维甲酸对人体肝癌细胞几种酶活性的影响
作者：黄炜 陈涛 廖兆全 黄济群
单位：黄炜 廖兆全 黄济群 广州医学院肿瘤生化研究室，广州 510182；陈涛 第一附属医院中心实验室，广州 510120
关键词：人肝癌细胞；维甲酸；碱性磷酸酶；酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶；γ-谷氨酰转肽酶
广州医学院学报990302
提要 目的：探讨细胞分化诱导剂全反式维甲酸对人体肝癌细胞几种酶活性的影响。方法：用10μmol/L全反式维甲酸处理BEL-7402人肝癌细胞，观察细胞碱性磷酸酶(ALP)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性以及甲胎蛋白(AFP)分泌量。结果：10μmoI/L全反式维甲酸使反映肝细胞恶变的指标AFP分泌量和γ-GT比 活力明显下降(P<0.05或<0.01)，ALP比活力和反映肝细胞分化的TAT比活力则明显升高(P<0.01或<0.05)。这些酶学指标与AFP分泌量的变化有助于综合反映肝癌细胞的再分化。
, 百拇医药
中图分类号 R735.7
The Effect of Retinoic Acid on the Activities
of Several Enzymes of BEL-7402
Human Hepatocarcinoma Cells
Huang Wei1,Chen Tao2,Liao Zhaoquan1, et al
(1Tumor Biochemistry Research Unit.Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182；
2Central Laboratory of the First Affiliated Hospital,Guangzhou 510120)
, 百拇医药
Objective:To study the effect of all trans-retinoic acid (ATRA)on the activities of several enzymes of human hepatocarcinoma cells. Methods: The BEL-7402 human hepatocarcinoma cells were treated with ATRA,and the activities of alkaline phosphatase (ALP),tyrosine-α-ketoglutarate transferase(TAT),γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT),and the secretory amount of alpha-fetoprotein (AFP) of the cells, were determined.Results: Under the action of ATRA in the concentration of 10 μmol/L,the secretory amount of AFP and the specific activity of γ-GT, which reflect the canceration of hepatocytes, decreased (P<0.05 and P<0.01,respectively)； whereas the specific activities of ALP and TAT, which indicate the differentiation of hepatocarcinoma cells, increased(P<0.01 and P<0.05,respectively).Conclusion: The observation of these enzymological indexes and the secretory amount of AFP may be a synthetical reflection of the redifferentiation of hepatocarcinoma cells.
, 百拇医药
Key words Human hepatocarcinoma；Retinoic acid；Alkaline phosphatase；Tyrosine-α-ketoglutarate transferase；γ-glutamyl transpeptidase
诱导癌细胞再分化是癌症研究的一个重要课题。维甲酸(又称视黄酸，RA)可诱导多种肿瘤细胞分化并已试用于癌症的防治[1，2]，但诱导人肝癌细胞分化的报道很少。1990年上海医科大学艾兆伟等人[3]报道全反式维甲酸可诱导SMMC-7721人肝癌细胞某些恶性表型逆转，本研究进一步探讨全反式维甲酸对BEL-7402人肝癌细胞某些表型的影响，包括对细胞碱性磷酸酶(ALP)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)比活力和甲胎蛋白(AFP)分泌量的影响，为肝癌细胞分化研究提供进一步的资料。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，全反式维甲酸为SIGMA公司产品，AFP放免试剂盒由中国原子能科学研究院提供。
1.2 细胞株及培养条件 BEL-7402人肝癌细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，接种于含10%小牛血清pH7.4的RPMI 1640培养基中，每瓶接种1×105个细胞，37℃密闭培养。选用诱导BEL-7402细胞分化最适浓度10μmol/L RA进行实验，RA先溶于二甲亚砜中，然后于细胞培养24h后加入培养液至所需浓度，对照组则不加RA，仅加入0.02%二甲亚砜溶剂。每组每天各设三个平行样品，实验组和对照组每天换含RA或不含RA的培养液，连续6天。
