眼镜蛇毒抗肿瘤作用的研究进展
作者：谭获 管锦霞 郝玉书
单位：广州医学院第二附属医院血液科，广州510260
关键词：眼镜蛇毒；抗肿瘤作用
广州医学院学报990328 中图分类号 R931.74
近年来，人们对蛇毒成分的抗肿瘤作用进行了较多的研究，其中眼镜蛇毒的抑癌作用引起了很大的关注[1]。
1 眼镜蛇毒的抗肿瘤作用
1.1 体外实验
体外实验分两个层次：一是直接使用粗毒，二是使用提纯的蛇毒成分。我国学者赵蓉等[2]应用9种蛇毒(眼睛王蛇、眼镜蛇、金环蛇、银环蛇、青环海蛇、蝮蛇、尖吻蛇、竹叶青及圆斑蝰)的粗毒对多种人类实体瘤细胞株，包括子宫颈癌细胞株(Hela)、鼻咽癌细胞株(CNE)、肝癌细胞株(SMC)、胃癌细胞株(MGC80-3)等进行了直接毒性作用实验，结果表明眼镜蛇毒对肿瘤细胞的杀伤作用最强，对SMC的杀伤浓度为50μg/ml，而对Hela、CNE、MGC80～3的杀伤浓度仅为5μg/ml。林振桃等[3]也证明国产8种蛇毒粗毒中对白血病细胞杀伤作用最强的是眼镜蛇毒。杨惠玲等[4]发现中华眼镜蛇毒对人高、低分化鼻咽癌细胞株(CNE-l、CNE-2)、人慢性髓系白血病细胞株(K562)、小鼠肝癌细胞株(Hep-2)等四种体外培养的肿瘤细胞均有明显的细胞毒效应，此效应与蛇毒作用的时间呈正相关，其中以K562最敏感(IC50为5.5μg/ml)。粗毒与肿瘤细胞直接接触后，短时间内细胞即出现固缩，胞质及胞核溶解，细胞死亡[2]。上述结果提示：不同蛇毒的抗癌作用不尽相同，可能与其膜毒素的含量及结构不同有关。不同肿瘤对同一蛇毒的反应亦不一致，可能与各种瘤株的独自特性有关。由于粗毒组成复杂，难以弄清其有效组份及作用机制，故提纯后进行实验研究更有价值。Braganca[5]发现印度眼镜蛇毒的膜毒素能选择性溶解吉田肉瘤细胞，而对人或鼠红细胞等正常细胞影响不大：当膜毒素浓度仅为0.4μg/ml时即能溶解吉田肉瘤细胞，而浓度高达6000μg/ml以上时才能破坏鼠红细胞。1980年，杜雨苍[6]报道了中华眼镜蛇毒的膜毒素在试管中对吉田肉瘤有迅速而强烈的破坏作用，且呈现良好的量-效关系，T50(溶解50%吉田肉瘤细胞的毒素需要量)约为1μg/ml，钙离于对此效应有抑制作用。Leung等[7]发现眼镜蛇毒对艾氏腹水癌细胞亦有杀伤作用。杨丽娟等[8]用MTT法研究分离提纯的眼镜蛇毒对体外培养的人肝癌细胞株(SMC)和人胃癌细胞株(SGC-7901)的毒性作用，发现蛇毒对瘤细胞明显抑制(IC50分别为2.45和1.24μg/ml)，量效关系明确。褚嘉佑等[9]应用中华眼镜蛇毒的膜毒索与抗人T细胞单克隆抗体偶联制备免疫毒索，与人T淋巴细胞白血病细胞系(CEM)和B淋巴细胞株(Raji)一起培养，结果显示能特异性杀伤靶细胞CEM，而对抗原阴性的Raji细胞杀伤很少。
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1.2 体内抗肿瘤作用
在体内，膜毒素能抑制实验动物的肿瘤生长，使肿瘤体积缩小，宿主寿命延长。Fawzia[10]用眼镜蛇毒对接种艾氏腹水癌细胞的小鼠进行实验治疗，结果证明小鼠存活时间明显延长，癌细胞活力降低。罗伯诚等[11]于接种后2～10天，用眼镜蛇毒灌喂荷腹水型肝癌的小鼠，30mg/kg,每天给药一次，抑瘤率达65.7%，高于每天用20mg/kg5FU治疗的对照组(45.16%)。小鼠移植瘤内可见坏死灶，灶内有癌细胞破裂、核碎裂、核溶解、纤维增生、白细胞浸润。但未见肝、肾细胞变性坏死。林振挑等[12]发现眼镜蛇毒C组份能明显抑制小鼠肝癌细胞的生长，当肝癌细胞膜被人为损伤时，组份C对其生长的抑制作用显著增强。凌鸿英等[13]探索了蛇毒与白细胞介素-2联合使用能提高抑瘤作用和宿主的自然杀伤细胞功能，起到协同抗小鼠移植肝癌的作用。此外，Braganca[14]报道蛇毒膜毒素与抗癌药马法兰、环磷酰胺等有协同抗肿瘤效应。
