骨良恶性肿瘤cyclin D1和cdk4的表达及其意义
作者：易伟宏 王大平
单位：(广东省深圳市红十字会医院 深圳 518000)
关键词：细胞周期蛋白类；骨肿瘤；免疫组织化学；诊断
湖南医学990302 摘 要
【目的】研究骨软骨瘤、骨软骨肉瘤和骨肉瘤组织中cyclin D1和cdk4表达及其意义。【方法】采用石蜡包埋切片ABC免疫组化法。【结果】骨软骨瘤cyclin D1(3/16)和cdk4(4/16)阳性率明显低于骨软骨肉瘤(9/13，9/13)，和骨肉瘤(5/6，5/6)，差异有显著性；cyclin D1和cdk4表达与骨软骨瘤、骨肉瘤和骨肉瘤病理类型有一定关系，但与其发生部位无明显关系。【结论】cyclin D1和cdk4表达特征与骨恶性肿瘤发生发展有较密切关系；检测骨软骨瘤cyclinD4和cdk4表达可能在预防和早期发现骨恶性肿瘤方面有临床意义。
, 百拇医药
Expression of Cyclin D1,cdk4 and Their Significance
in the Benign and Malignant Lesions of Bone
YI Weihong， WANG Daping①
Department of Orthopedics,Nanshan Peoples′s Hospital,Shenzhen,Guangdong Province,518052
(①Department of Orthopedics,Shenzhen Red Cross Hospital,Shenzhen,518008)
Abstract
, 百拇医药
【Objective】To study the expressions of cyclin D1 and cdk4 as well as their significances in osteochondroma,osteochondrosarcoma and osteosarcoma.【Methods】The immunohistochemical method of avidin-biotin complex(ABC) in paraffin-embedded sections was used.【Results】The positive rates of cyclin D1 and cdk4 in osteochondroma (3/16,4/16) were significantly lower than those in osteochondrosarcoma(9/13,9/13) and osteosarcoma(5/6,6/6).In some degree,the expressions of cyclin D1 and cdk4 were related to the pathological types of osteochondroma,osteochondrosarcoma and osteosarcoma,but were not related to their sites of occurrence.【Conclusions】A closer relationship exists between the characteristics of expression in cyclin D1,cdk4 and pathogenesis/progress of malignant bone tumors.Detection of cyclin D1 ,cdk4 expressions in osteochondroma may have clinical significance to the prevention and early-stage finding of malignant bone lesions.
, http://www.100md.com
Key wors cyclins; bone neoplasms; immunohistochemistry; diagnosis
人实体肿瘤常是多种基因共同作用，影响细胞增生和分化的结果。细胞周期素D1(Cyclin D1)癌基因能刺激细胞周期素依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4，cdk4)介导的成视网膜母细胞瘤易感基因(retioblastoma，Rb)产物的磷酸化，使Rb对细胞生长的抑制效应失活，从而促进细胞增殖和一些肿瘤的失控生长[1，2]。近年研究发现cyclin D1和cdk4表达与一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有关[3～5]。本文应用ABC免疫组化法研究骨软骨瘤、骨软骨肉瘤和骨肉瘤组织中cyclin D1和cdk4表达及意义。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 标本及临床病理资料 收集本院12年来骨肿瘤手术切除标本35例，常规制作石蜡切片，厚4 μm。①骨软骨瘤：16例，男性11例，女性5例，平均年龄35.8(14～60)岁，其中多发性骨软骨瘤2例，单发性骨软骨瘤14例；肿块发生部位包括左右胫骨5例，左右股骨远端4例，左右腓骨2例及肱骨上端、骶尾部、右肘关节、左尺骨和左髋骨各1例(多发性骨软骨瘤以取材部位为准)。②软骨肉瘤：13例，男性6例，女性7例，平均年龄32.3(10～62)岁；包括高分化6例，中分化4例，低分化1例及粘液性2例；肿块发生在左右肱骨上段2例，左肩胛骨2例，髋骨2例，左右股骨上段2例，左右胫骨2例，胸椎、左耻骨和左踝骨各1例；其中发生骨外转移或侵犯骨周边组织9例。③骨肉瘤：6例，男性1例，女性5例，平均年龄25(20～28)岁；包括纤维母细胞型骨肉瘤和骨母细胞型骨肉瘤各3例；肿块发生在右股骨下端3例，右髋骨1例及左右上肢各1例；均发生骨外转移或侵犯骨周边组织。
