人血清对氧磷酶活性测定方法的建立及临床初步应用
作者：杜玮南 温进坤 韩 梅
单位：河北医科大学基础医学研究所生物化学研究室(石家庄 050017)
关键词：对氧磷/代谢；酶试验；肝疾病
河北医科大学学报990302
摘 要 目的 建立对氧磷酶(paraoxonase,PON)活性测定方法，调查正常人及肝病患者(肝癌与肝硬化)血清PON活性。方法 PON活性测定用分光光度法, 同时检验批内差异、批间差异、重复性、线性关系及回收率。结果 正常人血清PON活性平均值为154.3kU/L，参考值范围为82.1～220.6kU/L，肝病患者PON活性平均值为81.1kU/L。结论 肝病患者血清PON活性较正常人明显下降，其差别有显著性(P<0.01)。
中图号 R512.6;R446.1
, http://www.100md.com
ESTABLISHMENT OF PARAOXONASE ACTIVITY
ASSAY METHOD AND CLINICAL VALUE
Du Weinan Wen Jinkun Han Mei
Department of Biochemistry, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To establish a serum paraoxonase(PON) activity assay method and the common reference values of PON activity in human serum.Methods PON activities were detected by spectrophotography.The same method was used to measure precision between batchs and within batchs, the reproducibility,and to assess the linear correlation and recovery rate.Results The coefficient of variation (CV) between batchs was 3.6 % and CV within batchs was 2.19 %.The average value of serum PON activity was 54.3 ku/L(82.1-220.6 ku/L) in normal human.The enzymatic activity was 81.1 ku/L (13.03-210.1 ku/L) in the patients with liver cancer and hepatocirrhosis.Conclusion The method was reliable and reproducible. PON activities reduced significantly in the patients with liver cancer or hepatocirrhosis (P<0.01).
, 百拇医药
MeSH paraoxon/metab; enzyme test;liver diseases
对氧磷酶(paraoxonase,PON)是由肝脏产生的、存在于血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL) 分子中的一种酶。PON产生后即与肝脏合成的apoaI结合，参与HDL的形成并释放入血。该酶具有抗动脉粥样硬化(As)形成的作用[1]。由于对氧磷和乙酸苯酯均可作为PON的底物，故该酶可同时表现为PON和芳香酯酶两种活性[2]，但目前习惯上称之为PON。近年，国外对PON的组成和性质等已进行了较为深入的探讨，但国内对PON的研究尚少。本文旨在建立PON活性测定方法，确定我国健康人血清PON活性参考值范围，以期推动PON研究在我国的深入开展。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 标本来源：健康人血清取自河北医科大学第五医院检验科，所有供血者均已除外以下疾病：肝脏疾病(包括肝炎、肝硬化、肝癌等)、高血压、糖尿病、心脑血管疾病。肝病患者(包括肝癌、肝硬化) 血清取自河北医科大学第二医院和第四医院。先取数份血清混合分装，-20 ℃保存,用于精密度及回收率等测定。其它标本冷冻保存。
1.1.2 仪器和试剂:分光光度计(日本岛津UV-210A型),乙酸苯酯为瑞典百灵威公司生产，其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 PON活性测定：按文献[3]略加改进。取反应缓冲液(CaCl2 2 mmol/L, Tris/HCl 0.1 mmol/L,pH8.0)1.3 ml，加入5 mmol/L的乙酸苯酯150 μl，于25 ℃预温20 min后，加入1:10倍稀释的样本血清50 μl(稀释液为反应缓冲液)，反应90 s，用0.5 mol/L EDTA 100 μl终止反应。然后用分光光度计于270 nm波长测定吸光度值。同时设立血清对照和底物对照。所用底物每次均现配。酶活性按下式计算：
