间质胶原酶及其抑制因子-1不平衡表达与肝纤维化的关系*
作者：黄宇琦 高 毅 陈泽洪 王宇 方石岗 杨继震 李朝龙
单位：黄宇琦 李朝龙(第一军医大学1南方医院肝胆外科)；高毅 王宇 方石岗 杨继震(珠江医院肝胆外科，广州，510282)；陈泽洪(分子免疫研究所，广州，51051)
关键词：肝纤维化；间质胶原酶；组织金属蛋白酶抑制因子-1；基因表达不平衡性
间质胶原酶及其抑制因子 摘要：目的 观察实验性肝纤维化过程中间质胶原酶(MMP-13)及其组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)基因表达的不平衡性。方法 建立CCl4中毒性大鼠肝纤维化模型，采用SABC免疫组化方法和逆转录定量PCR方法测定MMP-13和TIMP-1的表达情况。 结果 MMP-13和TIMP-1在正常大鼠肝组织中有表达， 在肝纤维化发生发展过程中MMP-13表达无显著性变化，而TIMP-1的表达则逐渐增强，在肝硬化阶段达到最高值。结论 MMP-13和TIMP-1在肝纤维化过程中的不平衡表达可能是肝硬化形成的重要决定因素。
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中图分类号：R392.11
Relationship of imbalanced expression of interstitial collagenase and its inhibitors, metallo-proteinase-1 gene, to liver fibrosis Huang Yuqi1, Gao Yi2, Chen Zehong3, Wang Yu2, Fang Shigang2, Yang Jizhen2, Li Chaolong1
1Department of Hepato-Biliary Surgery, Nanfang Hospital, 3Institute of Molecular Immunology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Department of Hepato-Biliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
, 百拇医药
Abstract: Objective To investigate the imbalance in expression between interstitial collagenase (MMP-13 in rat) and inhibitor, its metalloproteinase-1 (TIMP-1) gene in the processes of experimental liver fibrosis. Methods CCl4 induced animal models of liver fibrosis was established. MMP-13 and TIMP-1 gene expression levels in the different stages of liver fibrosis were measured by immunohistochemistry (SABC assay) and quantitative analysis of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results MMP-13 and TIMP- 1 gene expressions could be detected in normal rat liver .In the pathogenesis and development of liver fibrosis. MMP-13 gene expression level was increased gradually, and reach peak levels at fibrosis stage. Conclusion MMP-13 and TIMP-1 might play an important role in the processes of pathogenesis, development of experimental liver fibrosis.
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Key words: experimental liver fibrosis; interstitial collagenase; tissue inhibitor of metalloproteinases; imbalance of gene expression
肝纤维化是Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM )成分过度沉积导致的病理性疾病。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子降解ECM 成分的水解蛋白酶，到目前为止已发现该家族至少有20个成员。肝内发现了8种，其中间质胶原酶[1](人MMP-1 in human, 大鼠MMP-13)及其抑制因子-1(Tissue inhibitor of metall-oproteinase-1,TIMP-1)不平衡表达与肝纤维化的发生发展紧密相关[1,2]。我们应用CCl4中毒性方法建立大鼠肝纤维化模型，通过SABC免疫组化方法和逆转录定量PCR方法分别对MMP-13、TIMP-1蛋白和mRNA的表达水平作了检测。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 清洁型Wistar雄性大鼠140只，体质量180～300g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%。SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；MMP-13多克隆抗体由美国(NIH)William G.Stetler-Stevenson惠赠，TIMP- 1 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology产品)购自北京中山生物技术有限公司。总RNA提取试剂盒(Trizol reagent)、M-MLV逆转录酶、RNasin为GiBco BRL产品；Oligo (dT)15primers、PCR marker及琼脂糖为Promega公司产品；DEPC、Tag酶为Sangon公司产品。
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1.1.3 仪器 PCR仪为珠海黑马公司产品；台式低温冷冻离心机为Heraeus德国公司产品；凝胶成像系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentarion Analysis System,GDAS。
