PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因
作者：张文 汤郡 梁希若 马炳南 平宇
单位：广州医学院微生物学与免疫学教研室，广州 510182
关键词：PCR克隆；EB病毒；潜伏膜蛋白-1；pcDNA3.1质粒
广州医学院学报990305
提要 目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白-1重组表达质粒。方法：PCR克隆技术，即用PCR方法从B95-8细胞中钓出EB病毒LMP1基因DNA序列，然后定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中，以此构建成pcDNA3.1-LMP1重组质粒。结果：经酶切鉴定，确定已获得重组质粒pcDNA3.1-LMP1。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了EB病毒LMP1基因。
中图分类号 R394.8
Cloning of the Latent Membrane Protein-1
, http://www.100md.com
Gene of Epstein-Barr Virus
Zhang Wen, Tang Jun, Liang Xiruo, et al
(Depantment of Immunology ＆ Microbiology,Guangzhou
Medical College,Guangzhou 510182)
Objective:To construct a recombinant plasmid with expression of latent membrane protein-1(LMP-1) of Epstein-Barr Virus(EBV).Methods:With PCR cloning technique,the full length of EBV LMP-1 gene from B95-8 cells was amplified and then cloned directionally into vector plasmid pc DNA3.1,thus the recombinant plasmid pc DNA3.1 -LMP-1 was constructed.Results: By restriction enzyme digestion, it was confirmed that the recombinant plasmid pcDNA3.1-LMP-1 had been successfully acquired.
, 百拇医药
Key Words PCR Cloning；Epstein-Barr Virus；Latent membrane protein-1；pc DNA3.1
EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)是Epstein和Barr于1964年首先从非洲Burkitt淋巴瘤培养细胞中发现的。它是一种人类致瘤性疱疹病毒，在全球广为分布，对人群的感染率很高，主要呈潜伏感染形式，并可伴随终生。已证明EBV与传染性单核细胞增多症(IM)、Burkitt淋巴瘤(BL)、人鼻咽癌(NPC)及非洲儿童淋巴瘤(BL)的发生密切相关。近来还证明，EBV与口腔腺体肿瘤、胸腺瘤、胃肠癌、平滑肌肉瘤、霍杰金病(HD)、T细胞淋巴瘤和器官移植后淋巴瘤有关[1]。其中人类NPC的发生有很大的地域范围特点，是东南亚国家和我国南方包括广东、广西、香港、台湾等地常见的恶性肿瘤，大量研究表明EBV与人NPC的发生有着密切关系。EBV在NPC细胞中主要以持续潜伏感染状态存在，以编码表达潜伏膜蛋白-1(Latent membrane protein-1,LMP-1)、LMP2A、LMP2B和EBV核抗原-1(EBV nuclear antigen-1,EBNA-1)为特点[2]。而LMP1是一个重要的潜伏基因，已被认为是EBV的一种癌基因，它在EBV导致NPC的发生中起着重要作用，在学术上引起了学者们的广泛关注。
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LMP1基因(又称为BNLF-1基因)[3]，位于EBV基因组U5-TR区的BamHI Nhet区域内，由三个外显子组成。该基因编码的LMP1是完整的膜蛋白，分子量为60KD，分胞浆区N端、跨膜区与胞浆区C端三部分组成，胞浆区N端由24个氨基酸残基组成，跨膜区由5个短的反转结构分开而形成6个不同的跨膜疏水区组成，胞浆区C端由200个氨基酸残基组成。LMP1的阳性表达率在NPC病例中约为65%[4]，而在正常鼻咽组织中则极少见，并且LMP1蛋白能刺激机体产生LMP1特异性细胞毒性T细胞(CTL)[5]与特异性抗体，在机体抗病毒感染中发挥重要作用。本实验的目的是用PCR定向克隆技术，构建pcDNA3.1-LMP1重组表达质粒，为其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞中进行表达及制备LMP1基因疫苗打下基础。
