聚合酶链单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变及意义△
作者：聂建民 郭亮 蔡定邦 林焕馨 林华锦 刘凌
单位：广东省肇庆市第一人民医院*
关键词：葡萄糖6磷酸脱氢酶；聚合酶链单链构象多态；基因型
临床血液学杂志990308 摘要 目的：探讨儿童葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)基因突变类型。方法：采用聚合酶链单链构象多态技术(PCR-SSCP)检测了40例G-6PD缺乏症患儿，并采用DNA序列分析。结果：发现以1 388位点突变的15例，以1 311位点突变的6例，以1 024位点突变的未发现，另19例类型未定。本文发现以1 388位点突变最常见。结论：采用PCR-SSCP技术筛查可疑突变点，再结合氨基酸序列分析了解G-6PD缺乏症发生的分子基础，对于遗传性酶缺陷的基因研究及治疗提供理论依据具有重要意义。
葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)是参与磷酸戊糖旁路代谢，产生还原型辅酶Ⅱ的关键酶，该酶缺乏能导致新生儿溶血、蚕豆病、药物性溶血及慢性非球形细胞溶血等疾病。本文利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基因位点。从而探讨儿童G-6PD缺乏症患儿的基因突变位点及与临床表现的关系和意义。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 研究对象 40例，男38例，女2例，平均年龄5.8岁，均为我院儿科住院及门诊患儿，家庭中其父亲及母亲三代均居住广东。诊断通过外周血四氮唑蓝定量法确诊为G-6PD缺乏症患儿。
1.2 酶及主要试剂 Taq DNA聚合酶，Taq TrackRDNA序列分析药盒及SILVER SequenceTM DNA Sequencing Systems均由美国Promega公司生产产品，蛋白酶K为美国GIBCD BRL公司产品。
1.3 DNA提取 取静脉血10 ml肝素抗凝，用3%明胶生理盐水分离白细胞，在分离出的白细胞中按酚氯仿法抽提，乙醇沉淀DNA，紫外分光(OD 260)测定DNA含量后放入-20℃冰箱待用。
1.4 引物设计 分别在3个突变热点区设计DNA扩增引物，引物序列如下：
, 百拇医药
A1 5′CC ACC CCA GAG GAG AAG CTC AAG CT3′
B1 5′TT CAC GAG TCC TGC ATG AGC CAG AT3′
A2 5′GTC AAG GTG TTG AAA TGC ATC TCA G3′
B2 5′TAT GTG GAG AAT GAG AGG TGG GAT G3′
1.5 PCR扩增G-6PD基因片段 在100 μl PCR反应体系中含100 μg的基因组DNA，其中含1×PCR缓冲液，2.5 mmol/L MgCl2，200 μml/L dNTP，各100 μg的PCR引物及5单位的Taq酶。循环参数为95℃预变性5 min后进入循环；92℃变性1 min，56℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。PCR完成后取10 μl反应液在2%琼脂糖凝胶检测结果。
, 百拇医药
1.6 SSCP法分析PCR片段 使用含5%甘油的8%聚丙烯酰胺凝胶分析PCR片段的单链多态性；取5 μl PCR产物同含溴酚蓝及二甲苯氰醇的甲酰胺上样液20 μl预混后，置100℃加热5 min，冰浴1 min后上样，400 V电泳3 h后用银染方法染色，银染方法参照Promega公司银染试剂说明书进行。
1.7 DNA序列分析 利用PCR引物作序列分析用引物直接对PCR产物进行序列分析，序列分析操作按Promega公司SI VER SequenceTM DNA Sequencing Systems操作说明进行。
2 结果
2.1 PCR-G6PD基因与SSCP分析 用上述二对引物扩增G-6PD基因，其中针对1 024位点突变先用MboⅡ酶切，扩增后将反应物作琼脂凝胶电泳，见扩增条带清晰，无非特异性带，表明扩增效果好。
, 百拇医药
