降钙素基因相关肽在大鼠纹状体边缘区内分布及其纤维联系的研究*
作者：李耀宇 舒斯云 包新民 吴文龙
单位：第一军医大学珠江医院神经科学研究所, 广州, 510280
关键词：降钙素基因相关肽；纹状体；边缘区；杏仁核；终纹床核；黑质；边缘系统
第一军医大学学报990303 摘要: 应用免疫细胞化学ABC法对降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠纹状体边缘区内的分布以及与杏仁核、终纹床核等边缘系统结构之间的联系进行了研究。结果发现：(1)CGRP免疫阳性纤维在纹状体内存在于纹状体的中部和尾侧，位于尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，形成一条明显的背腹方向走行的带状。CGRP免疫阳性纤维分布越靠纹状体尾，则纤维越密集，且阳性带越宽；(2)在纹状体的最尾侧，除边缘区外，尾壳核的外侧缘也出现一条致密的阳性纤维带，与边缘区走向一致。并与边缘区的CGRP阳性纤维带之间存在较多的横向联系纤维；(3)纹状体边缘区的CGRP阳性纤维向背侧通过终纹与吻侧的终纹床核联系，向腹侧与杏仁核的CGRP阳性纤维相连，向尾侧和中脑黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体相连；(4)边缘区的CGRP阳性纤维主要与杏仁中央核相联系，少量与杏仁内侧核相联系；尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维也主要与杏仁中央核相联系。结果提示：CGRP阳性纤维在纹状体边缘区、杏仁核、终纹床核以及黑质背外侧区之间形成了一个相互联系的神经网络，纹状体边缘区与边缘系统之间存在密切的纤维联系。
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中图分类号：R741
Distribution and fiber connection of calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the marginal division of the rat striatum
Li Yaoyu, Shu Siyun, Bao Xinmin, Wu Wenlong
Institute of Neurosciences, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510280
Abstract: Using immunocytochemical ABC method, the expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP)in the marginal division (MrD) of the striatum, and the connection between the MrD and the limbic system were investigated in rat. The results were as follows: (1) The CGRP- positive fibers were found in the middle and caudal part of the striatum, and located between the caudate putamen (Cpu) and pallidum (GP), corresponding to the MrD of the striatum. The CGRP-positive fibers ran dorsoventrally in the MrD and formed a dense band. The CGRP-positive fibers were more densely and widely distributed in the caudal part of the MrD. (2) In the most caudal extent of the striatum, there was also a dense band of CGRP-positive fibers in the lateral border of the caudate putamen and the direction of the fibers was also dorsoventral. There are some transverse CGRP-positive fibers connecting the MrD and Cpu. (3) The CGRP-positive fibers in the MrD of the striatum connected dorsally with the bed nucleus of the stria terminals through the stria terminals, ventrally with the amygdaloid nucleus, and caudally with the CGRP-positive cell bodies in the lateral part of the substantia nigra and its dorsolateral area. (4) The CGRP-positive fibers connected mainly with the central amygdaloid nucleus, and less with the medial amygdaloid nucleus; the CGRP-positive fibers in the lateral border of the caudate putamen connected mainly with the central amygdaloid nucleus as well. These results show that there are reciprocal CGRP-positive fiber connections among the MrD of the striatum, amygdaloid nucleus, bed nucleus of the stria terminals and substantia nigra and its dorsolateral area. It is suggested that there is an affinity relationship between the MrD and limbic system.