1 材料与方法
1.1 细胞株，菌种，质粒
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B95-8细胞：香港中文大学微生物系惠赠，由本教研室传代保存；菌种E.coliJM109:为本教研室常用菌株；质粒pcDNA3.1：美国GeneBridge生物技术实验室钟平宇博士惠赠，为真核细胞表达载体，含CMV启动子。
1.2 主要试剂及工具酶类
Taq DNA多聚酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I与BamH I(德国Boehringer Mannheim公司)，dNTPs(美国Gibco公司)、低熔点琼脂糖(进口分装，购自真达公司)，PCR Marker、λDNA/HindIII+EcoRI分子量Marker、琼脂糖(华美生物工程公司)RPMI1640(GIBCOBRL公司)，小牛血清(广州市畜牧场)，胰蛋白胨、酵母浸出液(英国Oxoid公司)，其它生化试剂(分别购自国内相应试剂公司，均为分析纯级)。
1.3 引物设计与PCR
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根据LMP1 DNA序列，设计并合成一对引物，上游引物：5′…CGC GGATCC ATG GAA CAC GAC CTT GAG AGG…3′；下游引物：5′…CCG GAATTC TTA GTC ATA GTA GCT TAG CTG…3′。在上游引物中引入了一个BamH I酶切位点，在下游引物中引入了一个EcoR I酶切位点。经计算机模拟分析，引物对内部不自身互补，不能自身回折形成发夹结构。引物由美国GeneBridge生物技术实验室合成。
参照分子克隆常规方法[6]提取细胞DNA作为模板，并建立PCR反应体系，在ThermojeT PCR仪(型号：JOYOR)上进行PCR，反应条件为：①94℃预变性7min；②94℃变性45秒，62℃退火35秒，70℃延伸1min共进行10个循环；③94℃变性45秒，62℃退火35秒，70℃延伸1min5秒/循环，共进行25个循环；④70℃延伸7min。取5ulPCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳。
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1.4 PCR产物的克隆[7]
将PCR产物按常规方法进行纯化，然后用BamH I和EcoR I进行酶切，经低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法回收目的基因，并纯化。同时，对质粒pcDNA3.1进行同样双酶切，同法回收和纯化大片段。然后将质粒DNA大片段与目的基因以1∶3的摩尔比混合，用T4DNA连结酶16℃作用12h进行连接反应，取连接物转化入大肠杆菌JM109感受态菌中，筛选重组克隆，制备质粒，与空质粒载体同时电泳，找出落后质粒，用BamH I和EcoR I进行酶切鉴定。
2 结果
2.1 EB病毒LMP1基因的PCR扩增
取5ulPCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，结果显示扩增出1条约1.3kb的DNA片段，与预期片段相符(见图1)。
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图1 EB病毒LMP1基因的PCR扩增电泳结果
2.2 EB病毒LMP1基因的克隆与鉴定
用BamH I和EcoR I内切酶消化PCR产物后，定向克隆到真核表达载体pcDNA 3.1中，构建成重组质粒pcDNA3.1-LMP1。经BamH I和EcoR I双酶切释放约1.3kb的插入片段及5.4kb的载体片段(见图2)，证明LMP1基因克隆成功。图3示构建后的重组质粒pcDNA3.1-LMP1的结构图谱，外源基因的表达由启动子PCMV驱动；表达质粒另含一新霉素抗性基因Neo，便于筛选阳性克隆。
图2 pcDNA3.1-LMP1表达质粒的酶切鉴定
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图3 pcDNA3.1-LMP1重组质粒图谱
3 讨论
鼻咽癌是我国南方与东南亚地区常见的肿瘤，并是该地区常见的肿瘤死因之一，因此NPC的防治研究很受重视。近年来，在有关EBV与NPC的关系研究中，许多学者对EBV编码的LMP1进行了大量研究，并取得了可喜的研究结果，使NPC的病因学与防治研究达到了一个新的高度。