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1.3 临床初步应用情况
眼镜蛇毒的抗肿瘤治疗主要用于各类中、晚期癌症或肿瘤术后，目的是改善病人的精神状况，增进食欲，减轻疼痛，从而提高患者的生活质量，延长生存期。吴洪滨[15]用眼镜蛇毒及蝮蛇毒口服胶囊，治疗120例肿瘤病人，镇痛有效率达80%左右，一般4～7天起效，作用强而持久，62%的癌症患者症状减轻或病情稳定，病人食欲增加，睡眠良好，精神状况好转，生存质量提高，成活期延长。未见明显的毒副反应。
2 眼镜蛇毒的抗肿瘤机理
2.1 对细胞膜的影响
眼镜蛇毒的膜毒素是通过与靶细胞膜上的特定结合部位结合而发挥作用的。不同细胞对同一蛇毒反应不同是由于结合位点的数目不同所致[16]。Gasanov等[17]发现眼镜蛇毒毒素易于与富含酸性磷脂的浆膜外层结合，导致膜通透性增强。纯细胞毒(不含磷脂酶A2)仅对Jurkat细胞起作用，对正常的淋巴细胞几乎没有影响。Zaheer等[18]认为膜毒素能抑制细胞膜上Na+-K+-ATPase,干扰膜的转运机制：膜毒素的双硫键可能与Na+-K+-ATPase的巯基结合，使该酶失活，引起细胞内外Na+、K+比例失调，葡萄糖等物质不能偶联转运，从而导致细胞肿胀、破裂。此外，也有人发现膜毒素能抑制细胞膜上的Ca+-ATPase活性，使Ca无法泵出胞外，引起细胞膜破坏[19]。膜毒素对细胞膜的干扰，尚可使抗癌药物易于进入胞浆，从而起到协同效应。
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2.2 对细胞能量代谢的影响
眼镜蛇毒的膜毒素能与线粒体内膜结合，使膜上Ca通透受到抑制，从而使完整线粒体的呼吸明显抑制，细胞能量代谢障碍[20]。
2.3 对自由基的影响
龚海云等[21]发现眼镜蛇毒能增强肝癌细胞的诱生型NO合成酶的活性，使NO显著增多。NO一方面可使体内产生羟自由基(.OH)，引起细胞膜脂质过氧化，使蛋白质交联和核酸氧化损伤，进而抑制细胞的线粒体呼吸和DNA复制，导致细胞死亡。另一方面，NO还可使脂质过氧化物酶(LPO)升高，而膜脂质过氧化可使膜酶受到损伤，膜内不饱和脂肪酸受到破坏，致使膜流动性下降和膜通透性增加。最终导致细胞代谢功能和结构的改变。
2.4 对核酸合成的影响
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眼镜蛇毒能明显抑制肺癌A549细胞的DNA复制过程和rRNA的合成，使肿瘤细胞的增殖活性降低。蛇毒尚能使瘤细胞的姐妹染色体单体交换(SCE)频率下降，提示蛇毒不仅具有杀瘤作用，还能抑制癌细胞的恶性程度[22]。
2.5 对机体免疫系统的影响
眼镜蛇毒具有补体C3转化酶的作用，并能直接作用于C5，启动补体攻膜复合物的形成，溶解肿瘤细胞。Vogel等用一种双功能交联剂使眼镜蛇毒因子(CVF)与鼠类抗人黑色素瘤单克隆抗体结合。这种McAb-CVF复合物在正常血清或C4缺陷血清存在下表现出专一的溶细胞毒性，可选择性地杀伤黑色素瘤细胞，但不杀伤LC-2成淋巴瘤细胞或P815肥大细胞瘤细胞。无血清存在时，此复合物无溶细胞毒性。不论有无血清，McAb或CVF单独存在时均不能溶解细胞[23]。膜毒素还可通过促进自然杀伤细胞活性，非特异地杀伤肿瘤细胞[24]。此外，眼镜蛇毒尚可通过激活补体，产生活性片段C3a、C5a、C3a、C5a一方面激活并趋化大量白细胞向肺毛细血管床转移，另一方面又能促使骨髓大量释放白细胞，使得外周血白细胞计数先短暂下降随后显著升高；同时，白细胞的吞噬和粘附功能增强[25]。
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2.6 对高凝状态的影响
眼镜蛇毒具有较强的抗凝和纤溶作用，并对血小板功能产生一定的抑制效应，故可改变肿瘤病人血液的高凝状态，改善微循环，从而起到抗癌和预防癌细胞转移的作用[26]。
