血组织的血供。但是NO是一种生物活性极强的自由基，能与许多组织成分发生反应，其大量而迅速地产生将会对脊髓组织造成进一步损伤。
*国家自然科学基金资助课题(39800166)
作者简介:周初松,男,1965年出生;1997年毕业于第二军医大学;博士,主治医师;电话:85143560
参考文献
1 Schmidt HW, Walter U. Noat work. Cell, 1994, 78:919
2 Nystrom B,Berglund JE. Spinal cord restitution following compression injuries in rats. Acta Neurol Scand, 1988, 78:467
, http://www.100md.com
3 章静波. 分子生物学实用方法. 北京：人民卫生出版社，1986. 81～86
4 KaderA, Frazzini VI, Solomon RA et al. Nitric oxide production during focal cerebral ischemia in rats. Stroke,1993, 24(11):1709
5 Greenberg DA. Calcium channels and calcium channel antagonists. Ann Neurol,1987, 21:317
6 Bredt DS, Ferris CD, Snyder SH. Nitricoxide synthase regulatory site: phosphorylation by cyclin AMP dependent protein kinase C and calci um/calmodulin protein kinase; identification of flavin and calmodulin binding sites. J Biol Chem, 1992, 267:10976
7 Nathan C, Xie QW. Regulation of biosynthasis of nitric oxide. J Biol Chem, 1994, 269:13725
8 Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. Molecular mechanisms of nitricoxide actions in the brain. Ann NY Acad Sci, 1994,738:76
(收稿日期：1999-01-11), http://www.100md.com
单位：第一军医大学珠江医院骨科，广州，510282
关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；一氧化氮；大鼠
第一军医大学学报990313 摘要： 目的 探讨脊髓损伤后早期伤段脊髓组织一氧化氮合酶 (NOS)活性的动态变化规律。方法 通过伤段脊髓组织催化[3H]标记的精氨酸转化生成[3H]标记的瓜氨酸的量，测定脊髓压迫伤后0～60min伤段脊髓组织NOS的活性。结果 脊髓压迫伤后，NOS活性明显增加，伤后5min达最高点; 然后又迅速下降,于伤后1h恢复至正常水平。结论 在脊髓伤后1h内，伤段脊髓组织NOS活性迅速而短暂升高。
中图分类号: Q571; Q461
Dynamical changes of nitric oxide synthase activity in injured spinal cord tissue after spinal cord injury
, http://www.100md.com
Zhou Chusong, Jin Anmin, Zhang Hui, Yang Jiancheng
Department of Orthopaedics, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
Abstract: Objective In order to explore dynamical changes of nitric oxide synthase (NOS) activity in injured spinal cord tissue at early phase of spinal cord injury. Method NOS activity was determined by the rate of conversion of [3H]-arginine to [3H]-citrulline in injured spinal cord tissue 0 to 60 min after spinal cord compression. Results The activity of NOS was sharply increased after spinal cord compression injury and reached the highest level at 5 min,then decreased rapidly to normal level in one hour. Conclusion These results suggest that there is a sharp transient increase of NOS activity during the first hour of spinal cord compression.
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Key words: spinal cord injury; nitric oxide synthase; nitric oxide; rat
一氧化氮(Nitric oxide, NO)是由一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)催化左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)而产生，在生物体内具有广泛而多样的生物学效应，在生理状态下能传递信使、调节血管张力；在病理状态下参与脑缺血损害，具有神经毒性作用[1]。然而它在脊髓损伤中的作用尚不清楚。由于NO半衰期极短，难以直接测定,加之它在体内不能贮存，所以本实验通过测定大鼠脊髓压迫伤后NOS活性的动态变化来间接反应NO的变化规律，以利于进一步探讨NO与脊髓继发性损伤的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康、封闭群SD大鼠42只,体质量 (280±30)g，随机分为假手术组及根据后路压迫伤后取材的时间分为0、5、10、20、30和60min组，每组6只。
, http://www.100md.com
1.2 试剂及器材 L-[2,3,4,5-3H]-arginine、Dowex AG50w-X8、NADPH、钙调蛋白均购自Sigma公司,其余试剂为国产AR级。Megafuge1.0R低温离心机为日本产品，Beckman LS5000 CE液体闪烁仪为美国产品，CPS-1A超声波粉碎机为上海超声波仪器厂产品。
