自身免疫性溶血性贫血病人TCRVβ亚家族T细胞表达特点
作者：陈少华 李扬秋 卢育洪 罗更新 张涛 杨力建 廖继东
单位：广州暨南大学血液病研究室*
关键词：TCRVβ基因；T细胞亚家族；贫血，溶血性/自身免疫 Evan′s综合证 RT-PCR
临床血液学杂志990309 摘要 目的：了解自身免疫性溶血性贫血病TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况。方法：采用RT-PCR扩增1例AIHA和1例Evan′s综合征病人的外周血单个核细胞的TCR Vβ 24个亚家族基因，9例正常人作为对照。结果：正常人表达除Vβ 20以外的其它亚家族T细胞，而病人外周血仅表达3～6个Vβ亚家族T细胞，为Vβ 2、Vβ 3、Vβ 5、Vβ 13、Vβ 16和Vβ 24。结论：2例病人外周血仅选择性表达部分β亚家族T细胞，这可能是病人细胞免疫功能异常的特征。
近年国外报道通过分析T细胞受体Vβ 24个亚家族基因而分析肿瘤或自身免疫性疾病病人的细胞免疫功能状态，并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的资料〔1，2〕。本文利用RT-PCR方法分析2例免疫性溶贫病人Vβ亚家族T细胞的表达情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本 经溶血性贫血有关检查等确诊的AIHA和Evan′s综合征各1例，正常人9例作为对照。收集发病期病人外周血并分离单个核细胞(用淋巴细胞分离液按常规方法进行)。
1.2 RNA提取及cDNA合成 应用RNAzolTMB试剂盒(BIOTECX公司产品)按常规方法(异硫氰酸胍法)提取RNA。然后应用随机引物(random hexamer)和反转录酶(superscript Ⅱ)试剂盒(GIBCOBRL公司产品)合成cDNA第1链。
1.3 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ 24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物(表1)〔1〕，引物均由德国柏林TIB生物公司合成。每一标本分别以Vβ 1-24/Cβ 24对引物进行24次PCR检测。PCR操作按Saiki等所描述方法进行〔1，3，4〕。总反应体积为25 μl，其中含1 μl cDNA，0.1 mM dNTP(包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP)，引物浓度均为0.5 μM(任一Vβ引物和Cβ引物)，1.25 U聚合酶，反应在PCR缓冲液〔1 mM Tris-HCl,pH 8.3，5 mM KCl,1.5 mM MgCl2及0.001%明胶〕(所有试剂均为Perkin Elmer公司产品)中进行。共进行40个循环，变性温度：94℃，1 min(首次3 min)，退火温度：60℃，1 min，延伸温度：72℃，1 min(末次10 min)，结束后保存于4℃中。各反应均以相应的细胞株的cDNA作阳性对照，而以水(不含cDNA)作阴性对照。PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果。
, 百拇医药
2 结果
RT-PCR扩增结果：正常人外周血表达除Vβ 20外的其它Vβ亚家族T细胞；2例病人仅选择性表达部分Vβ亚家族的T细胞。AIHA表达6个Vβ亚家族，而Evan′s综合征仅表达3个Vβ亚家族T细胞(表2，附图)。
表1 用于RT-PCR的各TCRβ引物的核苷酸序列 引物名称
引物的核苷酸序列(5′→3′)
Vβ1
CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC
Vβ2
GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA
Vβ3
, 百拇医药
CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC
Vβ4
TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA
Vβ5
AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC
Vβ6
TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG
Vβ7
CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC
Vβ8
CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC
, 百拇医药
Vβ9
TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC
Vβ10
CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC
Vβ11
TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA
Vβ12
TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC
Vβ13
CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA
Vβ14
, 百拇医药
GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC
Vβ15
CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG
Vβ16
GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG
Vβ17
CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC
Vβ18
TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA
Vβ19
, http://www.100md.com TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA
Vβ20
TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC
Vβ21
TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT
Vβ22
AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA
Vβ23
GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA
Vβ24
CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC
, 百拇医药
Cβ
CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG
表2 RT-PCR扩增24个TCR Vβ亚家族基因的结果 引物
正常
AIHA
Evan′s
引物
正常
AIHA
Evan′s
Vβ1/Cβ
+1
, 百拇医药
Vβ13/Cβ
+
+
+
Vβ2/Cβ
+
+
Vβ14/Cβ
+
Vβ3/Cβ
+
+
+
, http://www.100md.com Vβ15/Cβ
+
Vβ4/Cβ
+
Vβ16/Cβ
+
+
+
Vβ5/Cβ
+
+
Vβ17/Cβ
+
, 百拇医药 Vβ6/Cβ
+
Vβ18/Cβ
+
Vβ7/Cβ
+
Vβ19/Cβ
+
Vβ8/Cβ
+
Vβ20/Cβ
Vβ9/Cβ
+
, http://www.100md.com
Vβ21/Cβ
+
Vβ10/Cβ
+
Vβ22/Cβ
+
Vβ11/Cβ
+
Vβ23/Cβ
+
Vβ12/Cβ
+
Vβ24/Cβ
, 百拇医药
+
+
注：1：PCR产物经琼脂糖电泳发现阳性带
附图 TCR Vβ2的RT-PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果
1：DNA分子量梯度标记物，2-4：正常人标本，5：病人标本。6：阴性对照。可见各标本经RT-PCR扩增均达得到388 bp左右的阳性带。
3 讨论
在T细胞发育过程中，T细胞受体(TCR)的V区(可变区)、D区(多样区)和J区(结合区)基因发生重排，形成有功能的TCR。TCR包括有α、β、和δ四种，外周血的T细胞主要为表达α和β的T细胞。研究表明，TCR V区的胚系结构中具有几十种片段，已经报道的TCR α的V区有20个亚家族，而TCR β有24个亚家族，故可以通过检测外周血中T细胞的TCR α或TCR β的各V区来了解各T细胞亚家族的表达情况。本研究利用RT-PCR检测TCR Vβ 24个亚家族的基因片段而了解正常人和2例免疫性溶血性贫血病人的TCRVβT细胞的表达特点。在正常情况下，机体未受任何抗原刺激，正常人外周血T细胞的TCR β重排应是随机的，即呈多家族性，各家族的T细胞均执行各自的职能。本研究结果显示9例正常人几乎表达所有的TCR Vβ亚家族T细胞，基本符合这一特点。而在特异性抗原刺激下，机体TCR的重排出现了选择性，产生特异地针对性的亚家族T细胞，故此已有报道一些实体瘤、白血病和免疫性疾病病人的外周血T细胞出现选择性表达TCR Vβ T细胞的情况。提示肿瘤细胞相关抗原或免疫性疾病的一些有关抗原对机体的刺激作用而引起机体相应的细胞免疫反应。AIHA和Evan′s综合征均为机体产生自身抗体而引起红细胞的破坏的疾病，是一种体液免疫异常的表现，对其细胞免疫功能状态的了解较少。本研究检测了2例病人的TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况，两者均表达Vβ3，Vβ13和Vβ16亚家族的T细胞，并发现其T细胞亚家族分布的不均匀性，提示病人的细胞免疫也可能出现异常情况。另外，AIHA病人还表达Vβ2，Vβ5和Vβ24，这有可能是AIHA和Evan′s之间存在的区别，但由于病例少，有待继续研究。
*邮政编码：广州，510632
卢育洪 罗更新 张涛 广州暨南大学第一附属医院血液科
1998-08-10 收稿, http://www.100md.com
单位：广州暨南大学血液病研究室*
关键词：TCRVβ基因；T细胞亚家族；贫血，溶血性/自身免疫 Evan′s综合证 RT-PCR
临床血液学杂志990309 摘要 目的：了解自身免疫性溶血性贫血病TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况。方法：采用RT-PCR扩增1例AIHA和1例Evan′s综合征病人的外周血单个核细胞的TCR Vβ 24个亚家族基因，9例正常人作为对照。结果：正常人表达除Vβ 20以外的其它亚家族T细胞，而病人外周血仅表达3～6个Vβ亚家族T细胞，为Vβ 2、Vβ 3、Vβ 5、Vβ 13、Vβ 16和Vβ 24。结论：2例病人外周血仅选择性表达部分β亚家族T细胞，这可能是病人细胞免疫功能异常的特征。
近年国外报道通过分析T细胞受体Vβ 24个亚家族基因而分析肿瘤或自身免疫性疾病病人的细胞免疫功能状态，并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的资料〔1，2〕。本文利用RT-PCR方法分析2例免疫性溶贫病人Vβ亚家族T细胞的表达情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本 经溶血性贫血有关检查等确诊的AIHA和Evan′s综合征各1例，正常人9例作为对照。收集发病期病人外周血并分离单个核细胞(用淋巴细胞分离液按常规方法进行)。
1.2 RNA提取及cDNA合成 应用RNAzolTMB试剂盒(BIOTECX公司产品)按常规方法(异硫氰酸胍法)提取RNA。然后应用随机引物(random hexamer)和反转录酶(superscript Ⅱ)试剂盒(GIBCOBRL公司产品)合成cDNA第1链。
1.3 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ 24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物(表1)〔1〕，引物均由德国柏林TIB生物公司合成。每一标本分别以Vβ 1-24/Cβ 24对引物进行24次PCR检测。PCR操作按Saiki等所描述方法进行〔1，3，4〕。总反应体积为25 μl，其中含1 μl cDNA，0.1 mM dNTP(包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP)，引物浓度均为0.5 μM(任一Vβ引物和Cβ引物)，1.25 U聚合酶，反应在PCR缓冲液〔1 mM Tris-HCl,pH 8.3，5 mM KCl,1.5 mM MgCl2及0.001%明胶〕(所有试剂均为Perkin Elmer公司产品)中进行。共进行40个循环，变性温度：94℃，1 min(首次3 min)，退火温度：60℃，1 min，延伸温度：72℃，1 min(末次10 min)，结束后保存于4℃中。各反应均以相应的细胞株的cDNA作阳性对照，而以水(不含cDNA)作阴性对照。PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果。
, 百拇医药
2 结果
RT-PCR扩增结果：正常人外周血表达除Vβ 20外的其它Vβ亚家族T细胞；2例病人仅选择性表达部分Vβ亚家族的T细胞。AIHA表达6个Vβ亚家族，而Evan′s综合征仅表达3个Vβ亚家族T细胞(表2，附图)。
表1 用于RT-PCR的各TCRβ引物的核苷酸序列 引物名称