1.2 方法
1.2.1 参照Montfort等[3]的方法建立CCl4中毒性肝纤维化模型 40%(v/v)CCl4纯花生油溶液按0.2ml/100 g体质量给Wistar大鼠行腹腔内注射，每周两次；正常对照组用生理盐水予腹腔注射。140 只大鼠分模型组和对照组，各70只。在0、2、5、7、9、11、13周时每组分别活杀6～8只，切取肝脏，除留作常规HE、VG病理检查外，其余迅速投入液氮，之后转入- 70℃保存。
1.2.2 免疫组化方法 冰冻切片，应用SABC即用型试剂盒进行检测，DAB显色。MMP-13一抗工作浓度1:100，TIMP-1一抗工作浓度1:150。镜下观察棕黄着色为阳性。
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1.2.3 肝组织总RNA提取 按照Trizol reagent说明书进行，紫外分光光度计检测纯度和定量。
1.2.4 cDNA的合成 采用25μl逆转录反应体系。其中含待测总RNA 1标准μg，M-MLV 200U，oligo(dT) (15primer) 50mg/L，4×dNTP (10mmol/L)2μl，5×RT buffer5μl，无RNase酶水补至25μl。37℃反应60min，95℃灭活M-MLV酶5 min。
1.2.5 逆转录PCR 根据Genebank资料自行设计以下引物(表1)。
表1 引物序列
Tab. 1 Primer sequence
Primers
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Sense
Anti-sense
Length (bp)
MMP-13
5'-TACCTACACTGGCAAAAGCC-3'
5'-ATGTCATACCCATTCAGGGCC-3'
354 bp
TIMP-1
5'-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3'
5'-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3'
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270 bp
GAPDH
5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'
5'-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3'
148 bp
参照Noonan等[4]方法进行共扩PCR，设GAPDH为内参照。PCR体系为50μl，包含cDNA 10μl ，5×buffer10μl，4×dNTP(10mmol/L)1μl，MMP-13或TIMP-1，GAPDH上下游引物(12.5nmol/L)各2μl，Tag酶1.5U，用水补至50μl。PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性50s，56℃退火70s(TIMP-1退火温度为54℃)，72℃延伸90s，选定30个循环，最后72℃再延伸7min。
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1.2.6 扩增产物鉴定和定量分析 MMP-13和TIMP-1的PCR产物经测序证实为大鼠MMP-13和TIMP-1的基因序列。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳后经GDAS系统扫描定量分析，用MMP-13/GAPDH或TIMP-1/GAPDH比值表示MMP-13和TIMP-1相对表达水平。
1.2.7 统计学处理 采用单因素方差分析方法
2 结果
2.1 免疫组化结果 MMP-13和TIMP-1在正常肝组织有阳性着色，主要出现于汇管区的血管壁和胆管壁周围，在肝窦周围细胞亦有散在阳性着色。当纤维化发生发展以及形成肝硬化时，阳性着色多集中于增生的纤维条索表面或中间。随着肝纤维化的发展，TIMP-1阳性着色比MMP-13显著。
2.2 逆转录定量分析 在肝纤维化过程中mRNA表达MMP-13无显著性变化，而TIMP-1逐步增强，肝硬化阶段最强。相对表达值见表2。
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表2 CCl4中毒性大鼠肝纤维化MMP-13和TIMP-1基因表达相对值(
±s)
Tab. 2 MMP-13 and TIMP-1 gene expression level in CCl4- induced rat model of liver fibrosis(Mean+ SD)
Group
0 week
2 week
5 week
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7 week
9 week
1 1 week
13 week
MMP-13
Control
0.55±0.11
0.49±0.13
0.56±0.2
0.60±0.18
0.57±0.15
0.48±0.14
, 百拇医药
0.59±0.09
Model
0.56±0.12
0.54±0.18
0.58±0.13
0.47±0.22
0.61±0.10
0.51±0.08
0.60±0.15
TIMP-1
Control
0.40±0.06
, 百拇医药
0.42±0.10
0.39±0.21
0.41±0.07
0.38±0.12
0.40±0.08
0.43±0.15
Model*
0.41±0.09
1.13±0.07
2.60±0.71
4.01±0.96
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5.11±1.03
6.34±1.70
7.15±1.52
*P<0.01 vs the control group in 2, 5, 7, 9, 11, 13 week, and prophase group
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用。它们直接参与细胞外基质(ECM)合成与降解的动态平衡，MMPs的调节基于三个水平即基因表达、 酶原活化以及组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)作用。其中TIMP作用水平的调控近年来受到极大关注。TIMP不但与MMP酶原以1:1形式相结合抑制它的活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能[5]。本实验研究表明间质胶原酶(大鼠MMP-13)及TIMP-1在正常肝组织有表达，肝纤维化发生发展时MMP-13表达虽无显著性变化，但是因为TIMP-1表达逐渐增强，二者的平衡被破坏，大量TIMP-1的出现使MMP-13失去活性，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、 Ⅲ型胶原降解减少、沉积增多，促进了肝纤维化、肝硬化的形成。综上所述，通过上调间质胶原酶和下调TIMP-1基因表达或抑制TIMP-1活性可能是治疗肝纤维化的新途径。