1.2 试剂与方法 鼠抗人cyclin D1单克隆抗体(1∶40)、兔抗人cdk4多克隆抗体(1∶100)、生物素标记羊抗兔lgG和生物素标记羊抗鼠lgG(均1∶300)及ABC试剂(1∶500)均购自sigma公司，DAB-HCl为瑞士进口分装。cyclin D1和cdk4染色方法均为常规ABC免疫组化法，胞浆和(或)胞核内含淡棕黄色至深棕黄色颗粒者为阳性细胞。切片中阳性细胞率≥10%为阳性病例，<10%则为阴性病例。以0.01M PBS液(pH 7.4)分别替代一抗、二抗、和ABC试剂作为每次染色的阴性或替代对照。统计学处理为直接概率法。
, 百拇医药
2 结果
2.1 cyclin D1和cdk4表达特征 cyclin D1和cdk4免疫反应物质多定位于胞核，部分病例偶见定位于胞浆。阳性细胞在组织切片中的分布呈明显异质性，同一切片不同区域阳性细胞率不同。cyclin D1和cdk4在骨软骨瘤、软骨肉瘤和骨肉瘤中的分布见表1。骨软骨瘤cyclin D1和cdk4阳性率明显低于骨软骨肉瘤和骨肉瘤，其差异均有显著性(P<0.05)。
表1 cyclin D1和cdk4在良恶性骨肿瘤中的表达(例) 病理类型
n
cyclin D1
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cdk4
阳性
阴性
阳性
阴性
骨软骨瘤
16
3
13
4
12
软骨肉瘤
13
, 百拇医药
9*
4
9*
4
骨肉瘤
6
5*
1
6*
0
与骨软骨瘤阳性病例比较：P<0.01
2.2 cyclin D1和cdk4表达与骨肿瘤临床病理特征的关系 见表2。在3例cyclin D1阳性骨软骨瘤中2例为多发性骨软骨瘤，1例为单发性骨软骨瘤；肿瘤发生部位为股骨远端1例和胫骨2例。4例cdk4阳性骨软骨瘤中多发性和单发性骨软骨瘤各2例；发生部位为胫骨2例，股骨远端1例和左尺骨1例。5例cyclin D1阳性中3例为骨母细胞型骨肉瘤和2例为纤维母细胞型骨肉瘤；此5例cdk4均阳性；6例骨肉瘤中仅1例右上肢纤维细胞型骨肉瘤为cyclin D1阴性。
, 百拇医药
表2 cyclin D1和cdk4表达与软骨肉瘤临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
阳性病例数
cyclin D1
cdk4
病理类型
高分化
6
3
2
中分化
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4
4
4
低分化
1
1
1
粘液性
2
1
2
发生部位
肱骨上段
2
, 百拇医药
1
2
肩胛骨
2
2
1
髋 骨
2
2
2
股 骨
2
1
1
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胫 骨
2
2
2
其 他
3
1
1
2.3 cyclin D1和cdk4在软骨肉瘤和骨肉瘤表达中的相互关系 19例软骨肉瘤和骨肉瘤中cyclin D1，cdk4同时阳性14例；cyclin D1阳性，cdk4阴性10例；cyclin D1阴性，cdk4阳性1例；cyclin D1，cdk4同时阴性4例。cyclin D1表达与cdk4表达呈密切正相关(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
cyclin D1为重要的细胞周期蛋白的调控基因，其表达产物能刺激cdk4介导的Rb产物磷酸化，cyclin D1过度表达将使cdk4对Rb调节失常，导致细胞失控性生长[1，2]。因Rb蛋白能与促进细胞分裂的某些转录因子结合而抑制转录因子活性，Rb蛋白若被磷酸化，则不能与转录因子结合，此时转录因子可重现活性[1，2，6]。人类恶性肿瘤中，常常出现cyclin D1细胞周期调控蛋白的异常表达，通过cdk4的作用导致肿瘤的发生发展[3～5，7]。恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多基因变异所致的病变过程，人们从原来注重分析癌细胞本身特性开始更注重对正常细胞演变为癌细胞过程的研究。近年研发现cyclin D1和cdk4在一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后方面有重要作用。在许多恶性肿瘤中cyclin D1表达是一种常见的分子异常，且可能是一早期分子事件[3～5]。国内尚未见良恶性骨肿瘤组织cyclin D1和cdk4表达研究的文献报道。本组资料显示：骨软骨瘤cyclin D1和cdk4阳性病例明显地低于软骨肉瘤和骨肉瘤(P<0.05)；cyclin D1和cdk4表达似乎与骨良恶性肿瘤发生部位无明显关系。本文结果提示cyclin D1和cdk4参与了恶性骨肿瘤的发生、发展过程，而且与恶性骨肿瘤生物学行为和预后有较密切关系，但尚需进一步积累病例数量进行更深入研究。检测骨软骨瘤cyclin D1和cdk4表达对预防和早期发现恶性骨肿瘤可能有较重要的实用意义。另外，本文结果发现cyclin D1和cdk4在骨软骨肉瘤和骨肉瘤表达中两者呈密切正相关，与国外文献报道一致[3，5，7，8]，说明骨肿瘤cyclin D1细胞周期调控作用是通过cdk4介导的。 参考文献
, http://www.100md.com
1 Serrano M,Hannom GJ,Beach DA.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D1/cdk4.Nature,1993,336:704