引物的核苷酸序列(5′→3′)
Vβ1
CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC
Vβ2
GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA
Vβ3
, 百拇医药
CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC
Vβ4
TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA
Vβ5
AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC
Vβ6
TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG
Vβ7
CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC
Vβ8
CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC
, 百拇医药
Vβ9
TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC
Vβ10
CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC
Vβ11
TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA
Vβ12
TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC
Vβ13
CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA
Vβ14
, 百拇医药
GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC
Vβ15
CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG
Vβ16
GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG
Vβ17
CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC
Vβ18
TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA
Vβ19
, http://www.100md.com TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA
Vβ20
TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC
Vβ21
TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT
Vβ22
AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA
Vβ23
GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA
Vβ24
CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC
, 百拇医药
Cβ
CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG
表2 RT-PCR扩增24个TCR Vβ亚家族基因的结果 引物
正常
AIHA
Evan′s
引物
正常
AIHA
Evan′s
Vβ1/Cβ
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Vβ22/Cβ
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Vβ11/Cβ
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Vβ23/Cβ
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Vβ12/Cβ
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Vβ24/Cβ
, 百拇医药
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注：1：PCR产物经琼脂糖电泳发现阳性带
附图 TCR Vβ2的RT-PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果
1：DNA分子量梯度标记物，2-4：正常人标本，5：病人标本。6：阴性对照。可见各标本经RT-PCR扩增均达得到388 bp左右的阳性带。
3 讨论
在T细胞发育过程中，T细胞受体(TCR)的V区(可变区)、D区(多样区)和J区(结合区)基因发生重排，形成有功能的TCR。TCR包括有α、β、和δ四种，外周血的T细胞主要为表达α和β的T细胞。研究表明，TCR V区的胚系结构中具有几十种片段，已经报道的TCR α的V区有20个亚家族，而TCR β有24个亚家族，故可以通过检测外周血中T细胞的TCR α或TCR β的各V区来了解各T细胞亚家族的表达情况。本研究利用RT-PCR检测TCR Vβ 24个亚家族的基因片段而了解正常人和2例免疫性溶血性贫血病人的TCRVβT细胞的表达特点。在正常情况下，机体未受任何抗原刺激，正常人外周血T细胞的TCR β重排应是随机的，即呈多家族性，各家族的T细胞均执行各自的职能。本研究结果显示9例正常人几乎表达所有的TCR Vβ亚家族T细胞，基本符合这一特点。而在特异性抗原刺激下，机体TCR的重排出现了选择性，产生特异地针对性的亚家族T细胞，故此已有报道一些实体瘤、白血病和免疫性疾病病人的外周血T细胞出现选择性表达TCR Vβ T细胞的情况。提示肿瘤细胞相关抗原或免疫性疾病的一些有关抗原对机体的刺激作用而引起机体相应的细胞免疫反应。AIHA和Evan′s综合征均为机体产生自身抗体而引起红细胞的破坏的疾病，是一种体液免疫异常的表现，对其细胞免疫功能状态的了解较少。本研究检测了2例病人的TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况，两者均表达Vβ3，Vβ13和Vβ16亚家族的T细胞，并发现其T细胞亚家族分布的不均匀性，提示病人的细胞免疫也可能出现异常情况。另外，AIHA病人还表达Vβ2，Vβ5和Vβ24，这有可能是AIHA和Evan′s之间存在的区别，但由于病例少，有待继续研究。
*邮政编码：广州，510632
卢育洪 罗更新 张涛 广州暨南大学第一附属医院血液科
1998-08-10 收稿, http://www.100md.com