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Key words: calcitonin gene-related peptide (CGRP); striatum; marginal division; amygdaloid nucleus; bed nucleus; stria terminals; substantia nigra; limbic system
通过DNA重组和分子生物学技术证实，降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由37个氨基酸组成的多肽[1]。它广泛分布在中枢和周围神经系统，是中枢和周围神经系统重要的神经递质或神经调质。纹状体内已被证明有CGRP纤维存在[2]。纹状体边缘区为位于纹状体尾侧部尾壳核与苍白球之间的一个扁平盘状的脑区[3]。我们以往的研究表明边缘区内有丰富的P物质 (SP)、强腓肽B (DynB)、脑腓肽 (ENK)、胆囊收缩素 (CCK)、神经降压肽 (NT)、神经肽Y (NPY)等神经递质的分布[4]。但纹状体边缘区内有无CGRP纤维的分布尚未见报道。纹状体内CGRP纤维的来源已被证明来自丘脑的尾侧部和内侧膝状体的腹侧部[5]。但边缘区内的CGRP纤维来自何处尚不清楚。我们曾用原癌基因c-fos表达的方法证明边缘区和海马、杏仁核、终纹床核等边缘系统结构有功能联系。但边缘区和上述边缘系统结构间有无纤维联系尚未见报道。因此本研究用免疫细胞化学ABC法研究了CGRP在纹状体边缘区中的分布及其与杏仁核及终纹床核等边缘系统结构间的纤维联系。
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1 材料和方法
SD雄性大鼠8只，体质量205～220 g，腹腔内注射10%水合氯醛(0.35ml/100g体质量)麻醉后进行灌注取材。常规开胸，剪开右心耳，从左心室插管至升主动脉，先用生理盐水100ml(室温)快速灌注，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲液250ml(4℃)快速灌注固定，再用250ml慢速滴注固定3h。然后取脑，置于30%蔗糖溶液中，在冰箱中至沉底。行恒冷箱切片机连续冠状或矢状切片，片厚50mm，分成3套，取1套进行免疫细胞化学染色，1套做常规Nissl染色，1套做阴性对照。切片经0.01mol/L PBS(pH7.4)清洗，10min´ 3；再经0.3% Triton X-100 37° C，30min。然后进行下列免疫组化过程：兔抗CGRP血清(INCSTAR，1:8000)，4° C湿盒孵育48～72h；0.01mol/L PBS(pH 7.5)10min´ 3，生物素结合的羊抗兔Ig G(Vector，1:200)4° C湿盒孵育过夜；0.01mol/L PBS(pH7.5)10min´ 3，再在卵白素-生物素复合物(Vector，1:100)中孵育(室温)4h；0.01mol/L PBS(pH 7.5)10min´ 3，GDN法显色；明胶贴片，自然干燥，酒精梯度脱水、二甲苯透明、DPX封片；OLYMPUS VANOX AHBS3显微镜照相。
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阴性对照实验：用血清稀释液代替一抗进行上述免疫组化过程。
2 结 果
2.1 纹状体内CGRP免疫阳性物质的分布 在冠状连续切片上观察，纹状体中CGRP免疫阳性纤维出现在纹状体的尾侧部。阳性纤维集中分布在尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，纤维呈背腹方向走行，呈带状分布 (图1)。纤维粗细不一，有些细纤维可见扣结状膨大。阳性纤维在边缘区嘴侧刚出现时较少及稀疏，范围也较窄；靠近尾侧时阳性纤维越密，分布的范围逐渐变宽。在纹状体的最尾侧部，除了边缘区有浓密的带状阳性纤维分布外，在尾壳核的外侧紧靠胼胝体内侧边缘也出现浓密的阳性纤维分布，腹侧部尤其密集，其走行与尾壳核的外侧缘基本一致；在边缘区的CGRP阳性纤维带与尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维带之间可见CGRP阳性纤维横向走行联系于两者之间 (图2)。
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图1 纹状体部位冠状切面
Fig. 1 Coronal section of striatum
CGRP-immunopositive fibers were found in the marginal division with stripe-like distribution. AC: Anterior commissure; Bst: Bed nucleus of the stria terminals; Ce: Central amygdaloid nucleus; Cp: Cerebral peduncle; Cpu: Caudate putamen; GP: palladium; MG: Medial geniculate; MrD: Marginal division; OT: Optic tract; pp: Peripeduncular nucleus; SN: Substantia nigra; ST: Stria terminals; Th: Thalamus; Zi: Zona incerta
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图2 纹状体尾侧部
Fig. 2 Caudal part of the striatum
CGRP-immunopositive fibers are densely distributed in the lateral margin
of caudate putamen, particularly in the ventral part
2.2 杏仁核内CGRP免疫阳性物质的分布及其与纹状体边缘区之间的纤维联系 杏仁核内的CGRP免疫阳性物质主要分布在中央杏仁核，尤其是中央杏仁核的外侧部更为密集。杏仁内侧核和腹侧核只有少量分布，杏仁外侧核则未见阳性纤维分布。杏仁核内的免疫阳性物质主要为免疫阳性纤维，在中央杏仁核外侧部的尾侧亦可见较多阳性细胞胞体存在。中央杏仁核外侧部内的CGRP阳性胞体发出的纤维向内侧走行，通过中央杏仁核的内侧部，弯向背侧走行，进入尾壳核，和边缘区及尾壳核外侧缘内的CGRP阳性纤维相连。部分阳性纤维进入内囊，和中脑黑质外侧部及其背外侧区CGRP阳性胞体发出的纤维相连 (图3，4)。 尾壳核腹侧的CGRP阳性纤维不直接和中央杏仁核相连，两者之间有一条透明的带相隔。
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图3 纹状体背侧部切面
Fig. 3 Section of dorsal part of the striatum
CGRP-immunopositive fibers in the stria terminals ventrolaterally curve into the MrD. The diameter of CGRP-immunopositive fibers vary. Some of the fibers exhibit dot-and bouton-like shape. Arrow indicates CGRP-immunopositive fibers of the stria terminals run into the MrD