2 Ewen ME,Sluss HK,Sherr CJ,et al.Functional interaction of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins.Cell,1993,73:487
3 Kamb A,Gruis NA,Weaver FT,et al.A cell cycle regulator potentially in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436
, 百拇医药
4 Ailou O,Douglas J.Mutations and altered expression of p16 INK4 in human cancer.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:11045
5 Gilett C,Fantl V,Bartel J,et al.Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining.Cancer Res,1994,54:1812
6 Sherr CJ.Mammalian G1 cycline.Cell,1994,73:1059
7 Lukas j,Parry D,Aagaard L,et al.Retinoblastoma-protein dependent cell-cycle inhibition by tumor suppressor p16.Nature,1995,375:503
8 Mori T,Miure k,Aoki T,et al.Frequent somatic mutation of the MTS1/cdk4 Ⅰ (multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitior) gene in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,1994,54:3396
(19990430 收稿), http://www.100md.com
单位：(广东省深圳市红十字会医院 深圳 518000)
关键词：细胞周期蛋白类；骨肿瘤；免疫组织化学；诊断
湖南医学990302 摘 要
【目的】研究骨软骨瘤、骨软骨肉瘤和骨肉瘤组织中cyclin D1和cdk4表达及其意义。【方法】采用石蜡包埋切片ABC免疫组化法。【结果】骨软骨瘤cyclin D1(3/16)和cdk4(4/16)阳性率明显低于骨软骨肉瘤(9/13，9/13)，和骨肉瘤(5/6，5/6)，差异有显著性；cyclin D1和cdk4表达与骨软骨瘤、骨肉瘤和骨肉瘤病理类型有一定关系，但与其发生部位无明显关系。【结论】cyclin D1和cdk4表达特征与骨恶性肿瘤发生发展有较密切关系；检测骨软骨瘤cyclinD4和cdk4表达可能在预防和早期发现骨恶性肿瘤方面有临床意义。
, 百拇医药
Expression of Cyclin D1,cdk4 and Their Significance
in the Benign and Malignant Lesions of Bone
YI Weihong， WANG Daping①
Department of Orthopedics,Nanshan Peoples′s Hospital,Shenzhen,Guangdong Province,518052
(①Department of Orthopedics,Shenzhen Red Cross Hospital,Shenzhen,518008)
Abstract
, 百拇医药
【Objective】To study the expressions of cyclin D1 and cdk4 as well as their significances in osteochondroma,osteochondrosarcoma and osteosarcoma.【Methods】The immunohistochemical method of avidin-biotin complex(ABC) in paraffin-embedded sections was used.【Results】The positive rates of cyclin D1 and cdk4 in osteochondroma (3/16,4/16) were significantly lower than those in osteochondrosarcoma(9/13,9/13) and osteosarcoma(5/6,6/6).In some degree,the expressions of cyclin D1 and cdk4 were related to the pathological types of osteochondroma,osteochondrosarcoma and osteosarcoma,but were not related to their sites of occurrence.【Conclusions】A closer relationship exists between the characteristics of expression in cyclin D1,cdk4 and pathogenesis/progress of malignant bone tumors.Detection of cyclin D1 ,cdk4 expressions in osteochondroma may have clinical significance to the prevention and early-stage finding of malignant bone lesions.