LMP1在NPC组织中有大量表达(表达率为65%)，可诱导bc1-2的超表达而保护NPC细胞免于凋亡，诱导粘附分子LFA3、ICAM1的更高表达而参与炎症反应，能刺激机体产生LMP1特异性细胞毒性T细胞(CTL)与特异性抗体，并且从不同地域来源、不同分化程度的NPC组织中，分离得到的各EBV株LMP1基因结构与致癌性与B95-8细胞中的LMP1基因比较，存在一定区别，表现为致癌性增加而免疫原性很低。如Cheung等[8]报道的一个特征性LMP1基因型：带有30bp缺失、外显子3的N端有几个单一碱基突变，实验表明它能诱导上皮细胞的更高恶性度转化，在鼠肿瘤逃脱免疫排斥模型中表现出非免疫原性。大多数学者认为NPC细胞从免疫监视中逃脱最主要是由于NPC病人NK细胞的活性降低和/或特殊变异LMP1的非免疫原性[3]所致。说明LMP1在NPC的发生中起重要作用，构建LMP1基因疫苗对于探索基因免疫治疗人类NPC有重要实际意义和理论意义。
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本研究的目的在于构建EB病毒LMP1基因的真核表达载体，为制备EB病毒LMP1基因疫苗作准备，亦为进一步研究其免疫学效应打下基础或为进一步研究LMP1蛋白奠定基础。我们通过设计一对引物，用PCR克隆技术将LMP1成功地克隆到pcDNA3.1真核表达载体中，酶切鉴定结果表明，真核表达质粒pcDNA3.1-LMP1构建成功。
基因疫苗(gene vaccine)[9],又称为核酸疫苗或DNA疫苗，是近年发展起来的新型疫苗，它是指含有编码抗原基因的真核表达质粒，经直接接种体内后，可被体细胞摄取、并表达出相应的抗原，然后激发机体产生保护性免疫。基因疫苗的兴起被誉为″第三次疫苗革命″，与传统疫苗相比，基因疫苗具有最为突出的优点：它能通过不同的途径诱导机体产生CD8+细胞毒性T细胞(CTL)及特异性中和抗体，而具有预防和治疗作用，在控制病毒感染、抗肿瘤免疫等方面起着重要作用。近年来基因疫苗的研究已取得了长足的进展。纪志武等[9]已对LMP基因免疫进行了初步研究，免疫小鼠后产生了特异性抗LMP抗体。
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用于真核细胞表达的载体，一般要注意以下几个方面：合适的启动子、增强子、最佳的翻译起始序列、mRNA的终止信号、mRNA的稳定性、基因表达产物的修饰、结构以及细胞内定位等。基因疫苗的载体质粒多以pBR322或pUC质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ori)，能在大肠杆菌内高效稳定地复制，并能在真核细胞中表达外源基因产物。本实验所用质粒pcDNA3.1为改进的pcDNA3质粒，带有新霉素抗性基因Neo,在SV40启动子驱动下可在真核细胞中表达，其编码产物为氨基糖苷磷酸转移酶(APH)，能使新霉类似物G418(Geneticin)失活，故用G418筛选可获得导入有表达载体的阳性细胞克隆；在pcDNA3.1质粒的多克隆位点上游有一个PCMV启动子，插入到多克隆位点的外源基因在该启动子驱动下可获得有效表达；还带有Ampr，可用于阳性克隆菌株的筛选。
一对PCR产物的5′端分别引入两个不同的限制性内切酶位点，可以进行PCR产物的定向克隆，以提高克隆效率；同时需引入2～3个保护碱基，以确保酶对特异位点的正确识别。本研究设计引物时，分别在两端设计了BamH I和EcoR I酶切位点，并且在酶切位点两端加上了3个保护碱基，可确保酶切反应的有效进行。另外，设计的引物中G+C的含量比较高，并且引物长度达30bp，那么相应的退火温度就比较高，根据分子克隆[7]所说，若将退火温度提高到55℃，扩增反应的特异性将提高。经计算分析后，我们选择62℃为本PCR的退火温度，扩增到了特异性条带，表明退火温度选择合适，PCR反应条件控制适宜。
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基金项目：本课题由广东省自然科学基金项目、广东省医学科研项目、广州市教委联合资助
美国GeneBridge生物技术实验室
参考文献
1 邓燕飞综述.EB病毒的分子生物学研究进展.医学综述，1998；4(9)：484～486
2 Cheung ST,Leung SF,Lo KW,et al.Specific latent membrane protein 1 gene sequencesin type l and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyndeal carcinoma in Hong Kong.Int J Cancer,1988；76:399～406
3 Sheu LF,Chen A,Wei YH.Epstein-Barr virus LMP1 modulates the malignant potential of gastric carcinoma cells involving a poptosis.Am J Pathol,1998；152(1):63～74
, 百拇医药