3 眼镜蛇毒的毒副作用
薛玲等[27]对中华眼镜蛇毒细胞毒素的毒性进行了系统研究，发现一次性尾静脉注入不同剂量的细胞毒素后，小鼠急性LD50及其95%可信限为1158.7μg/kg，中毒表现为匍伏、毛松、懒动直至心跳停止，解剖未见心、肺、肝、脾、肾等脏器的明显变化。犬静脉恒速注入100μg/kg的细胞毒素，qlh,共5次，呼吸、血压、心电图未见明显变化，一次超过500μg/kg，则出现心律不齐、停搏，呼吸停止。大鼠腹内注射细胞毒素250、500、1000μg/kg/d，连续40天，无一死亡，肝肾功能及血液生化均无明显变化。病理检查高剂量组中部分动物肝脏中度浊肿及水样变性和散在点状坏死，肺有散在性出血。中剂量组肝脏轻度浊肿，偶伴有水样变性，个别动物有小点状坏死，肺有点状出血。停药30天后高、中剂量组病理改变均恢复正常。可见，长期或大剂量的蛇毒对肝肺有一定毒性作用，但为可逆性；低剂量无毒性，现用的临床治疗剂量是非常安全的。
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4 存在的问题及应用前景
我国南方的眼镜蛇毒资源丰富，在蛇毒抗肿瘤方面的研究已达国际先进水平。但蛇毒抗癌的确切机制尚不清楚；目前临床治疗试验多采用粗毒制剂口服，影响疗效评价。
我们对眼镜蛇毒的抗白血病作用进行了较为深入的研究(材料待发表)，发现其M组份不仅对耐药的K562细胞株有杀伤作用，而且与阿霉素有协同抗瘤作用。若与化疗药物同时使用，可能会提高化疗效果。我们拟应用进一步纯化后的组份C静注制剂进行临床试用，以验证它在这方面的药效。
参考文献
1 仲晓燕，刘广芬，王晴川.中华眼镜蛇毒细胞毒素14的纯化及其癌活性.中国药 理学报，1993；14(3)：279～282
2 赵蓉，游云，高敏新等.蛇毒对人及小鼠传代细胞的杀伤作用.福建医学院学报 ，1988；22(3)：204～206
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3 林振桃，管锦霞，龚海云等.八种常见国产蛇毒对白血病细胞杀伤作用研究. 蛇志，1995；7(4)：4～6
4 杨惠玲，余清声，简志瀚等.中华眼镜蛇毒对人鼻咽癌等抑瘤作用的实验研 究.癌症，1999；18(1)：27～29
5 Bragaca BM,Pater NT,Badrinath PG.Isolation and properties of a cobra ve nom factor selectively cytotoxic to yoshida sarcoma.Biochem Biophys Acta,1967；13 6:508～513
6 杜雨苍.中华眼镜蛇膜毒素的体外溶吉田肉瘤细胞作用.生物化学与生物物理学 报，1980；12(4)：349～355
7 Leung WW,Keung WM,Kong YC.The eytolic effect of cobra cardiotoxin on Eh rlich ascites tumor cells and its inhibition by Ca2+ Naunyn-Schmiedebergs Arch p harmacol,1976；292(2):197～203
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8 杨丽娟，刘广芬，王晴川.眼镜蛇毒细胞毒素在体外对人癌细胞的毒性作用(MTT 法).福建医科大学学报，1997；31(1)：17～19
9 褚嘉佑，张和君，杨爱德，等.中华眼镜蛇膜毒素与McAb偶联物对白血病细胞的 杀伤作用.中国医学科学院学报，1992；14(3)：179～184
10 Fawzia.Treatment trials of E.A.C with crude N.Nigricollis Venom and it s frac tion 3(mice).Proceeding of the 7thEuropean symposium on animal,plant and m icrobial toxins,1986:107～108