2.2 SSCP分析 40例G-6PD缺乏症SSCP电泳图上，针对1 311及1 388两个位点的有21例标本电泳图泳动比正常明显减慢，而针对1 024位点的电泳图泳动与正常标本的泳动比较无异常，说明这40例标本中没有1 024位突变，见图1。
图1 1 311位及1 388位突变的SSCP结果其中2号及7号带型异常
2.3 PCR直接测序结果 选择上述异常电泳图的标本及正常对照组标本作氨基酸序列直接测定，测序结果与正常人和已报道的基因组DNA序列比较，证实有1 311和1 388两位点的突变。其中1 311位点突变6例，1 388位点突变15例(见图2)
1 正常人DNA序列
, 百拇医药
2 G-6PD缺陷症患者DNA序列
其中1 311位点突变
3 G-6PD缺陷症患者DNA序列
其中1 388位点突变
图2 DNA序列分析
2.4 临床表现 这40例G-6PD缺乏症患儿中，除1 311、1 388两位点突变的21例外，尚有19例未定型，在已确定的21例患儿中，临床表现均为不同程度的溶血性贫血，高胆红素血症。其中新生儿高胆红素血症9例，服用氧化型药物及感染性因素所致的溶血性贫血12例，在这21例中有2例复合β型地中海贫血。
3 讨论
红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)参与磷酸戊糖旁路代谢，其基因定位于Xq 28，由13个外显子和12个内含子组成编码515个氨基酸。近年来通过克隆测序或PCR直接测序已发现G-6PD缺乏症是由于G-6PD基因的多种点突变所引起〔1〕。全世界已有58种突变类型，中国大陆已发现6种〔2〕。本文针对1 388，1 311，1 024三个突变位点作PCR基因扩增及氨基酸测序，在40例G-6PD缺乏症中，发现了1 388位点突变15例，占37.5%，1 311位点突变6例，占15%，1 024位点突变未发现病例，与国内外报道基本相似〔3〕。1 388位点基因突变为G→A碱基置换，导致精氨酸→组氨酸的氨基酸置换，该种类型在广东地区常见。1 311位点突变是一同义突变，为C→T碱基置换，不导致氨基酸性质改变，但可致多态位点的形成，而使酶活性降低。
, 百拇医药
G-6PD缺乏症主要表现是溶血性贫血，且通常由一些诱发因素引起，如感染性溶血、药物性溶血、蚕豆病、慢性非球形细胞溶血。文中的G-6PD缺乏症患儿所致溶血均有上述诱因所致的各种类型溶血。新生儿溶血常引起高胆红素血症甚至核黄疸。本文中新生儿溶血占较大比例，其中有3例核黄疸。这是由于新生儿红细胞内含谷胱甘肽过氧化性物质的能力下降，尤其是G-6PD缺乏症患儿此种能力更差〔4〕。
PCR-SSCP技术现已广泛应用到遗传病和肿瘤基因点突变的检测，由于G-6PD基因位点缺乏的多态性，逐个基因位点测序，工作量大，有一定盲目性，选择疑有突变位点基因测序显得尤为重要，而采用PCR-SSCP技术筛选带有突变的基因位点测序为一较好的研究方法。通过基因测序了解G-6PD缺乏症发生的分子基础，对于遗传性酶缺陷的基因研究及治疗提供理论依据具有重要意义。
△ 本课题为广东省“五个一科教兴医工程”科研立项
, 百拇医药
*邮政编码：肇庆市，526021
参考文献
[1] Ellson YC,cheng A,Lee A,et al.Sequence of human glucose-6-phosphate dehydrogenase cloned in plasmids and a yeast artificial chromosome.Genomics,1991,10:792～792
[2] 杜传书.遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症.中山医科大学学报，1992，13：1～1
[3] Vulliamy T,Bcuter E,Luzzatto L.Variants of glucose-6-phosphate dehydrogenase are due to missense mutations spread throyht the coding region of the gene.Human Mutation,1993,2:1-9～9
[4] Mac Donald MG,Hidden Rishs.Early dischange and bilirubin toxicity due to glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.Pediatrics,1995,96:734～735