图4 杏仁核中的CGRP阳性纤维
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Fig. 4 CGRP-immunopositive fibers in the amygdaloid nucleus
The fibers were located mainly in central amygdaloid nucleus and connected with the CGRP fibers in the dorsal part and marginal division, a translucent band (arrow) separated central amygdaloid nucleus and caudate putamen
2.3 终纹床核内的CGRP免疫阳性物质分布及其与纹状体边缘区之间的纤维联系 在冠状切面上观察，在终纹床核内可见密集的CGRP阳性物质分布，主要为免疫阳性纤维，以卵圆核和梭形核中最为密集，其它亚核仅有少量阳性纤维分布。梭形核中还可见较多的CGRP免疫阳性细胞。由终纹床核发出的CGRP阳性纤维行向背外侧，进入终纹，在侧脑室和丘脑之间行向尾侧，在纹状体的尾侧部由终纹弯向腹外侧走行，进入边缘区的背侧部，在边缘区内行向腹侧 (图5)。
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图5 终纹床核中的CGRP阳性物质
Fig. 5 CGRP-immunopositive substances in the bed nucleus of the stria terminalis
CGRP-immunopositive fibers run dorsolaterally into the stria terminals
2.4 黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体以及与纹状体边缘区之间的纤维联系 在矢状切面上观察，可见在内侧膝状体的腹侧，黑质的背外侧部位，相当于黑质外侧部、脚周核和丘脑后板内核部位，以及内侧膝状体的腹侧部，有一群密集的CGRP阳性胞体。胞体的突起呈吻尾方向排列，发出纤维行向吻侧，经过未定带的背侧，进入内囊，部分纤维和腹侧的杏仁核相连，大部分纤维弯向背侧，向吻侧穿过内囊和苍白球，在苍白球和尾壳核之间即相当于边缘区的部位形成一条密集的CGRP阳性纤维带 (图6～8)。
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图6 中脑黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体
Fig. 6 CGRP-immunopositive cell bodies in the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part
CGRP-immunopositive fibers run rostrally and are located dorsally at the substantia nigra, and go into the internal capsule through the zona incerta
图7 图6的放大
Fig. 7 Magnification of Fig. 6
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CGRP-immunopositive cell bodies in the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part give out fibers rostrally
图8 来自黑质外侧核及其背外侧区的CGRP阳性纤维穿过内囊和边缘区相连
Fig. 8 CGRP-immunopositive fibers from the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part penetrate the internal capsule and connect with the MrD
Some fibers connected with the fibers from the ventral amygdaloid nucleus (arrow)
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3 讨论
3.1 CGRP在纹状体内的分布 CGRP在中枢神经系统中的分布比较广泛， 纹状体中也有较多分布。有人用免疫组化方法研究了CGRP在中枢神经的分布，观察到尾壳核及中央杏仁核中有浓密的分布，并用放免方法测定到CGRP在中央杏仁核和尾壳核的水平最高，和免疫组化的结果一致。Okayama等[3]观察到纹状体中的CGRP纤维集中分布在尾壳核的腹侧缘及尾侧部，其它部分仅有少量分布。并用电镜证明所有免疫阳性扣结均含有小的清亮小泡，和树突棘和树突干形成非对称性突触。推测CGRP纤维和纹状体内中等大小的有棘投射神经元形成突触。但他们均未提及CGRP在纹状体边缘区中的分布情况。纹状体边缘区是舒斯云等[4]1987年在大鼠纹状体中发现的一个新亚区。为位于纹状体尾侧部尾壳核和苍白球之间的一个盘状结构。主要由密集的梭形细胞构成，边缘区中含有密集的SP、ENK、CCK、NT、NPY 等神经肽及5-HT神经纤维及终末[5]。本研究观察到纹状体中CGRP免疫阳性纤维出现在纹状体的尾侧部，集中分布在尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，纤维呈背腹方向走行，呈带状分布。在纹状体的最尾侧部，尾壳核的外侧也出现浓密的阳性纤维分布，腹侧部尤其密集，其走行与尾壳核的外缘基本一致；在边缘区与尾壳核外侧的CGRP阳性纤维带之间可见阳性纤维横向走行联系。本结果基本上和Okayama等[3]观察的结果吻合，即纹状体中的CGRP阳性纤维主要分布在尾壳核的腹侧缘及尾侧部，但他们没有描述CGRP纤维在边缘区及尾壳核外侧缘的分布情况，本文则首次报道了纹状体边缘区内CGRP免疫阳性纤维的分布特征。
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3.2 纹状体CGRP阳性纤维与边缘系统间的联系 我们曾用原癌基因c-Fos表达的方法证明纹状体边缘区和海马、杏仁核、终纹床核等边缘系统结构间有功能联系。 Parent等 [8]根据纤维联系及功能不同提出纹状体可分为三种解剖功能亚区，即分为运动、联合和边缘纹状区。其中，边缘纹状区包括伏核和壳及尾状核的大部分腹侧部。大脑皮层的运动、联合和边缘区以分离的方式分别投射到三个独特的纹状亚区。其中的边缘纹状区接受边缘系统的结构如海马、杏仁核以及推测可能有促进边缘系统自律功能的前皮层区即Orbitfrontal, Infralimbic和Prelimbic皮层的广泛传入。一些研究已经证明纹状体和中央杏仁核之间有纤维联系。如Shinonaga等[9]研究了猫中央杏仁核到基底节的直接投射，发现中央杏仁核外侧部的纤维投射到苍白球尾侧部的内侧及黑质外侧部。McDonald [8]研究了杏仁核到尾壳核的局部定位投射，认为中央杏仁核和终纹床核的外侧部为纹状体样结构。 但纹状体边缘区和边缘系统的一些结构如杏仁核、海马、终纹床核等核团之间有无直接纤维联系，尚未见报道。虽然中央杏仁核和终纹床核之间有纤维联系[9]，终纹床核可通过中央杏仁核影响纹状体的功能，但终纹床核是否和纹状体尤其是边缘区有纤维直接联系，也未见报道。本文首次报告了纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维与中央杏仁核及终纹床核之间存在着直接纤维联系，即纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维向背侧通过终纹接收来自终纹床核 (主要为梭形核)的投射；向腹侧主要和中央杏仁核中的CGRP纤维相连，即中央杏仁核外侧部中的CGRP阳性胞体发出纤维向内侧走行，经过中央杏仁核内侧部，弯向背侧走行，和边缘区及尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维相连。