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Key wors cyclins; bone neoplasms; immunohistochemistry; diagnosis
人实体肿瘤常是多种基因共同作用，影响细胞增生和分化的结果。细胞周期素D1(Cyclin D1)癌基因能刺激细胞周期素依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4，cdk4)介导的成视网膜母细胞瘤易感基因(retioblastoma，Rb)产物的磷酸化，使Rb对细胞生长的抑制效应失活，从而促进细胞增殖和一些肿瘤的失控生长[1，2]。近年研究发现cyclin D1和cdk4表达与一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有关[3～5]。本文应用ABC免疫组化法研究骨软骨瘤、骨软骨肉瘤和骨肉瘤组织中cyclin D1和cdk4表达及意义。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 标本及临床病理资料 收集本院12年来骨肿瘤手术切除标本35例，常规制作石蜡切片，厚4 μm。①骨软骨瘤：16例，男性11例，女性5例，平均年龄35.8(14～60)岁，其中多发性骨软骨瘤2例，单发性骨软骨瘤14例；肿块发生部位包括左右胫骨5例，左右股骨远端4例，左右腓骨2例及肱骨上端、骶尾部、右肘关节、左尺骨和左髋骨各1例(多发性骨软骨瘤以取材部位为准)。②软骨肉瘤：13例，男性6例，女性7例，平均年龄32.3(10～62)岁；包括高分化6例，中分化4例，低分化1例及粘液性2例；肿块发生在左右肱骨上段2例，左肩胛骨2例，髋骨2例，左右股骨上段2例，左右胫骨2例，胸椎、左耻骨和左踝骨各1例；其中发生骨外转移或侵犯骨周边组织9例。③骨肉瘤：6例，男性1例，女性5例，平均年龄25(20～28)岁；包括纤维母细胞型骨肉瘤和骨母细胞型骨肉瘤各3例；肿块发生在右股骨下端3例，右髋骨1例及左右上肢各1例；均发生骨外转移或侵犯骨周边组织。
1.2 试剂与方法 鼠抗人cyclin D1单克隆抗体(1∶40)、兔抗人cdk4多克隆抗体(1∶100)、生物素标记羊抗兔lgG和生物素标记羊抗鼠lgG(均1∶300)及ABC试剂(1∶500)均购自sigma公司，DAB-HCl为瑞士进口分装。cyclin D1和cdk4染色方法均为常规ABC免疫组化法，胞浆和(或)胞核内含淡棕黄色至深棕黄色颗粒者为阳性细胞。切片中阳性细胞率≥10%为阳性病例，<10%则为阴性病例。以0.01M PBS液(pH 7.4)分别替代一抗、二抗、和ABC试剂作为每次染色的阴性或替代对照。统计学处理为直接概率法。
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2 结果
2.1 cyclin D1和cdk4表达特征 cyclin D1和cdk4免疫反应物质多定位于胞核，部分病例偶见定位于胞浆。阳性细胞在组织切片中的分布呈明显异质性，同一切片不同区域阳性细胞率不同。cyclin D1和cdk4在骨软骨瘤、软骨肉瘤和骨肉瘤中的分布见表1。骨软骨瘤cyclin D1和cdk4阳性率明显低于骨软骨肉瘤和骨肉瘤，其差异均有显著性(P<0.05)。
表1 cyclin D1和cdk4在良恶性骨肿瘤中的表达(例) 病理类型
n
cyclin D1
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cdk4
阳性
阴性
阳性
阴性
骨软骨瘤
16
3
13
4
12
软骨肉瘤
13
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9*
4
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4
骨肉瘤
6
5*
1
6*
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与骨软骨瘤阳性病例比较：P<0.01
2.2 cyclin D1和cdk4表达与骨肿瘤临床病理特征的关系 见表2。在3例cyclin D1阳性骨软骨瘤中2例为多发性骨软骨瘤，1例为单发性骨软骨瘤；肿瘤发生部位为股骨远端1例和胫骨2例。4例cdk4阳性骨软骨瘤中多发性和单发性骨软骨瘤各2例；发生部位为胫骨2例，股骨远端1例和左尺骨1例。5例cyclin D1阳性中3例为骨母细胞型骨肉瘤和2例为纤维母细胞型骨肉瘤；此5例cdk4均阳性；6例骨肉瘤中仅1例右上肢纤维细胞型骨肉瘤为cyclin D1阴性。
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表2 cyclin D1和cdk4表达与软骨肉瘤临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
阳性病例数
cyclin D1
cdk4
病理类型
高分化
6
3
2
中分化
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4
4
4
低分化
1
1
1
粘液性
2
1
2
发生部位
肱骨上段
2
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1
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肩胛骨
2
2
1