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*广东省自然科学基金资助(960362)
作者简介：黄宇琦，男，1967年出生；1992年毕业于第一军医大学；硕士；电话：85147957
参考文献
1 Iredale JP, Benyon RC, Arthuy MJP et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 messenger RNA expression is enhanced relative to interstitial collagenase messenger RNA in exprimental liver injury and fibrosis. Hepatology, 1996, 24(1):176
2 Arthur MJP. Fibrosis and altered matrix degradation. Digestion, 1998, 59 (4) :376
, http://www.100md.com
3 Montfort I, Perez-Tamayo R. Collagenase in exprimental carbontetrachlo ride cirrhosis of the liver. Am J Pathol, 1997, 92:411
4 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA et al. Quantitative analysis of DR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:7160
5 Iredal JP, Murphy G, Hembry RM et al. Human hepatic lipoctyes synthe-size tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Implication for regulation of matix degradation in liver . J Clin Invest, 1992, 90:282
(收稿日期：1998-09-09), 百拇医药
单位：黄宇琦 李朝龙(第一军医大学1南方医院肝胆外科)；高毅 王宇 方石岗 杨继震(珠江医院肝胆外科，广州，510282)；陈泽洪(分子免疫研究所，广州，51051)
关键词：肝纤维化；间质胶原酶；组织金属蛋白酶抑制因子-1；基因表达不平衡性
间质胶原酶及其抑制因子 摘要：目的 观察实验性肝纤维化过程中间质胶原酶(MMP-13)及其组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)基因表达的不平衡性。方法 建立CCl4中毒性大鼠肝纤维化模型，采用SABC免疫组化方法和逆转录定量PCR方法测定MMP-13和TIMP-1的表达情况。 结果 MMP-13和TIMP-1在正常大鼠肝组织中有表达， 在肝纤维化发生发展过程中MMP-13表达无显著性变化，而TIMP-1的表达则逐渐增强，在肝硬化阶段达到最高值。结论 MMP-13和TIMP-1在肝纤维化过程中的不平衡表达可能是肝硬化形成的重要决定因素。
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中图分类号：R392.11
Relationship of imbalanced expression of interstitial collagenase and its inhibitors, metallo-proteinase-1 gene, to liver fibrosis Huang Yuqi1, Gao Yi2, Chen Zehong3, Wang Yu2, Fang Shigang2, Yang Jizhen2, Li Chaolong1
1Department of Hepato-Biliary Surgery, Nanfang Hospital, 3Institute of Molecular Immunology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Department of Hepato-Biliary Surgery of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
, 百拇医药
Abstract: Objective To investigate the imbalance in expression between interstitial collagenase (MMP-13 in rat) and inhibitor, its metalloproteinase-1 (TIMP-1) gene in the processes of experimental liver fibrosis. Methods CCl4 induced animal models of liver fibrosis was established. MMP-13 and TIMP-1 gene expression levels in the different stages of liver fibrosis were measured by immunohistochemistry (SABC assay) and quantitative analysis of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results MMP-13 and TIMP- 1 gene expressions could be detected in normal rat liver .In the pathogenesis and development of liver fibrosis. MMP-13 gene expression level was increased gradually, and reach peak levels at fibrosis stage. Conclusion MMP-13 and TIMP-1 might play an important role in the processes of pathogenesis, development of experimental liver fibrosis.