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纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维除了和中央杏仁核及终纹床核相联系外，还接收来自中脑黑质外侧部及其背外侧区中CGRP阳性胞体的投射，包括黑质外侧部、脚周核、丘脑后板内核及内侧膝状体腹侧部的CGRP阳性胞体。此结果和Kubota等[5]报道的结果一致，但他们并未提及和纹状体边缘区相联系。我们曾观察到纹状体边缘区接收来自黑质外侧部及其背外侧区SP、NT、CCK、L-ENK及TH阳性胞体的传人投射[10], 本研究又证明了黑质外侧部及其背外侧区中的CGRP阳性胞体投射到纹状体边缘区。一般认为杏仁核和终纹床核是边缘系统的皮质下结构，中脑的被盖区是边缘中脑的组成部分。因此本研究的结果显示纹状体边缘区和边缘系统的某些结构之间存在着直接的纤维联系。从纤维联系上进一步证明纹状体边缘区是边缘系统的一个组成部分 (图9)。
图9 纹状体边缘区内CGRP阳性纤维联系的模式图
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Fig. 9 Schematic diagram of the connection of CGRP-immunopositive fibers in the MrD of the striatum
CGRP-immunopositive fibers in the MrD dorsally project into the stria terminals and connect with the bed nucleus of the stria terminals. The MrD receives the afferent CGRP-positive fibers ventrally from CGRP-immuno-positive cell bodies in the central amygdaloid nucleus and caudately from the cell bodies in the lateral part of the substantia nigra and its dorsolateral part.
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我们曾用Y迷宫试验证明纹状体边缘区的功能和学习记忆有关[10]。并用电镜证明边缘区和脑内与学习记忆功能有关的Meynert基底核有突触联系。Kovacs等[12]向侧脑室内注射CGRP能显著降低大鼠被动逃避行为学习的潜伏期，认为CGRP可能是一种与学习有关记忆过程的调节物，并推测和多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺及阿片肽等递质有关。本研究亦观察到边缘区中存在着密集的CGRP阳性纤维并和边缘系统相联系。
*国家自然科学基金(39770550)和广东省科学基金(950554)资助
作者简介：李耀宇，男，1963年出生；1985年毕业于第四军医大学；博士，主治医师；电话：85143636
舒斯云(项目负责人)
参考文献
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2 Skofitsch G, Jacobowitz DM. Calcitonin gene-related peptide: detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides, 1985, 6 (4):721
3 Shu SY, Penny GR, Peterson GM. A new subdivision, the marginal division, in the neostriatum of rats. J Chem Neuroanat, 1988, 1:147
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4 包新民，舒斯云，牛东滨等. 猫纹状体边缘区中P物质, 脑啡肽, 神经肽Y和NADPH-d阳性物质的分布. 中国神经科学杂志,1998,14 (4): 213
5 Kubota Y, Inagaki S, Shimada S et al.. Striatal calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive afferents from the regions ventral and medial to the medial geniculate nucleus of rats. Neuroscience, 1991, 40 (2):423
6 Parent A, Hazrati LN. Anatomical aspects of information processing in primate basal ganglia. Trends Neurosci, 1993, 16:111
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7 Shhinonaga Y, Takaga M, Mizuno N. Direct projections from the centralamygdaloid nucleus to the globus pallidus and substantia nigra in the cat. Neuroscience, 1992, 51 (3):691
8 McDonald AJ. Topographical organization of amygdaloid projections to the caudoputamen, nucleus accumbens, and related striatal-like areas of the rat brain. Neuroscience, 1991, 44 (1):15
9 Sun N, Roberts L, Cassel MD. Rat central amygdaloid nucleus projections to the bed nucleus of the stria terminalis. Brain Res Bull, 1991, 27 (5):651