11 罗伯成，王存川，杨冠群等.口服眼镜蛇毒抑制小鼠肿瘤的研究.中华实验外 科杂志，1993；1：31～32
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12 林振桃，赵路宁，植飞等.眼镜蛇毒组份C对小鼠实验性肝癌细胞生长 影响的探讨.中国蛇毒杂志，1997；9(1)：3～6
13 凌鸿英，李佳荃.IL-2与眼镜蛇毒协同抗肿瘤作用的实验研究.免疫学杂志，1 991；7(4)：248～251
14 Braganca BM.Biologically active components of cobra venom in relation to cancer research. Indian J. Med Res, 1976；64(8):1197～1199
15 吴洪斌.蛇毒胶囊的研制及在癌症治疗中的应用.上海医药，1997；4：24～25
16 苏秀容，潘启超.蛇毒中的直接溶解因子对人肿瘤细胞株的毒性作用.癌症，19 94；13：302～304
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17 Gasanov SE,Alsarraj MA,Gasanov NE,et al, Cobra venom cytotoxin free of phosph olipase A2 and its efect on model membranes and T leukemia cells.J Membr Biol, 1997；155(2):133～142
18 Zaheer A,Noronha SH,Hospattankar AV,et al,Inactivation of (Na+- K+-)stimulated ATPase by a cytotoxic protein from cobra venom in relation to its lyctic effects on cells.Biochem Biophys Acta,1975；394(2):294～299
19 顾本贤，朱学工，杜雨苍等.中华眼镜蛇毒膜毒素C对细胞膜Ca2+-ATP 酶的抑制作用.生物化学与生物物理学报，1989；21(1)27～33
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20 顾本贤，杜雨苍.中华眼镜蛇毒膜毒素对鼠肝线粒体膜的作用位点的研究.生物 化学与生物物理学报，1984；16(2)：165～171
21 龚海云，余清声，管锦霞等.眼镜蛇毒直接溶解因子对肝癌细胞株H7420产生NO 和LPO的影响.中国病理生理杂志，1998；14(1)：18～21
22 梁敏仪，陈家坤，朱蔚云.眼镜蛇毒心脏毒素对人肺癌A549细胞株的遗传毒性研 究.蛇志，1997；9(4)：10～13
23 Vogel CW. Induction of immune cytolysis:tumor-cell killing by comple ment is initiated by covalent complex of monocloned antibody and stableC3/C5 conv er tase. Proc Natl Acad Sci,1981；78:7707～7716
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24 吴耀生，舒雨雁.眼镜蛇蛇毒因子与免疫研究.广西医学，1992；14(3)：176～ 180
25 叶春玲，曹艳英，漆松涛.眼镜蛇毒因子激活补体对大鼠外周血白细胞数目和功 能的影响.中国药理学通报，1997；13(6)：520～522