4 Fahreus R,Fu HL,Ernberg I,et al.Expression of Epstein-Barr virus-encoded proteins in nasopharyngeal carcinoma.Int J Cancer,1988；42:329
5 khanna R,Burrows SR,Nicholls J,et al.Identication of cytotoxic T cell epitopes within Epstein-Barr virus(EBV) onco gene latent membrane protein 1(LMP1):evidence for HLA A2 supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cell by LMP1-specific cytotoxic T 1ymphocytes.Eur J Immunol,1998；28:451～458
, 百拇医药
6 Sambrook J,Fritsch Ef,Maniatis T.Molecular cloning,a labor atory mannua1.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,1989:82
7 Cheung ST,Lo KW,Leung SF,et al.Prevelence of LMP1 deletion variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma and gastric tumors in Hong Kong.Int J Cancer,1996；66:711～712
8 Dieffenbach cw,Dveksler.PCR Primer,a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995:537
9 Donnelly JJ.Ulmer JB and Liu MA.DNA Vaccine.Life sciences,1997；60(3):163～172
10 纪志武，臧卫东，谈浪逐等.Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因免疫的初步研究.病毒学报，1998；14(2)：139～143
(收稿：1999-05-29), 百拇医药
单位：广州医学院微生物学与免疫学教研室，广州 510182
关键词：PCR克隆；EB病毒；潜伏膜蛋白-1；pcDNA3.1质粒
广州医学院学报990305
提要 目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白-1重组表达质粒。方法：PCR克隆技术，即用PCR方法从B95-8细胞中钓出EB病毒LMP1基因DNA序列，然后定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中，以此构建成pcDNA3.1-LMP1重组质粒。结果：经酶切鉴定，确定已获得重组质粒pcDNA3.1-LMP1。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了EB病毒LMP1基因。
中图分类号 R394.8
Cloning of the Latent Membrane Protein-1
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Gene of Epstein-Barr Virus
Zhang Wen, Tang Jun, Liang Xiruo, et al
(Depantment of Immunology ＆ Microbiology,Guangzhou
Medical College,Guangzhou 510182)
Objective:To construct a recombinant plasmid with expression of latent membrane protein-1(LMP-1) of Epstein-Barr Virus(EBV).Methods:With PCR cloning technique,the full length of EBV LMP-1 gene from B95-8 cells was amplified and then cloned directionally into vector plasmid pc DNA3.1,thus the recombinant plasmid pc DNA3.1 -LMP-1 was constructed.Results: By restriction enzyme digestion, it was confirmed that the recombinant plasmid pcDNA3.1-LMP-1 had been successfully acquired.