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10 Shu SY, Bao XM, Li SX. The afferent connections and its immuno-histochemical characteristics of the marginal division in the rat corpus striatum. J Med Coll PLA，1995, 10 (4):259
11 李胜修，舒斯云，包新民等. 海人藻酸破坏纹状体边缘区后对大鼠学习和记忆功能影响的研究. 神经解剖学杂志，1996,12 (1):37
12 Kovacs A, Telegdy G. Effects of CGRP on active avoidance behavior in rats. Physiol Behav, 1995, 58(3):429
(收稿日期：1999-03-18), http://www.100md.com
单位：第一军医大学珠江医院神经科学研究所, 广州, 510280
关键词：降钙素基因相关肽；纹状体；边缘区；杏仁核；终纹床核；黑质；边缘系统
第一军医大学学报990303 摘要: 应用免疫细胞化学ABC法对降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠纹状体边缘区内的分布以及与杏仁核、终纹床核等边缘系统结构之间的联系进行了研究。结果发现：(1)CGRP免疫阳性纤维在纹状体内存在于纹状体的中部和尾侧，位于尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，形成一条明显的背腹方向走行的带状。CGRP免疫阳性纤维分布越靠纹状体尾，则纤维越密集，且阳性带越宽；(2)在纹状体的最尾侧，除边缘区外，尾壳核的外侧缘也出现一条致密的阳性纤维带，与边缘区走向一致。并与边缘区的CGRP阳性纤维带之间存在较多的横向联系纤维；(3)纹状体边缘区的CGRP阳性纤维向背侧通过终纹与吻侧的终纹床核联系，向腹侧与杏仁核的CGRP阳性纤维相连，向尾侧和中脑黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体相连；(4)边缘区的CGRP阳性纤维主要与杏仁中央核相联系，少量与杏仁内侧核相联系；尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维也主要与杏仁中央核相联系。结果提示：CGRP阳性纤维在纹状体边缘区、杏仁核、终纹床核以及黑质背外侧区之间形成了一个相互联系的神经网络，纹状体边缘区与边缘系统之间存在密切的纤维联系。
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Distribution and fiber connection of calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the marginal division of the rat striatum
Li Yaoyu, Shu Siyun, Bao Xinmin, Wu Wenlong
Institute of Neurosciences, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510280
Abstract: Using immunocytochemical ABC method, the expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP)in the marginal division (MrD) of the striatum, and the connection between the MrD and the limbic system were investigated in rat. The results were as follows: (1) The CGRP- positive fibers were found in the middle and caudal part of the striatum, and located between the caudate putamen (Cpu) and pallidum (GP), corresponding to the MrD of the striatum. The CGRP-positive fibers ran dorsoventrally in the MrD and formed a dense band. The CGRP-positive fibers were more densely and widely distributed in the caudal part of the MrD. (2) In the most caudal extent of the striatum, there was also a dense band of CGRP-positive fibers in the lateral border of the caudate putamen and the direction of the fibers was also dorsoventral. There are some transverse CGRP-positive fibers connecting the MrD and Cpu. (3) The CGRP-positive fibers in the MrD of the striatum connected dorsally with the bed nucleus of the stria terminals through the stria terminals, ventrally with the amygdaloid nucleus, and caudally with the CGRP-positive cell bodies in the lateral part of the substantia nigra and its dorsolateral area. (4) The CGRP-positive fibers connected mainly with the central amygdaloid nucleus, and less with the medial amygdaloid nucleus; the CGRP-positive fibers in the lateral border of the caudate putamen connected mainly with the central amygdaloid nucleus as well. These results show that there are reciprocal CGRP-positive fiber connections among the MrD of the striatum, amygdaloid nucleus, bed nucleus of the stria terminals and substantia nigra and its dorsolateral area. It is suggested that there is an affinity relationship between the MrD and limbic system.