1998-07-06 收稿 1998-11-27 修回, 百拇医药
单位：广东省肇庆市第一人民医院*
关键词：葡萄糖6磷酸脱氢酶；聚合酶链单链构象多态；基因型
临床血液学杂志990308 摘要 目的：探讨儿童葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)基因突变类型。方法：采用聚合酶链单链构象多态技术(PCR-SSCP)检测了40例G-6PD缺乏症患儿，并采用DNA序列分析。结果：发现以1 388位点突变的15例，以1 311位点突变的6例，以1 024位点突变的未发现，另19例类型未定。本文发现以1 388位点突变最常见。结论：采用PCR-SSCP技术筛查可疑突变点，再结合氨基酸序列分析了解G-6PD缺乏症发生的分子基础，对于遗传性酶缺陷的基因研究及治疗提供理论依据具有重要意义。
葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)是参与磷酸戊糖旁路代谢，产生还原型辅酶Ⅱ的关键酶，该酶缺乏能导致新生儿溶血、蚕豆病、药物性溶血及慢性非球形细胞溶血等疾病。本文利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基因位点。从而探讨儿童G-6PD缺乏症患儿的基因突变位点及与临床表现的关系和意义。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 研究对象 40例，男38例，女2例，平均年龄5.8岁，均为我院儿科住院及门诊患儿，家庭中其父亲及母亲三代均居住广东。诊断通过外周血四氮唑蓝定量法确诊为G-6PD缺乏症患儿。
1.2 酶及主要试剂 Taq DNA聚合酶，Taq TrackRDNA序列分析药盒及SILVER SequenceTM DNA Sequencing Systems均由美国Promega公司生产产品，蛋白酶K为美国GIBCD BRL公司产品。
1.3 DNA提取 取静脉血10 ml肝素抗凝，用3%明胶生理盐水分离白细胞，在分离出的白细胞中按酚氯仿法抽提，乙醇沉淀DNA，紫外分光(OD 260)测定DNA含量后放入-20℃冰箱待用。
1.4 引物设计 分别在3个突变热点区设计DNA扩增引物，引物序列如下：
, 百拇医药
A1 5′CC ACC CCA GAG GAG AAG CTC AAG CT3′
B1 5′TT CAC GAG TCC TGC ATG AGC CAG AT3′
A2 5′GTC AAG GTG TTG AAA TGC ATC TCA G3′
B2 5′TAT GTG GAG AAT GAG AGG TGG GAT G3′
1.5 PCR扩增G-6PD基因片段 在100 μl PCR反应体系中含100 μg的基因组DNA，其中含1×PCR缓冲液，2.5 mmol/L MgCl2，200 μml/L dNTP，各100 μg的PCR引物及5单位的Taq酶。循环参数为95℃预变性5 min后进入循环；92℃变性1 min，56℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。PCR完成后取10 μl反应液在2%琼脂糖凝胶检测结果。
, 百拇医药
1.6 SSCP法分析PCR片段 使用含5%甘油的8%聚丙烯酰胺凝胶分析PCR片段的单链多态性；取5 μl PCR产物同含溴酚蓝及二甲苯氰醇的甲酰胺上样液20 μl预混后，置100℃加热5 min，冰浴1 min后上样，400 V电泳3 h后用银染方法染色，银染方法参照Promega公司银染试剂说明书进行。
1.7 DNA序列分析 利用PCR引物作序列分析用引物直接对PCR产物进行序列分析，序列分析操作按Promega公司SI VER SequenceTM DNA Sequencing Systems操作说明进行。
2 结果
2.1 PCR-G6PD基因与SSCP分析 用上述二对引物扩增G-6PD基因，其中针对1 024位点突变先用MboⅡ酶切，扩增后将反应物作琼脂凝胶电泳，见扩增条带清晰，无非特异性带，表明扩增效果好。
, 百拇医药
2.2 SSCP分析 40例G-6PD缺乏症SSCP电泳图上，针对1 311及1 388两个位点的有21例标本电泳图泳动比正常明显减慢，而针对1 024位点的电泳图泳动与正常标本的泳动比较无异常，说明这40例标本中没有1 024位突变，见图1。