26 余清声，管锦霞，郭健仪.眼镜蛇毒M组份对实验性血栓形成的影响.广州医学院 学报，1992；20(2)：9～13
27 薛玲，刘广芬，王晴川等.中华眼镜蛇毒细胞毒素对动物急性及长 期毒性研究.福建医学院学报，1996；30(2)：109～113
(收稿：1999-05-29), 百拇医药
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关键词：眼镜蛇毒；抗肿瘤作用
广州医学院学报990328 中图分类号 R931.74
近年来，人们对蛇毒成分的抗肿瘤作用进行了较多的研究，其中眼镜蛇毒的抑癌作用引起了很大的关注[1]。
1 眼镜蛇毒的抗肿瘤作用
1.1 体外实验
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1.2 体内抗肿瘤作用
在体内，膜毒素能抑制实验动物的肿瘤生长，使肿瘤体积缩小，宿主寿命延长。Fawzia[10]用眼镜蛇毒对接种艾氏腹水癌细胞的小鼠进行实验治疗，结果证明小鼠存活时间明显延长，癌细胞活力降低。罗伯诚等[11]于接种后2～10天，用眼镜蛇毒灌喂荷腹水型肝癌的小鼠，30mg/kg,每天给药一次，抑瘤率达65.7%，高于每天用20mg/kg5FU治疗的对照组(45.16%)。小鼠移植瘤内可见坏死灶，灶内有癌细胞破裂、核碎裂、核溶解、纤维增生、白细胞浸润。但未见肝、肾细胞变性坏死。林振挑等[12]发现眼镜蛇毒C组份能明显抑制小鼠肝癌细胞的生长，当肝癌细胞膜被人为损伤时，组份C对其生长的抑制作用显著增强。凌鸿英等[13]探索了蛇毒与白细胞介素-2联合使用能提高抑瘤作用和宿主的自然杀伤细胞功能，起到协同抗小鼠移植肝癌的作用。此外，Braganca[14]报道蛇毒膜毒素与抗癌药马法兰、环磷酰胺等有协同抗肿瘤效应。
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1.3 临床初步应用情况
眼镜蛇毒的抗肿瘤治疗主要用于各类中、晚期癌症或肿瘤术后，目的是改善病人的精神状况，增进食欲，减轻疼痛，从而提高患者的生活质量，延长生存期。吴洪滨[15]用眼镜蛇毒及蝮蛇毒口服胶囊，治疗120例肿瘤病人，镇痛有效率达80%左右，一般4～7天起效，作用强而持久，62%的癌症患者症状减轻或病情稳定，病人食欲增加，睡眠良好，精神状况好转，生存质量提高，成活期延长。未见明显的毒副反应。
2 眼镜蛇毒的抗肿瘤机理
2.1 对细胞膜的影响
眼镜蛇毒的膜毒素是通过与靶细胞膜上的特定结合部位结合而发挥作用的。不同细胞对同一蛇毒反应不同是由于结合位点的数目不同所致[16]。Gasanov等[17]发现眼镜蛇毒毒素易于与富含酸性磷脂的浆膜外层结合，导致膜通透性增强。纯细胞毒(不含磷脂酶A2)仅对Jurkat细胞起作用，对正常的淋巴细胞几乎没有影响。Zaheer等[18]认为膜毒素能抑制细胞膜上Na+-K+-ATPase,干扰膜的转运机制：膜毒素的双硫键可能与Na+-K+-ATPase的巯基结合，使该酶失活，引起细胞内外Na+、K+比例失调，葡萄糖等物质不能偶联转运，从而导致细胞肿胀、破裂。此外，也有人发现膜毒素能抑制细胞膜上的Ca+-ATPase活性，使Ca无法泵出胞外，引起细胞膜破坏[19]。膜毒素对细胞膜的干扰，尚可使抗癌药物易于进入胞浆，从而起到协同效应。
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2.2 对细胞能量代谢的影响
眼镜蛇毒的膜毒素能与线粒体内膜结合，使膜上Ca通透受到抑制，从而使完整线粒体的呼吸明显抑制，细胞能量代谢障碍[20]。
2.3 对自由基的影响