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Key words: calcitonin gene-related peptide (CGRP); striatum; marginal division; amygdaloid nucleus; bed nucleus; stria terminals; substantia nigra; limbic system
通过DNA重组和分子生物学技术证实，降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由37个氨基酸组成的多肽[1]。它广泛分布在中枢和周围神经系统，是中枢和周围神经系统重要的神经递质或神经调质。纹状体内已被证明有CGRP纤维存在[2]。纹状体边缘区为位于纹状体尾侧部尾壳核与苍白球之间的一个扁平盘状的脑区[3]。我们以往的研究表明边缘区内有丰富的P物质 (SP)、强腓肽B (DynB)、脑腓肽 (ENK)、胆囊收缩素 (CCK)、神经降压肽 (NT)、神经肽Y (NPY)等神经递质的分布[4]。但纹状体边缘区内有无CGRP纤维的分布尚未见报道。纹状体内CGRP纤维的来源已被证明来自丘脑的尾侧部和内侧膝状体的腹侧部[5]。但边缘区内的CGRP纤维来自何处尚不清楚。我们曾用原癌基因c-fos表达的方法证明边缘区和海马、杏仁核、终纹床核等边缘系统结构有功能联系。但边缘区和上述边缘系统结构间有无纤维联系尚未见报道。因此本研究用免疫细胞化学ABC法研究了CGRP在纹状体边缘区中的分布及其与杏仁核及终纹床核等边缘系统结构间的纤维联系。
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SD雄性大鼠8只，体质量205～220 g，腹腔内注射10%水合氯醛(0.35ml/100g体质量)麻醉后进行灌注取材。常规开胸，剪开右心耳，从左心室插管至升主动脉，先用生理盐水100ml(室温)快速灌注，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲液250ml(4℃)快速灌注固定，再用250ml慢速滴注固定3h。然后取脑，置于30%蔗糖溶液中，在冰箱中至沉底。行恒冷箱切片机连续冠状或矢状切片，片厚50mm，分成3套，取1套进行免疫细胞化学染色，1套做常规Nissl染色，1套做阴性对照。切片经0.01mol/L PBS(pH7.4)清洗，10min´ 3；再经0.3% Triton X-100 37° C，30min。然后进行下列免疫组化过程：兔抗CGRP血清(INCSTAR，1:8000)，4° C湿盒孵育48～72h；0.01mol/L PBS(pH 7.5)10min´ 3，生物素结合的羊抗兔Ig G(Vector，1:200)4° C湿盒孵育过夜；0.01mol/L PBS(pH7.5)10min´ 3，再在卵白素-生物素复合物(Vector，1:100)中孵育(室温)4h；0.01mol/L PBS(pH 7.5)10min´ 3，GDN法显色；明胶贴片，自然干燥，酒精梯度脱水、二甲苯透明、DPX封片；OLYMPUS VANOX AHBS3显微镜照相。
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阴性对照实验：用血清稀释液代替一抗进行上述免疫组化过程。
2 结 果
2.1 纹状体内CGRP免疫阳性物质的分布 在冠状连续切片上观察，纹状体中CGRP免疫阳性纤维出现在纹状体的尾侧部。阳性纤维集中分布在尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，纤维呈背腹方向走行，呈带状分布 (图1)。纤维粗细不一，有些细纤维可见扣结状膨大。阳性纤维在边缘区嘴侧刚出现时较少及稀疏，范围也较窄；靠近尾侧时阳性纤维越密，分布的范围逐渐变宽。在纹状体的最尾侧部，除了边缘区有浓密的带状阳性纤维分布外，在尾壳核的外侧紧靠胼胝体内侧边缘也出现浓密的阳性纤维分布，腹侧部尤其密集，其走行与尾壳核的外侧缘基本一致；在边缘区的CGRP阳性纤维带与尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维带之间可见CGRP阳性纤维横向走行联系于两者之间 (图2)。
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图1 纹状体部位冠状切面
Fig. 1 Coronal section of striatum
CGRP-immunopositive fibers were found in the marginal division with stripe-like distribution. AC: Anterior commissure; Bst: Bed nucleus of the stria terminals; Ce: Central amygdaloid nucleus; Cp: Cerebral peduncle; Cpu: Caudate putamen; GP: palladium; MG: Medial geniculate; MrD: Marginal division; OT: Optic tract; pp: Peripeduncular nucleus; SN: Substantia nigra; ST: Stria terminals; Th: Thalamus; Zi: Zona incerta
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图2 纹状体尾侧部
Fig. 2 Caudal part of the striatum
CGRP-immunopositive fibers are densely distributed in the lateral margin
of caudate putamen, particularly in the ventral part