, 百拇医药
A为净吸光度值(即标本吸光度值-血清对照和底物对照的吸光度值)，f为标本稀释倍数，FV为反应终体积，t为反应时间，SV为样品体积，L为光径，ε为摩尔消光系数，酶的活性单位定义为每分钟催化1 μmol乙酸苯酯水解所需的酶量为1u。
1.2.2 Km值测定：乙酸苯酯取4、2、1、0.5 mmol/L 4种浓度，血清按 1:10倍稀释。反应条件同前。以底物浓度的倒数为横坐标，以酶活性的倒数为纵坐标，作图求出Km值,1.2.3 批内精密度测定：取混合血清，按前述方法重复测定PON 10次，每次10管，计算变异系数(CV)。
1.2.4 批间精密度测定：取混合血清1份，分装后每隔3～5 d测定PON 1次，每次5管，共测5次。计算各次测定的平均值及CV值。
1.2.5 线性关系评价：取混合血清1份，精确测定PON活性后作1：5、1：10、1：20、1：40、1：80 的连续稀释，并测定其PON活性。每个稀释度均设立血清对照。将测定结果与理论值作相关性分析。
, http://www.100md.com
1.2.6 回收实验
标准曲线的建立: 用反应缓冲液加入苯酚配制浓度为4 mmol/L的苯酚溶液，作倍比稀释后使苯酚浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L。各种浓度苯酚溶液均取1.5 ml，加入0.5 mol/L EDTA 100 μl，测定270 nm的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，苯酚浓度为横坐标作图, 绘制标准曲线。
回收率测定: 按前述方法测定15份血清的吸光度值后，分别向反应体系中加入5、8、10 μl,0.16 mol/L 苯酚溶液，使反应体系中苯酚的浓度增加0.5、0.8、1 mmol/L，再次测定反应液的吸光度值，与理论值作比较，计算回收率。
1.2.7 正常参考值测定：取健康人血清53份，测定其PON活性，计算均值、标准差。
1.2.8 肝病患者血清PON活性测定：取肝癌(18例)和肝硬化(15例)患者血清共33份，按上述方法测定PON活性。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 PON Km值：以双倒数(林-贝氏)作图法求得的PON Km值为0.87 mmol/L。该值与文献[4]报道的Km=(0.85±0.04) mmol/L接近。
2.2 批内精密度: 10次PON活性测定的变异系数在1.41 %～2.97 %之间,均小于5 %。
2.3 批间精密度：5次测定结果的平均值之间的变异系数为3.6%，亦小于5 %。
2.4 线性关系评价：血清连续稀释5次，各稀释度测定值的相关系数r=0.95，说明相关性良好。
2.5 回收率：反应体系中加入5、8、10 μl,0.16 mol/L苯酚溶液后的平均回收率各为 100 %(98.6%～101.4%)，100.4%(99.1%～101.7%)，98.8%(97.8%～100 %)，说明在所检测的浓度范围内回收良好。
, 百拇医药
2.6 正常参考值：53份标本的PON活性平均值为154.3 ku/L,最大值为221.5 ku/L，最小值为76.5 ku/L，最大值与最小值相差2.89倍。经检验，这些标本的酶活性分布符合正态分布，且男女性别间无明显差异(P>0.05)。在以年龄分组时，30及40岁以上两组段的平均值较其它组段高,有明显差异性(P<0.05),这可能与例数较少有关。参考值的范围为82.1～220. 6ku/L。
2.7 肝病血清PON活性：33份标本平均值为81.1 ku/L，最大值210.1 ku/L，最小值13.03 ku/L，最大值与最小值相差16.1倍。
3 讨 论
PON又称芳香基二烷基磷酸酯酶(EC 3.1.8.1)，属于水解酶类。在人体内因其可以水解低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),在氧化修饰时形成的氧化型脂类而具有抗As形成的作用，是HDL抗As形成的机理之一。流行病学调查发现，心肌梗塞及糖尿病患者血清PON活性明显低于正常，故该酶活性的高低可作为反映人们罹患As可能性大小的指标。PON在体内的天然底物尚不清楚,目前各实验室常用对氧磷或乙酸苯酯作底物测定PON活性。乙酸苯酯在PON的催化下生成乙酸和苯酚[4]。根据苯酚对270 nm紫外光有强烈吸收而乙酸苯酯吸收极低这一性质，可通过酶促反应后270 nm吸光度的增加值来检测PON活性的高低。因PON的活性依赖于Ca2+的存在，反应后可用EDTA终止反应。此法不仅灵敏度高，精密度和重复性好，而且简便易行，适合一般实验室及临床检验应用，缺点是乙酸苯酯在放置时易于水解，故每次使用时均应现配。用本法所测得的中国人血清PON活性平均值为154.3 ku/L，高于国外文献[3]报道的为119.4 ku/L，这可能与种族不同有关。