1.3 方法
1.3.1 动物模型的制备 动物用1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,取后正中切口，切除T 8～10椎板，暴露脊髓，按Nystrom方法[2]后路压迫脊髓(35.0g/10min)。假手术组仅行脊髓暴露而不致伤。
1.3.2 脊髓标本的采集 按分组时间要求处死动物后,立即浸入冰水中，取伤段脊髓或相应部位脊髓置于冰冷的HEPES缓冲液中 (20mmol/L，pH7.4)，匀浆，超声粉碎。立即置于4℃低温离心机中离心 (15000r/min×30min)。
, 百拇医药
1.3.3 [3H]Citrulline检测 将上述25ml上清液加于含有2mmol/L NADPH、0.5mmol/L CaCl2、10 g/L钙调蛋白的50mmol/L HEPES缓冲液中，pH为7.4。然后加入25ml[3H]L-arginine (25m ci/25 m l),置于24℃恒温水浴箱中30min。立即加入含有2mmol/LEDTA 的20mmol/L HEPES反应停止液中，过Dowex AG层析柱，于Beckman液闪仪中测定[3H]-citrulline的放射活性。
1.3.4 蛋白含量的测定 采用改良Lowry法[3]测定蛋白含量。
1.3.5 NOS活性表示 NOS活性表示为每分钟每毫克蛋白形成的[3H]-citrulline的量。创伤后各时相NOS活性以与假手术组相比而得的相对值表示。
, 百拇医药
1.3.6 统计学处理 采用F检验和t检验进行统计学处理。
2 结果
脊髓压迫伤后即刻，伤段脊髓组织NOS活性升高到正常脊髓的1.42倍，有显著差异 (P<0.01); 压迫伤后5 min达最高点，为正常脊髓组织NOS的3.24倍；之后迅速下降，至伤后60min，伤段脊髓组织NOS活性基本接近正常 (P<0.05，图1)
3 讨论
脊髓损伤包括原发性和继发性损伤。脊髓原发性损伤后引起了一系列级联放大的生化物质改变，从而造成了不可逆的继发性结构损害。现已发现许多因素都参与脊髓创伤后继发性损伤过程，诸如兴奋性氨基酸、单胺、神经肽、血小板活化因子等。然而通过逆转或阻止这些因素的变化并未能有效地阻断继发性脊髓损伤的发生。这可能是由于脊髓创伤后继发性损伤的发生是多因素参与的复杂过程，对其病理生理过程的认识尚不够深入，未能找到阻止其发生、发展的根本环节。近年来，人们认识到NO是一种机体内无处不有的小分子物质，具有广泛而多样的生物效应。为探讨其在脊髓创伤中的作用，本实验根据NOS催化同位素标记的L-Arg生成同位素标记的瓜氨酸(L-citrulline)和NO的原理，首次动态地观测了大鼠脊髓压迫伤后NOS活性的变化。结果发现脊髓压迫伤后NOS活性迅速升高，伤后5 min达最高点，此后又迅速下降，伤后60 min恢复至正常水平。脊髓压迫伤后NOS活性迅速而短暂升高,说明机体具有调节NOS活性的内在机制，然而目前对其调节的确切机制尚不清楚,可能有如下因素参与：(1)对缺血刺激的直接反应。NO的主要功能之一是调节血管张力和抗血小板粘附与聚集。在脑组织中，NO是调节血流的主要介质,脑缺血后导致了结构性NOS活性迅速升高[4]。在脊髓组织中, NO可能存在着同样的作用,当脊髓受压时导致局部缺血,从而需要大量的NO来维持局部血供, 以达到内环境的稳定。(2)结构性NOS是钙依赖性酶，而脊髓损伤后可导致大量的钙离子细胞内流[5]。(3)NOS的磷酸化与脱磷酸化。Bredt等发现脑NOS有两个基团，能被不同的蛋白激酶磷酸化，导致NOS活性下降[6]。脊髓创伤后缺血可使ATP迅速消耗而引起NOS脱磷酸，也将会导致NOS活化。(4)底物及辅助因子对NOS活性的影响。NOS催化底物L-Arg和O2反应需要大量的还原性辅助因子，如底物不足或缺少辅助因子,都将会影响反应的进行。脊髓损伤后由于NOS活性迅速升高使底物及辅助因子大量消耗，从而导致NOS活性下降。(5)反应产物对NOS活性的影响。NO具有强氧化性，能使NOS的巯基亚硝酰基化，从而使NOS[7] 失活。另外，NO尚能氧化NMDA受体中关键的巯基群,从而减少钙内流，降低NOS的活性[8]。
, 百拇医药
脊髓损伤后NOS活性早期迅速升高的意义何在，目前尚不清楚。一方面可能是对创伤和缺血刺激的反应，NOS活性升高催化产生大量的NO能扩张血管、阻抗血小板凝集，有利于改善缺血组织的血供。但是NO是一种生物活性极强的自由基，能与许多组织成分发生反应，其大量而迅速地产生将会对脊髓组织造成进一步损伤。
*国家自然科学基金资助课题(39800166)
作者简介:周初松,男,1965年出生;1997年毕业于第二军医大学;博士,主治医师;电话:85143560
参考文献
1 Schmidt HW, Walter U. Noat work. Cell, 1994, 78:919
2 Nystrom B,Berglund JE. Spinal cord restitution following compression injuries in rats. Acta Neurol Scand, 1988, 78:467
, http://www.100md.com
3 章静波. 分子生物学实用方法. 北京：人民卫生出版社，1986. 81～86
4 KaderA, Frazzini VI, Solomon RA et al. Nitric oxide production during focal cerebral ischemia in rats. Stroke,1993, 24(11):1709
5 Greenberg DA. Calcium channels and calcium channel antagonists. Ann Neurol,1987, 21:317
6 Bredt DS, Ferris CD, Snyder SH. Nitricoxide synthase regulatory site: phosphorylation by cyclin AMP dependent protein kinase C and calci um/calmodulin protein kinase; identification of flavin and calmodulin binding sites. J Biol Chem, 1992, 267:10976
7 Nathan C, Xie QW. Regulation of biosynthasis of nitric oxide. J Biol Chem, 1994, 269:13725
8 Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. Molecular mechanisms of nitricoxide actions in the brain. Ann NY Acad Sci, 1994,738:76
(收稿日期：1999-01-11), http://www.100md.com