龚海云等[21]发现眼镜蛇毒能增强肝癌细胞的诱生型NO合成酶的活性，使NO显著增多。NO一方面可使体内产生羟自由基(.OH)，引起细胞膜脂质过氧化，使蛋白质交联和核酸氧化损伤，进而抑制细胞的线粒体呼吸和DNA复制，导致细胞死亡。另一方面，NO还可使脂质过氧化物酶(LPO)升高，而膜脂质过氧化可使膜酶受到损伤，膜内不饱和脂肪酸受到破坏，致使膜流动性下降和膜通透性增加。最终导致细胞代谢功能和结构的改变。
2.4 对核酸合成的影响
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眼镜蛇毒能明显抑制肺癌A549细胞的DNA复制过程和rRNA的合成，使肿瘤细胞的增殖活性降低。蛇毒尚能使瘤细胞的姐妹染色体单体交换(SCE)频率下降，提示蛇毒不仅具有杀瘤作用，还能抑制癌细胞的恶性程度[22]。
2.5 对机体免疫系统的影响
眼镜蛇毒具有补体C3转化酶的作用，并能直接作用于C5，启动补体攻膜复合物的形成，溶解肿瘤细胞。Vogel等用一种双功能交联剂使眼镜蛇毒因子(CVF)与鼠类抗人黑色素瘤单克隆抗体结合。这种McAb-CVF复合物在正常血清或C4缺陷血清存在下表现出专一的溶细胞毒性，可选择性地杀伤黑色素瘤细胞，但不杀伤LC-2成淋巴瘤细胞或P815肥大细胞瘤细胞。无血清存在时，此复合物无溶细胞毒性。不论有无血清，McAb或CVF单独存在时均不能溶解细胞[23]。膜毒素还可通过促进自然杀伤细胞活性，非特异地杀伤肿瘤细胞[24]。此外，眼镜蛇毒尚可通过激活补体，产生活性片段C3a、C5a、C3a、C5a一方面激活并趋化大量白细胞向肺毛细血管床转移，另一方面又能促使骨髓大量释放白细胞，使得外周血白细胞计数先短暂下降随后显著升高；同时，白细胞的吞噬和粘附功能增强[25]。
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2.6 对高凝状态的影响
眼镜蛇毒具有较强的抗凝和纤溶作用，并对血小板功能产生一定的抑制效应，故可改变肿瘤病人血液的高凝状态，改善微循环，从而起到抗癌和预防癌细胞转移的作用[26]。
3 眼镜蛇毒的毒副作用
薛玲等[27]对中华眼镜蛇毒细胞毒素的毒性进行了系统研究，发现一次性尾静脉注入不同剂量的细胞毒素后，小鼠急性LD50及其95%可信限为1158.7μg/kg，中毒表现为匍伏、毛松、懒动直至心跳停止，解剖未见心、肺、肝、脾、肾等脏器的明显变化。犬静脉恒速注入100μg/kg的细胞毒素，qlh,共5次，呼吸、血压、心电图未见明显变化，一次超过500μg/kg，则出现心律不齐、停搏，呼吸停止。大鼠腹内注射细胞毒素250、500、1000μg/kg/d，连续40天，无一死亡，肝肾功能及血液生化均无明显变化。病理检查高剂量组中部分动物肝脏中度浊肿及水样变性和散在点状坏死，肺有散在性出血。中剂量组肝脏轻度浊肿，偶伴有水样变性，个别动物有小点状坏死，肺有点状出血。停药30天后高、中剂量组病理改变均恢复正常。可见，长期或大剂量的蛇毒对肝肺有一定毒性作用，但为可逆性；低剂量无毒性，现用的临床治疗剂量是非常安全的。
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4 存在的问题及应用前景
我国南方的眼镜蛇毒资源丰富，在蛇毒抗肿瘤方面的研究已达国际先进水平。但蛇毒抗癌的确切机制尚不清楚；目前临床治疗试验多采用粗毒制剂口服，影响疗效评价。
我们对眼镜蛇毒的抗白血病作用进行了较为深入的研究(材料待发表)，发现其M组份不仅对耐药的K562细胞株有杀伤作用，而且与阿霉素有协同抗瘤作用。若与化疗药物同时使用，可能会提高化疗效果。我们拟应用进一步纯化后的组份C静注制剂进行临床试用，以验证它在这方面的药效。
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11 罗伯成，王存川，杨冠群等.口服眼镜蛇毒抑制小鼠肿瘤的研究.中华实验外 科杂志，1993；1：31～32
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(收稿：1999-05-29), 百拇医药