2.2 杏仁核内CGRP免疫阳性物质的分布及其与纹状体边缘区之间的纤维联系 杏仁核内的CGRP免疫阳性物质主要分布在中央杏仁核，尤其是中央杏仁核的外侧部更为密集。杏仁内侧核和腹侧核只有少量分布，杏仁外侧核则未见阳性纤维分布。杏仁核内的免疫阳性物质主要为免疫阳性纤维，在中央杏仁核外侧部的尾侧亦可见较多阳性细胞胞体存在。中央杏仁核外侧部内的CGRP阳性胞体发出的纤维向内侧走行，通过中央杏仁核的内侧部，弯向背侧走行，进入尾壳核，和边缘区及尾壳核外侧缘内的CGRP阳性纤维相连。部分阳性纤维进入内囊，和中脑黑质外侧部及其背外侧区CGRP阳性胞体发出的纤维相连 (图3，4)。 尾壳核腹侧的CGRP阳性纤维不直接和中央杏仁核相连，两者之间有一条透明的带相隔。
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图3 纹状体背侧部切面
Fig. 3 Section of dorsal part of the striatum
CGRP-immunopositive fibers in the stria terminals ventrolaterally curve into the MrD. The diameter of CGRP-immunopositive fibers vary. Some of the fibers exhibit dot-and bouton-like shape. Arrow indicates CGRP-immunopositive fibers of the stria terminals run into the MrD
图4 杏仁核中的CGRP阳性纤维
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Fig. 4 CGRP-immunopositive fibers in the amygdaloid nucleus
The fibers were located mainly in central amygdaloid nucleus and connected with the CGRP fibers in the dorsal part and marginal division, a translucent band (arrow) separated central amygdaloid nucleus and caudate putamen
2.3 终纹床核内的CGRP免疫阳性物质分布及其与纹状体边缘区之间的纤维联系 在冠状切面上观察，在终纹床核内可见密集的CGRP阳性物质分布，主要为免疫阳性纤维，以卵圆核和梭形核中最为密集，其它亚核仅有少量阳性纤维分布。梭形核中还可见较多的CGRP免疫阳性细胞。由终纹床核发出的CGRP阳性纤维行向背外侧，进入终纹，在侧脑室和丘脑之间行向尾侧，在纹状体的尾侧部由终纹弯向腹外侧走行，进入边缘区的背侧部，在边缘区内行向腹侧 (图5)。
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图5 终纹床核中的CGRP阳性物质
Fig. 5 CGRP-immunopositive substances in the bed nucleus of the stria terminalis
CGRP-immunopositive fibers run dorsolaterally into the stria terminals
2.4 黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体以及与纹状体边缘区之间的纤维联系 在矢状切面上观察，可见在内侧膝状体的腹侧，黑质的背外侧部位，相当于黑质外侧部、脚周核和丘脑后板内核部位，以及内侧膝状体的腹侧部，有一群密集的CGRP阳性胞体。胞体的突起呈吻尾方向排列，发出纤维行向吻侧，经过未定带的背侧，进入内囊，部分纤维和腹侧的杏仁核相连，大部分纤维弯向背侧，向吻侧穿过内囊和苍白球，在苍白球和尾壳核之间即相当于边缘区的部位形成一条密集的CGRP阳性纤维带 (图6～8)。
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图6 中脑黑质外侧部及其背外侧区的CGRP阳性胞体
Fig. 6 CGRP-immunopositive cell bodies in the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part
CGRP-immunopositive fibers run rostrally and are located dorsally at the substantia nigra, and go into the internal capsule through the zona incerta
图7 图6的放大
Fig. 7 Magnification of Fig. 6
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CGRP-immunopositive cell bodies in the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part give out fibers rostrally
图8 来自黑质外侧核及其背外侧区的CGRP阳性纤维穿过内囊和边缘区相连
Fig. 8 CGRP-immunopositive fibers from the lateral part of substantia nigra and its dorsolateral part penetrate the internal capsule and connect with the MrD
Some fibers connected with the fibers from the ventral amygdaloid nucleus (arrow)
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3 讨论