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Key words: experimental liver fibrosis; interstitial collagenase; tissue inhibitor of metalloproteinases; imbalance of gene expression
肝纤维化是Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM )成分过度沉积导致的病理性疾病。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子降解ECM 成分的水解蛋白酶，到目前为止已发现该家族至少有20个成员。肝内发现了8种，其中间质胶原酶[1](人MMP-1 in human, 大鼠MMP-13)及其抑制因子-1(Tissue inhibitor of metall-oproteinase-1,TIMP-1)不平衡表达与肝纤维化的发生发展紧密相关[1,2]。我们应用CCl4中毒性方法建立大鼠肝纤维化模型，通过SABC免疫组化方法和逆转录定量PCR方法分别对MMP-13、TIMP-1蛋白和mRNA的表达水平作了检测。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 清洁型Wistar雄性大鼠140只，体质量180～300g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%。SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；MMP-13多克隆抗体由美国(NIH)William G.Stetler-Stevenson惠赠，TIMP- 1 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology产品)购自北京中山生物技术有限公司。总RNA提取试剂盒(Trizol reagent)、M-MLV逆转录酶、RNasin为GiBco BRL产品；Oligo (dT)15primers、PCR marker及琼脂糖为Promega公司产品；DEPC、Tag酶为Sangon公司产品。
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1.1.3 仪器 PCR仪为珠海黑马公司产品；台式低温冷冻离心机为Heraeus德国公司产品；凝胶成像系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentarion Analysis System,GDAS。
1.2 方法
1.2.1 参照Montfort等[3]的方法建立CCl4中毒性肝纤维化模型 40%(v/v)CCl4纯花生油溶液按0.2ml/100 g体质量给Wistar大鼠行腹腔内注射，每周两次；正常对照组用生理盐水予腹腔注射。140 只大鼠分模型组和对照组，各70只。在0、2、5、7、9、11、13周时每组分别活杀6～8只，切取肝脏，除留作常规HE、VG病理检查外，其余迅速投入液氮，之后转入- 70℃保存。
1.2.2 免疫组化方法 冰冻切片，应用SABC即用型试剂盒进行检测，DAB显色。MMP-13一抗工作浓度1:100，TIMP-1一抗工作浓度1:150。镜下观察棕黄着色为阳性。
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1.2.3 肝组织总RNA提取 按照Trizol reagent说明书进行，紫外分光光度计检测纯度和定量。
1.2.4 cDNA的合成 采用25μl逆转录反应体系。其中含待测总RNA 1标准μg，M-MLV 200U，oligo(dT) (15primer) 50mg/L，4×dNTP (10mmol/L)2μl，5×RT buffer5μl，无RNase酶水补至25μl。37℃反应60min，95℃灭活M-MLV酶5 min。
1.2.5 逆转录PCR 根据Genebank资料自行设计以下引物(表1)。
表1 引物序列
Tab. 1 Primer sequence
Primers
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Sense
Anti-sense
Length (bp)
MMP-13
5'-TACCTACACTGGCAAAAGCC-3'
5'-ATGTCATACCCATTCAGGGCC-3'
354 bp
TIMP-1
5'-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3'
5'-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3'
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270 bp
GAPDH
5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'
5'-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3'
148 bp
参照Noonan等[4]方法进行共扩PCR，设GAPDH为内参照。PCR体系为50μl，包含cDNA 10μl ，5×buffer10μl，4×dNTP(10mmol/L)1μl，MMP-13或TIMP-1，GAPDH上下游引物(12.5nmol/L)各2μl，Tag酶1.5U，用水补至50μl。PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性50s，56℃退火70s(TIMP-1退火温度为54℃)，72℃延伸90s，选定30个循环，最后72℃再延伸7min。
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1.2.6 扩增产物鉴定和定量分析 MMP-13和TIMP-1的PCR产物经测序证实为大鼠MMP-13和TIMP-1的基因序列。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳后经GDAS系统扫描定量分析，用MMP-13/GAPDH或TIMP-1/GAPDH比值表示MMP-13和TIMP-1相对表达水平。