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Key Words PCR Cloning；Epstein-Barr Virus；Latent membrane protein-1；pc DNA3.1
EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)是Epstein和Barr于1964年首先从非洲Burkitt淋巴瘤培养细胞中发现的。它是一种人类致瘤性疱疹病毒，在全球广为分布，对人群的感染率很高，主要呈潜伏感染形式，并可伴随终生。已证明EBV与传染性单核细胞增多症(IM)、Burkitt淋巴瘤(BL)、人鼻咽癌(NPC)及非洲儿童淋巴瘤(BL)的发生密切相关。近来还证明，EBV与口腔腺体肿瘤、胸腺瘤、胃肠癌、平滑肌肉瘤、霍杰金病(HD)、T细胞淋巴瘤和器官移植后淋巴瘤有关[1]。其中人类NPC的发生有很大的地域范围特点，是东南亚国家和我国南方包括广东、广西、香港、台湾等地常见的恶性肿瘤，大量研究表明EBV与人NPC的发生有着密切关系。EBV在NPC细胞中主要以持续潜伏感染状态存在，以编码表达潜伏膜蛋白-1(Latent membrane protein-1,LMP-1)、LMP2A、LMP2B和EBV核抗原-1(EBV nuclear antigen-1,EBNA-1)为特点[2]。而LMP1是一个重要的潜伏基因，已被认为是EBV的一种癌基因，它在EBV导致NPC的发生中起着重要作用，在学术上引起了学者们的广泛关注。
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LMP1基因(又称为BNLF-1基因)[3]，位于EBV基因组U5-TR区的BamHI Nhet区域内，由三个外显子组成。该基因编码的LMP1是完整的膜蛋白，分子量为60KD，分胞浆区N端、跨膜区与胞浆区C端三部分组成，胞浆区N端由24个氨基酸残基组成，跨膜区由5个短的反转结构分开而形成6个不同的跨膜疏水区组成，胞浆区C端由200个氨基酸残基组成。LMP1的阳性表达率在NPC病例中约为65%[4]，而在正常鼻咽组织中则极少见，并且LMP1蛋白能刺激机体产生LMP1特异性细胞毒性T细胞(CTL)[5]与特异性抗体，在机体抗病毒感染中发挥重要作用。本实验的目的是用PCR定向克隆技术，构建pcDNA3.1-LMP1重组表达质粒，为其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞中进行表达及制备LMP1基因疫苗打下基础。
1 材料与方法
1.1 细胞株，菌种，质粒
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B95-8细胞：香港中文大学微生物系惠赠，由本教研室传代保存；菌种E.coliJM109:为本教研室常用菌株；质粒pcDNA3.1：美国GeneBridge生物技术实验室钟平宇博士惠赠，为真核细胞表达载体，含CMV启动子。
1.2 主要试剂及工具酶类
Taq DNA多聚酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I与BamH I(德国Boehringer Mannheim公司)，dNTPs(美国Gibco公司)、低熔点琼脂糖(进口分装，购自真达公司)，PCR Marker、λDNA/HindIII+EcoRI分子量Marker、琼脂糖(华美生物工程公司)RPMI1640(GIBCOBRL公司)，小牛血清(广州市畜牧场)，胰蛋白胨、酵母浸出液(英国Oxoid公司)，其它生化试剂(分别购自国内相应试剂公司，均为分析纯级)。
1.3 引物设计与PCR
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根据LMP1 DNA序列，设计并合成一对引物，上游引物：5′…CGC GGATCC ATG GAA CAC GAC CTT GAG AGG…3′；下游引物：5′…CCG GAATTC TTA GTC ATA GTA GCT TAG CTG…3′。在上游引物中引入了一个BamH I酶切位点，在下游引物中引入了一个EcoR I酶切位点。经计算机模拟分析，引物对内部不自身互补，不能自身回折形成发夹结构。引物由美国GeneBridge生物技术实验室合成。
参照分子克隆常规方法[6]提取细胞DNA作为模板，并建立PCR反应体系，在ThermojeT PCR仪(型号：JOYOR)上进行PCR，反应条件为：①94℃预变性7min；②94℃变性45秒，62℃退火35秒，70℃延伸1min共进行10个循环；③94℃变性45秒，62℃退火35秒，70℃延伸1min5秒/循环，共进行25个循环；④70℃延伸7min。取5ulPCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳。