3.1 CGRP在纹状体内的分布 CGRP在中枢神经系统中的分布比较广泛， 纹状体中也有较多分布。有人用免疫组化方法研究了CGRP在中枢神经的分布，观察到尾壳核及中央杏仁核中有浓密的分布，并用放免方法测定到CGRP在中央杏仁核和尾壳核的水平最高，和免疫组化的结果一致。Okayama等[3]观察到纹状体中的CGRP纤维集中分布在尾壳核的腹侧缘及尾侧部，其它部分仅有少量分布。并用电镜证明所有免疫阳性扣结均含有小的清亮小泡，和树突棘和树突干形成非对称性突触。推测CGRP纤维和纹状体内中等大小的有棘投射神经元形成突触。但他们均未提及CGRP在纹状体边缘区中的分布情况。纹状体边缘区是舒斯云等[4]1987年在大鼠纹状体中发现的一个新亚区。为位于纹状体尾侧部尾壳核和苍白球之间的一个盘状结构。主要由密集的梭形细胞构成，边缘区中含有密集的SP、ENK、CCK、NT、NPY 等神经肽及5-HT神经纤维及终末[5]。本研究观察到纹状体中CGRP免疫阳性纤维出现在纹状体的尾侧部，集中分布在尾壳核和苍白球之间，即相当于纹状体边缘区的部位，纤维呈背腹方向走行，呈带状分布。在纹状体的最尾侧部，尾壳核的外侧也出现浓密的阳性纤维分布，腹侧部尤其密集，其走行与尾壳核的外缘基本一致；在边缘区与尾壳核外侧的CGRP阳性纤维带之间可见阳性纤维横向走行联系。本结果基本上和Okayama等[3]观察的结果吻合，即纹状体中的CGRP阳性纤维主要分布在尾壳核的腹侧缘及尾侧部，但他们没有描述CGRP纤维在边缘区及尾壳核外侧缘的分布情况，本文则首次报道了纹状体边缘区内CGRP免疫阳性纤维的分布特征。
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3.2 纹状体CGRP阳性纤维与边缘系统间的联系 我们曾用原癌基因c-Fos表达的方法证明纹状体边缘区和海马、杏仁核、终纹床核等边缘系统结构间有功能联系。 Parent等 [8]根据纤维联系及功能不同提出纹状体可分为三种解剖功能亚区，即分为运动、联合和边缘纹状区。其中，边缘纹状区包括伏核和壳及尾状核的大部分腹侧部。大脑皮层的运动、联合和边缘区以分离的方式分别投射到三个独特的纹状亚区。其中的边缘纹状区接受边缘系统的结构如海马、杏仁核以及推测可能有促进边缘系统自律功能的前皮层区即Orbitfrontal, Infralimbic和Prelimbic皮层的广泛传入。一些研究已经证明纹状体和中央杏仁核之间有纤维联系。如Shinonaga等[9]研究了猫中央杏仁核到基底节的直接投射，发现中央杏仁核外侧部的纤维投射到苍白球尾侧部的内侧及黑质外侧部。McDonald [8]研究了杏仁核到尾壳核的局部定位投射，认为中央杏仁核和终纹床核的外侧部为纹状体样结构。 但纹状体边缘区和边缘系统的一些结构如杏仁核、海马、终纹床核等核团之间有无直接纤维联系，尚未见报道。虽然中央杏仁核和终纹床核之间有纤维联系[9]，终纹床核可通过中央杏仁核影响纹状体的功能，但终纹床核是否和纹状体尤其是边缘区有纤维直接联系，也未见报道。本文首次报告了纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维与中央杏仁核及终纹床核之间存在着直接纤维联系，即纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维向背侧通过终纹接收来自终纹床核 (主要为梭形核)的投射；向腹侧主要和中央杏仁核中的CGRP纤维相连，即中央杏仁核外侧部中的CGRP阳性胞体发出纤维向内侧走行，经过中央杏仁核内侧部，弯向背侧走行，和边缘区及尾壳核外侧缘的CGRP阳性纤维相连。
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纹状体边缘区中的CGRP阳性纤维除了和中央杏仁核及终纹床核相联系外，还接收来自中脑黑质外侧部及其背外侧区中CGRP阳性胞体的投射，包括黑质外侧部、脚周核、丘脑后板内核及内侧膝状体腹侧部的CGRP阳性胞体。此结果和Kubota等[5]报道的结果一致，但他们并未提及和纹状体边缘区相联系。我们曾观察到纹状体边缘区接收来自黑质外侧部及其背外侧区SP、NT、CCK、L-ENK及TH阳性胞体的传人投射[10], 本研究又证明了黑质外侧部及其背外侧区中的CGRP阳性胞体投射到纹状体边缘区。一般认为杏仁核和终纹床核是边缘系统的皮质下结构，中脑的被盖区是边缘中脑的组成部分。因此本研究的结果显示纹状体边缘区和边缘系统的某些结构之间存在着直接的纤维联系。从纤维联系上进一步证明纹状体边缘区是边缘系统的一个组成部分 (图9)。
图9 纹状体边缘区内CGRP阳性纤维联系的模式图
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Fig. 9 Schematic diagram of the connection of CGRP-immunopositive fibers in the MrD of the striatum
CGRP-immunopositive fibers in the MrD dorsally project into the stria terminals and connect with the bed nucleus of the stria terminals. The MrD receives the afferent CGRP-positive fibers ventrally from CGRP-immuno-positive cell bodies in the central amygdaloid nucleus and caudately from the cell bodies in the lateral part of the substantia nigra and its dorsolateral part.
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我们曾用Y迷宫试验证明纹状体边缘区的功能和学习记忆有关[10]。并用电镜证明边缘区和脑内与学习记忆功能有关的Meynert基底核有突触联系。Kovacs等[12]向侧脑室内注射CGRP能显著降低大鼠被动逃避行为学习的潜伏期，认为CGRP可能是一种与学习有关记忆过程的调节物，并推测和多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺及阿片肽等递质有关。本研究亦观察到边缘区中存在着密集的CGRP阳性纤维并和边缘系统相联系。
*国家自然科学基金(39770550)和广东省科学基金(950554)资助
作者简介：李耀宇，男，1963年出生；1985年毕业于第四军医大学；博士，主治医师；电话：85143636
舒斯云(项目负责人)
参考文献
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(收稿日期：1999-03-18), http://www.100md.com