, 百拇医药
统计学分析显示，肝硬化、肝癌患者血清PON活性和健康人相比明显降低(t检验，P<0.01)，这可能与肝癌、肝硬化时，肝细胞功能严重受损,造成PON合成量下降有关。可见，PON除了可作为衡量人们罹患As可能性大小的指标以外，还可用于反映肝脏的功能情况。另外，统计显示，肝硬化和肝癌患者之间PON活性无明显差异，可能与肝癌和肝硬化在肝脏受损程度上无明显不同有关。
参考文献
1.Shih DM,Gu LJ,Hama S ,et al.Genetic-dietary regulation of serum paraoxonase expression and role in atherogenesis in a mouse model.J Clin Invest.1996,97(7):1630
2.杜玮南,温进坤. 对氧磷酶及其生理功能的研究进展.中国动脉硬化杂志, 1997,5(4):353
, 百拇医药
3.Mackness MI,Harty D,Bhatnagar D,et al.Serum paraoxonase activity in familiar hypercholesterolaemia and insulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis,1991,86(3):193
4.Lorentz K,Flatter B,Augustin E. Arylesterase in serum: elaboration and clinical application of a fixed-incubation method. Clin Chem,1979,25(10):1714
(1999-01-20 收稿), 百拇医药
单位：河北医科大学基础医学研究所生物化学研究室(石家庄 050017)
关键词：对氧磷/代谢；酶试验；肝疾病
河北医科大学学报990302
摘 要 目的 建立对氧磷酶(paraoxonase,PON)活性测定方法，调查正常人及肝病患者(肝癌与肝硬化)血清PON活性。方法 PON活性测定用分光光度法, 同时检验批内差异、批间差异、重复性、线性关系及回收率。结果 正常人血清PON活性平均值为154.3kU/L，参考值范围为82.1～220.6kU/L，肝病患者PON活性平均值为81.1kU/L。结论 肝病患者血清PON活性较正常人明显下降，其差别有显著性(P<0.01)。
中图号 R512.6;R446.1
, http://www.100md.com
ESTABLISHMENT OF PARAOXONASE ACTIVITY
ASSAY METHOD AND CLINICAL VALUE
Du Weinan Wen Jinkun Han Mei
Department of Biochemistry, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To establish a serum paraoxonase(PON) activity assay method and the common reference values of PON activity in human serum.Methods PON activities were detected by spectrophotography.The same method was used to measure precision between batchs and within batchs, the reproducibility,and to assess the linear correlation and recovery rate.Results The coefficient of variation (CV) between batchs was 3.6 % and CV within batchs was 2.19 %.The average value of serum PON activity was 54.3 ku/L(82.1-220.6 ku/L) in normal human.The enzymatic activity was 81.1 ku/L (13.03-210.1 ku/L) in the patients with liver cancer and hepatocirrhosis.Conclusion The method was reliable and reproducible. PON activities reduced significantly in the patients with liver cancer or hepatocirrhosis (P<0.01).