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1.4 PCR产物的克隆[7]
将PCR产物按常规方法进行纯化，然后用BamH I和EcoR I进行酶切，经低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法回收目的基因，并纯化。同时，对质粒pcDNA3.1进行同样双酶切，同法回收和纯化大片段。然后将质粒DNA大片段与目的基因以1∶3的摩尔比混合，用T4DNA连结酶16℃作用12h进行连接反应，取连接物转化入大肠杆菌JM109感受态菌中，筛选重组克隆，制备质粒，与空质粒载体同时电泳，找出落后质粒，用BamH I和EcoR I进行酶切鉴定。
2 结果
2.1 EB病毒LMP1基因的PCR扩增
取5ulPCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，结果显示扩增出1条约1.3kb的DNA片段，与预期片段相符(见图1)。
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图1 EB病毒LMP1基因的PCR扩增电泳结果
2.2 EB病毒LMP1基因的克隆与鉴定
用BamH I和EcoR I内切酶消化PCR产物后，定向克隆到真核表达载体pcDNA 3.1中，构建成重组质粒pcDNA3.1-LMP1。经BamH I和EcoR I双酶切释放约1.3kb的插入片段及5.4kb的载体片段(见图2)，证明LMP1基因克隆成功。图3示构建后的重组质粒pcDNA3.1-LMP1的结构图谱，外源基因的表达由启动子PCMV驱动；表达质粒另含一新霉素抗性基因Neo，便于筛选阳性克隆。
图2 pcDNA3.1-LMP1表达质粒的酶切鉴定
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图3 pcDNA3.1-LMP1重组质粒图谱
3 讨论
鼻咽癌是我国南方与东南亚地区常见的肿瘤，并是该地区常见的肿瘤死因之一，因此NPC的防治研究很受重视。近年来，在有关EBV与NPC的关系研究中，许多学者对EBV编码的LMP1进行了大量研究，并取得了可喜的研究结果，使NPC的病因学与防治研究达到了一个新的高度。
LMP1在NPC组织中有大量表达(表达率为65%)，可诱导bc1-2的超表达而保护NPC细胞免于凋亡，诱导粘附分子LFA3、ICAM1的更高表达而参与炎症反应，能刺激机体产生LMP1特异性细胞毒性T细胞(CTL)与特异性抗体，并且从不同地域来源、不同分化程度的NPC组织中，分离得到的各EBV株LMP1基因结构与致癌性与B95-8细胞中的LMP1基因比较，存在一定区别，表现为致癌性增加而免疫原性很低。如Cheung等[8]报道的一个特征性LMP1基因型：带有30bp缺失、外显子3的N端有几个单一碱基突变，实验表明它能诱导上皮细胞的更高恶性度转化，在鼠肿瘤逃脱免疫排斥模型中表现出非免疫原性。大多数学者认为NPC细胞从免疫监视中逃脱最主要是由于NPC病人NK细胞的活性降低和/或特殊变异LMP1的非免疫原性[3]所致。说明LMP1在NPC的发生中起重要作用，构建LMP1基因疫苗对于探索基因免疫治疗人类NPC有重要实际意义和理论意义。
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本研究的目的在于构建EB病毒LMP1基因的真核表达载体，为制备EB病毒LMP1基因疫苗作准备，亦为进一步研究其免疫学效应打下基础或为进一步研究LMP1蛋白奠定基础。我们通过设计一对引物，用PCR克隆技术将LMP1成功地克隆到pcDNA3.1真核表达载体中，酶切鉴定结果表明，真核表达质粒pcDNA3.1-LMP1构建成功。
基因疫苗(gene vaccine)[9],又称为核酸疫苗或DNA疫苗，是近年发展起来的新型疫苗，它是指含有编码抗原基因的真核表达质粒，经直接接种体内后，可被体细胞摄取、并表达出相应的抗原，然后激发机体产生保护性免疫。基因疫苗的兴起被誉为″第三次疫苗革命″，与传统疫苗相比，基因疫苗具有最为突出的优点：它能通过不同的途径诱导机体产生CD8+细胞毒性T细胞(CTL)及特异性中和抗体，而具有预防和治疗作用，在控制病毒感染、抗肿瘤免疫等方面起着重要作用。近年来基因疫苗的研究已取得了长足的进展。纪志武等[9]已对LMP基因免疫进行了初步研究，免疫小鼠后产生了特异性抗LMP抗体。