髋 骨
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2
2
股 骨
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1
1
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胫 骨
2
2
2
其 他
3
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1
2.3 cyclin D1和cdk4在软骨肉瘤和骨肉瘤表达中的相互关系 19例软骨肉瘤和骨肉瘤中cyclin D1，cdk4同时阳性14例；cyclin D1阳性，cdk4阴性10例；cyclin D1阴性，cdk4阳性1例；cyclin D1，cdk4同时阴性4例。cyclin D1表达与cdk4表达呈密切正相关(P<0.01)。
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3 讨论
cyclin D1为重要的细胞周期蛋白的调控基因，其表达产物能刺激cdk4介导的Rb产物磷酸化，cyclin D1过度表达将使cdk4对Rb调节失常，导致细胞失控性生长[1，2]。因Rb蛋白能与促进细胞分裂的某些转录因子结合而抑制转录因子活性，Rb蛋白若被磷酸化，则不能与转录因子结合，此时转录因子可重现活性[1，2，6]。人类恶性肿瘤中，常常出现cyclin D1细胞周期调控蛋白的异常表达，通过cdk4的作用导致肿瘤的发生发展[3～5，7]。恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多基因变异所致的病变过程，人们从原来注重分析癌细胞本身特性开始更注重对正常细胞演变为癌细胞过程的研究。近年研发现cyclin D1和cdk4在一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后方面有重要作用。在许多恶性肿瘤中cyclin D1表达是一种常见的分子异常，且可能是一早期分子事件[3～5]。国内尚未见良恶性骨肿瘤组织cyclin D1和cdk4表达研究的文献报道。本组资料显示：骨软骨瘤cyclin D1和cdk4阳性病例明显地低于软骨肉瘤和骨肉瘤(P<0.05)；cyclin D1和cdk4表达似乎与骨良恶性肿瘤发生部位无明显关系。本文结果提示cyclin D1和cdk4参与了恶性骨肿瘤的发生、发展过程，而且与恶性骨肿瘤生物学行为和预后有较密切关系，但尚需进一步积累病例数量进行更深入研究。检测骨软骨瘤cyclin D1和cdk4表达对预防和早期发现恶性骨肿瘤可能有较重要的实用意义。另外，本文结果发现cyclin D1和cdk4在骨软骨肉瘤和骨肉瘤表达中两者呈密切正相关，与国外文献报道一致[3，5，7，8]，说明骨肿瘤cyclin D1细胞周期调控作用是通过cdk4介导的。 参考文献
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1 Serrano M,Hannom GJ,Beach DA.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D1/cdk4.Nature,1993,336:704
2 Ewen ME,Sluss HK,Sherr CJ,et al.Functional interaction of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins.Cell,1993,73:487
3 Kamb A,Gruis NA,Weaver FT,et al.A cell cycle regulator potentially in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436
, 百拇医药
4 Ailou O,Douglas J.Mutations and altered expression of p16 INK4 in human cancer.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:11045
5 Gilett C,Fantl V,Bartel J,et al.Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining.Cancer Res,1994,54:1812
6 Sherr CJ.Mammalian G1 cycline.Cell,1994,73:1059
7 Lukas j,Parry D,Aagaard L,et al.Retinoblastoma-protein dependent cell-cycle inhibition by tumor suppressor p16.Nature,1995,375:503
8 Mori T,Miure k,Aoki T,et al.Frequent somatic mutation of the MTS1/cdk4 Ⅰ (multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitior) gene in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,1994,54:3396
(19990430 收稿), http://www.100md.com