, 百拇医药
MeSH paraoxon/metab; enzyme test;liver diseases
对氧磷酶(paraoxonase,PON)是由肝脏产生的、存在于血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL) 分子中的一种酶。PON产生后即与肝脏合成的apoaI结合，参与HDL的形成并释放入血。该酶具有抗动脉粥样硬化(As)形成的作用[1]。由于对氧磷和乙酸苯酯均可作为PON的底物，故该酶可同时表现为PON和芳香酯酶两种活性[2]，但目前习惯上称之为PON。近年，国外对PON的组成和性质等已进行了较为深入的探讨，但国内对PON的研究尚少。本文旨在建立PON活性测定方法，确定我国健康人血清PON活性参考值范围，以期推动PON研究在我国的深入开展。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 标本来源：健康人血清取自河北医科大学第五医院检验科，所有供血者均已除外以下疾病：肝脏疾病(包括肝炎、肝硬化、肝癌等)、高血压、糖尿病、心脑血管疾病。肝病患者(包括肝癌、肝硬化) 血清取自河北医科大学第二医院和第四医院。先取数份血清混合分装，-20 ℃保存,用于精密度及回收率等测定。其它标本冷冻保存。
1.1.2 仪器和试剂:分光光度计(日本岛津UV-210A型),乙酸苯酯为瑞典百灵威公司生产，其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 PON活性测定：按文献[3]略加改进。取反应缓冲液(CaCl2 2 mmol/L, Tris/HCl 0.1 mmol/L,pH8.0)1.3 ml，加入5 mmol/L的乙酸苯酯150 μl，于25 ℃预温20 min后，加入1:10倍稀释的样本血清50 μl(稀释液为反应缓冲液)，反应90 s，用0.5 mol/L EDTA 100 μl终止反应。然后用分光光度计于270 nm波长测定吸光度值。同时设立血清对照和底物对照。所用底物每次均现配。酶活性按下式计算：
, 百拇医药
A为净吸光度值(即标本吸光度值-血清对照和底物对照的吸光度值)，f为标本稀释倍数，FV为反应终体积，t为反应时间，SV为样品体积，L为光径，ε为摩尔消光系数，酶的活性单位定义为每分钟催化1 μmol乙酸苯酯水解所需的酶量为1u。
1.2.2 Km值测定：乙酸苯酯取4、2、1、0.5 mmol/L 4种浓度，血清按 1:10倍稀释。反应条件同前。以底物浓度的倒数为横坐标，以酶活性的倒数为纵坐标，作图求出Km值,1.2.3 批内精密度测定：取混合血清，按前述方法重复测定PON 10次，每次10管，计算变异系数(CV)。
1.2.4 批间精密度测定：取混合血清1份，分装后每隔3～5 d测定PON 1次，每次5管，共测5次。计算各次测定的平均值及CV值。
1.2.5 线性关系评价：取混合血清1份，精确测定PON活性后作1：5、1：10、1：20、1：40、1：80 的连续稀释，并测定其PON活性。每个稀释度均设立血清对照。将测定结果与理论值作相关性分析。
, http://www.100md.com
1.2.6 回收实验
标准曲线的建立: 用反应缓冲液加入苯酚配制浓度为4 mmol/L的苯酚溶液，作倍比稀释后使苯酚浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L。各种浓度苯酚溶液均取1.5 ml，加入0.5 mol/L EDTA 100 μl，测定270 nm的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，苯酚浓度为横坐标作图, 绘制标准曲线。
回收率测定: 按前述方法测定15份血清的吸光度值后，分别向反应体系中加入5、8、10 μl,0.16 mol/L 苯酚溶液，使反应体系中苯酚的浓度增加0.5、0.8、1 mmol/L，再次测定反应液的吸光度值，与理论值作比较，计算回收率。
1.2.7 正常参考值测定：取健康人血清53份，测定其PON活性，计算均值、标准差。
1.2.8 肝病患者血清PON活性测定：取肝癌(18例)和肝硬化(15例)患者血清共33份，按上述方法测定PON活性。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 PON Km值：以双倒数(林-贝氏)作图法求得的PON Km值为0.87 mmol/L。该值与文献[4]报道的Km=(0.85±0.04) mmol/L接近。