1.2.7 统计学处理 采用单因素方差分析方法
2 结果
2.1 免疫组化结果 MMP-13和TIMP-1在正常肝组织有阳性着色，主要出现于汇管区的血管壁和胆管壁周围，在肝窦周围细胞亦有散在阳性着色。当纤维化发生发展以及形成肝硬化时，阳性着色多集中于增生的纤维条索表面或中间。随着肝纤维化的发展，TIMP-1阳性着色比MMP-13显著。
2.2 逆转录定量分析 在肝纤维化过程中mRNA表达MMP-13无显著性变化，而TIMP-1逐步增强，肝硬化阶段最强。相对表达值见表2。
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表2 CCl4中毒性大鼠肝纤维化MMP-13和TIMP-1基因表达相对值(
±s)Tab. 2 MMP-13 and TIMP-1 gene expression level in CCl4- induced rat model of liver fibrosis(Mean+ SD)
Group
0 week
2 week
5 week
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7 week
9 week
1 1 week
13 week
MMP-13
Control
0.55±0.11
0.49±0.13
0.56±0.2
0.60±0.18
0.57±0.15
0.48±0.14
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0.59±0.09
Model
0.56±0.12
0.54±0.18
0.58±0.13
0.47±0.22
0.61±0.10
0.51±0.08
0.60±0.15
TIMP-1
Control
0.40±0.06
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0.42±0.10
0.39±0.21
0.41±0.07
0.38±0.12
0.40±0.08
0.43±0.15
Model*
0.41±0.09
1.13±0.07
2.60±0.71
4.01±0.96
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5.11±1.03
6.34±1.70
7.15±1.52
*P<0.01 vs the control group in 2, 5, 7, 9, 11, 13 week, and prophase group
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用。它们直接参与细胞外基质(ECM)合成与降解的动态平衡，MMPs的调节基于三个水平即基因表达、 酶原活化以及组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)作用。其中TIMP作用水平的调控近年来受到极大关注。TIMP不但与MMP酶原以1:1形式相结合抑制它的活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能[5]。本实验研究表明间质胶原酶(大鼠MMP-13)及TIMP-1在正常肝组织有表达，肝纤维化发生发展时MMP-13表达虽无显著性变化，但是因为TIMP-1表达逐渐增强，二者的平衡被破坏，大量TIMP-1的出现使MMP-13失去活性，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、 Ⅲ型胶原降解减少、沉积增多，促进了肝纤维化、肝硬化的形成。综上所述，通过上调间质胶原酶和下调TIMP-1基因表达或抑制TIMP-1活性可能是治疗肝纤维化的新途径。
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*广东省自然科学基金资助(960362)
作者简介：黄宇琦，男，1967年出生；1992年毕业于第一军医大学；硕士；电话：85147957
参考文献
1 Iredale JP, Benyon RC, Arthuy MJP et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 messenger RNA expression is enhanced relative to interstitial collagenase messenger RNA in exprimental liver injury and fibrosis. Hepatology, 1996, 24(1):176
2 Arthur MJP. Fibrosis and altered matrix degradation. Digestion, 1998, 59 (4) :376
, http://www.100md.com
3 Montfort I, Perez-Tamayo R. Collagenase in exprimental carbontetrachlo ride cirrhosis of the liver. Am J Pathol, 1997, 92:411
4 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA et al. Quantitative analysis of DR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:7160
5 Iredal JP, Murphy G, Hembry RM et al. Human hepatic lipoctyes synthe-size tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Implication for regulation of matix degradation in liver . J Clin Invest, 1992, 90:282
(收稿日期：1998-09-09), 百拇医药