图1 1 311位及1 388位突变的SSCP结果其中2号及7号带型异常
2.3 PCR直接测序结果 选择上述异常电泳图的标本及正常对照组标本作氨基酸序列直接测定，测序结果与正常人和已报道的基因组DNA序列比较，证实有1 311和1 388两位点的突变。其中1 311位点突变6例，1 388位点突变15例(见图2)
1 正常人DNA序列
, 百拇医药
2 G-6PD缺陷症患者DNA序列
其中1 311位点突变
3 G-6PD缺陷症患者DNA序列
其中1 388位点突变
图2 DNA序列分析
2.4 临床表现 这40例G-6PD缺乏症患儿中，除1 311、1 388两位点突变的21例外，尚有19例未定型，在已确定的21例患儿中，临床表现均为不同程度的溶血性贫血，高胆红素血症。其中新生儿高胆红素血症9例，服用氧化型药物及感染性因素所致的溶血性贫血12例，在这21例中有2例复合β型地中海贫血。
3 讨论
红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6PD)参与磷酸戊糖旁路代谢，其基因定位于Xq 28，由13个外显子和12个内含子组成编码515个氨基酸。近年来通过克隆测序或PCR直接测序已发现G-6PD缺乏症是由于G-6PD基因的多种点突变所引起〔1〕。全世界已有58种突变类型，中国大陆已发现6种〔2〕。本文针对1 388，1 311，1 024三个突变位点作PCR基因扩增及氨基酸测序，在40例G-6PD缺乏症中，发现了1 388位点突变15例，占37.5%，1 311位点突变6例，占15%，1 024位点突变未发现病例，与国内外报道基本相似〔3〕。1 388位点基因突变为G→A碱基置换，导致精氨酸→组氨酸的氨基酸置换，该种类型在广东地区常见。1 311位点突变是一同义突变，为C→T碱基置换，不导致氨基酸性质改变，但可致多态位点的形成，而使酶活性降低。
, 百拇医药
G-6PD缺乏症主要表现是溶血性贫血，且通常由一些诱发因素引起，如感染性溶血、药物性溶血、蚕豆病、慢性非球形细胞溶血。文中的G-6PD缺乏症患儿所致溶血均有上述诱因所致的各种类型溶血。新生儿溶血常引起高胆红素血症甚至核黄疸。本文中新生儿溶血占较大比例，其中有3例核黄疸。这是由于新生儿红细胞内含谷胱甘肽过氧化性物质的能力下降，尤其是G-6PD缺乏症患儿此种能力更差〔4〕。
PCR-SSCP技术现已广泛应用到遗传病和肿瘤基因点突变的检测，由于G-6PD基因位点缺乏的多态性，逐个基因位点测序，工作量大，有一定盲目性，选择疑有突变位点基因测序显得尤为重要，而采用PCR-SSCP技术筛选带有突变的基因位点测序为一较好的研究方法。通过基因测序了解G-6PD缺乏症发生的分子基础，对于遗传性酶缺陷的基因研究及治疗提供理论依据具有重要意义。
△ 本课题为广东省“五个一科教兴医工程”科研立项
, 百拇医药
*邮政编码：肇庆市，526021
参考文献
[1] Ellson YC,cheng A,Lee A,et al.Sequence of human glucose-6-phosphate dehydrogenase cloned in plasmids and a yeast artificial chromosome.Genomics,1991,10:792～792
[2] 杜传书.遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症.中山医科大学学报，1992，13：1～1
[3] Vulliamy T,Bcuter E,Luzzatto L.Variants of glucose-6-phosphate dehydrogenase are due to missense mutations spread throyht the coding region of the gene.Human Mutation,1993,2:1-9～9
[4] Mac Donald MG,Hidden Rishs.Early dischange and bilirubin toxicity due to glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.Pediatrics,1995,96:734～735
1998-07-06 收稿 1998-11-27 修回, 百拇医药