2.2 批内精密度: 10次PON活性测定的变异系数在1.41 %～2.97 %之间,均小于5 %。
2.3 批间精密度：5次测定结果的平均值之间的变异系数为3.6%，亦小于5 %。
2.4 线性关系评价：血清连续稀释5次，各稀释度测定值的相关系数r=0.95，说明相关性良好。
2.5 回收率：反应体系中加入5、8、10 μl,0.16 mol/L苯酚溶液后的平均回收率各为 100 %(98.6%～101.4%)，100.4%(99.1%～101.7%)，98.8%(97.8%～100 %)，说明在所检测的浓度范围内回收良好。
, 百拇医药
2.6 正常参考值：53份标本的PON活性平均值为154.3 ku/L,最大值为221.5 ku/L，最小值为76.5 ku/L，最大值与最小值相差2.89倍。经检验，这些标本的酶活性分布符合正态分布，且男女性别间无明显差异(P>0.05)。在以年龄分组时，30及40岁以上两组段的平均值较其它组段高,有明显差异性(P<0.05),这可能与例数较少有关。参考值的范围为82.1～220. 6ku/L。
2.7 肝病血清PON活性：33份标本平均值为81.1 ku/L，最大值210.1 ku/L，最小值13.03 ku/L，最大值与最小值相差16.1倍。
3 讨 论
PON又称芳香基二烷基磷酸酯酶(EC 3.1.8.1)，属于水解酶类。在人体内因其可以水解低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),在氧化修饰时形成的氧化型脂类而具有抗As形成的作用，是HDL抗As形成的机理之一。流行病学调查发现，心肌梗塞及糖尿病患者血清PON活性明显低于正常，故该酶活性的高低可作为反映人们罹患As可能性大小的指标。PON在体内的天然底物尚不清楚,目前各实验室常用对氧磷或乙酸苯酯作底物测定PON活性。乙酸苯酯在PON的催化下生成乙酸和苯酚[4]。根据苯酚对270 nm紫外光有强烈吸收而乙酸苯酯吸收极低这一性质，可通过酶促反应后270 nm吸光度的增加值来检测PON活性的高低。因PON的活性依赖于Ca2+的存在，反应后可用EDTA终止反应。此法不仅灵敏度高，精密度和重复性好，而且简便易行，适合一般实验室及临床检验应用，缺点是乙酸苯酯在放置时易于水解，故每次使用时均应现配。用本法所测得的中国人血清PON活性平均值为154.3 ku/L，高于国外文献[3]报道的为119.4 ku/L，这可能与种族不同有关。
, 百拇医药
统计学分析显示，肝硬化、肝癌患者血清PON活性和健康人相比明显降低(t检验，P<0.01)，这可能与肝癌、肝硬化时，肝细胞功能严重受损,造成PON合成量下降有关。可见，PON除了可作为衡量人们罹患As可能性大小的指标以外，还可用于反映肝脏的功能情况。另外，统计显示，肝硬化和肝癌患者之间PON活性无明显差异，可能与肝癌和肝硬化在肝脏受损程度上无明显不同有关。
参考文献
1.Shih DM,Gu LJ,Hama S ,et al.Genetic-dietary regulation of serum paraoxonase expression and role in atherogenesis in a mouse model.J Clin Invest.1996,97(7):1630
2.杜玮南,温进坤. 对氧磷酶及其生理功能的研究进展.中国动脉硬化杂志, 1997,5(4):353
, 百拇医药
3.Mackness MI,Harty D,Bhatnagar D,et al.Serum paraoxonase activity in familiar hypercholesterolaemia and insulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis,1991,86(3):193
4.Lorentz K,Flatter B,Augustin E. Arylesterase in serum: elaboration and clinical application of a fixed-incubation method. Clin Chem,1979,25(10):1714
(1999-01-20 收稿), 百拇医药