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用于真核细胞表达的载体，一般要注意以下几个方面：合适的启动子、增强子、最佳的翻译起始序列、mRNA的终止信号、mRNA的稳定性、基因表达产物的修饰、结构以及细胞内定位等。基因疫苗的载体质粒多以pBR322或pUC质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ori)，能在大肠杆菌内高效稳定地复制，并能在真核细胞中表达外源基因产物。本实验所用质粒pcDNA3.1为改进的pcDNA3质粒，带有新霉素抗性基因Neo,在SV40启动子驱动下可在真核细胞中表达，其编码产物为氨基糖苷磷酸转移酶(APH)，能使新霉类似物G418(Geneticin)失活，故用G418筛选可获得导入有表达载体的阳性细胞克隆；在pcDNA3.1质粒的多克隆位点上游有一个PCMV启动子，插入到多克隆位点的外源基因在该启动子驱动下可获得有效表达；还带有Ampr，可用于阳性克隆菌株的筛选。
一对PCR产物的5′端分别引入两个不同的限制性内切酶位点，可以进行PCR产物的定向克隆，以提高克隆效率；同时需引入2～3个保护碱基，以确保酶对特异位点的正确识别。本研究设计引物时，分别在两端设计了BamH I和EcoR I酶切位点，并且在酶切位点两端加上了3个保护碱基，可确保酶切反应的有效进行。另外，设计的引物中G+C的含量比较高，并且引物长度达30bp，那么相应的退火温度就比较高，根据分子克隆[7]所说，若将退火温度提高到55℃，扩增反应的特异性将提高。经计算分析后，我们选择62℃为本PCR的退火温度，扩增到了特异性条带，表明退火温度选择合适，PCR反应条件控制适宜。
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基金项目：本课题由广东省自然科学基金项目、广东省医学科研项目、广州市教委联合资助
美国GeneBridge生物技术实验室
参考文献
1 邓燕飞综述.EB病毒的分子生物学研究进展.医学综述，1998；4(9)：484～486
2 Cheung ST,Leung SF,Lo KW,et al.Specific latent membrane protein 1 gene sequencesin type l and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyndeal carcinoma in Hong Kong.Int J Cancer,1988；76:399～406
3 Sheu LF,Chen A,Wei YH.Epstein-Barr virus LMP1 modulates the malignant potential of gastric carcinoma cells involving a poptosis.Am J Pathol,1998；152(1):63～74
, 百拇医药
4 Fahreus R,Fu HL,Ernberg I,et al.Expression of Epstein-Barr virus-encoded proteins in nasopharyngeal carcinoma.Int J Cancer,1988；42:329
5 khanna R,Burrows SR,Nicholls J,et al.Identication of cytotoxic T cell epitopes within Epstein-Barr virus(EBV) onco gene latent membrane protein 1(LMP1):evidence for HLA A2 supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cell by LMP1-specific cytotoxic T 1ymphocytes.Eur J Immunol,1998；28:451～458
, 百拇医药
6 Sambrook J,Fritsch Ef,Maniatis T.Molecular cloning,a labor atory mannua1.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,1989:82
7 Cheung ST,Lo KW,Leung SF,et al.Prevelence of LMP1 deletion variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma and gastric tumors in Hong Kong.Int J Cancer,1996；66:711～712
8 Dieffenbach cw,Dveksler.PCR Primer,a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995:537
9 Donnelly JJ.Ulmer JB and Liu MA.DNA Vaccine.Life sciences,1997；60(3):163～172
10 纪志武，臧卫东，谈浪逐等.Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因免疫的初步研究.病毒学报，1998；14(2)：139～143
(收稿：1999-05-29), 百拇医药