1.3 测定方法 每天取实验组和对照组各3瓶，培养液经4000rpm离心5min后取上清液测定AFP，收集细胞在含0.5%Triton X-100的0.05mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液中超声(106Hz,1min)破碎细胞，制成细胞匀浆，4℃1000rpm离心5min，取上清测定酶活性及蛋白质含量，ALP及γ-GT按动力学方法测定，TAT按Kohli等人改良的方法[4]测定，蛋白质按Lowry等人的方法[5]测定。
, 百拇医药
2 结果
2.1 维甲酸对BEL-7402细胞碱性磷酸酶活性的影响
结果见表1和图1所示，从中可见RA组ALP比活力逐日升高，各处理天数ALP比活力均显著高于对照组(t检验，P<0.01)
表1 维甲酸对BEL-7402细胞ALP活性的影响 处理时间
(天)
ALP比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
1
, 百拇医药
4.0±0.9
15.0±0.5
<0.01
2
6.6±0.6
27.8±1.0
<0.01
3
11.0±2.3
31.2±1.2
<0.01
4
32.0±1.7
, 百拇医药
75.3±3.3
<0.01
5
39.5±3.5
69.3±3.0
<0.01
6
40.4±2.8
85.6±1.5
<0.01
图1 RA对肝癌细胞ALP活性的影响
, 百拇医药
2.2 维甲酸对BEL-7402细胞酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶活性的影响
结果见表2和图2所示，从中可见RA组TAT比活力逐日上升，第5天达高峰，对照组则第3天达高峰，以后逐日下降，各处理天数RA组TAT比活力均高于对照组，第4天起差异非常显著(t检验，P<0.01)。
表2 维甲酸对BEL-7420细胞TAT活性的影响 处理时间
(天)
TAT比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
1
, 百拇医药
2.0±0.5
2.9±0.6
>0.05
2
2.6±0.5
3.2±1.0
>0.05
3
2.9±0.8
3.5±1.2
>0.05
4
2.6±0.1
, 百拇医药
4.0±3.3
<0.01
5
2.3±3.5
4.2±3.0
<0.01
6
1.7±2.8
3.7±1.5
<0.01
图2 RA对肝癌细胞TAT活性的影响
, http://www.100md.com
2.3 维甲酸对BEL-7402细胞γ-谷氨酰转肽酶活性的影响
结果见表3和图3所示，从中可见，RA组γ-GT比活力逐日下降，对照组则先上升后缓慢下降，从第2天起，同一天数RA组γ-GT比活力均显著低于对照组(P<0.01或<0.05)。
表3 维甲酸对BEL-7402细胞γ-GT
活力的影响 处理时间
(天)
γ-GT比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
, http://www.100md.com
1
10.4±1.5
9.1±1.0
>0.05
2
12.0±1.0
7.5±0.8
>0.05
3
14.5±1.4
6.6±1.0
<0.01
4
, 百拇医药
13.9±0.1
5.8±3.0
<0.01
5
12.5±0.3
4.2±1.0
<0.01
6
11.4±2.8
4.5±0.4
<0.01
, http://www.100md.com
图3 RA对肝癌细胞γ-GT活性的影响
2.4 维甲酸对BEL-7402细胞AFP分泌量的影响
结果见表4和图4，可见各组AFP分泌量逐日下降，但同一天数RA处理组AFP分泌量均低于对照组，从第3天起差异显著(t检验，P<0.05)。
表4 维甲酸对BEL-7402细胞AFP分泌量的影响 处理时间
(天)
AFP分泌量(ng/106细胞)
P
对照组
10μmol/LRA组
, 百拇医药
1
33.2±3.6
27.0±5.1
>0.05
2
26.2±1.0
22.2±0.2
>0.05
3
23.2±1.0
18.0±1.0
<0.05
4
, 百拇医药
20.2±0.5
15.8±0.9
<0.05
5
15.5±1.3
11.2±1.0
<0.05
6
11.6±0.1
6.9±0.3
<0.05
, http://www.100md.com
图4 RA对肝癌细胞AFP分泌量的影响
3 讨论
分化异常是癌细胞最重要的生物学特性，诱导癌细胞向正常方向分化是癌症分化治疗的基础。判断恶性细胞分化，除了形态学的改变外，细胞分化的特征性生物化学变化常作为重要的判断依据，如血红蛋白的合成是判断红白血病细胞分化最重要的标志，反映脱氢酶活性的硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验是判断早幼粒白血病细胞分化最常用的客观指标。原发性肝癌是我国的高发癌症，探讨原发性肝癌细胞的分化指标是寻找肝癌细胞分化诱导剂的前提，但这方面的研究不多。90年代初艾兆伟等人[3]用公认的细胞分化诱导剂全反式维甲酸诱导SMMC-7721人肝癌细胞恶性表型逆转，发现肝细胞恶性指标AFP分泌量及γ-GT比活力均明显下降，而反映肝细胞分化的TAT比活力则明显升高。本研究在另一种人肝癌细胞株BEL-7402细胞也发现相同的变化，全反式维甲酸处理不同的人肝癌细胞系出现AFP、γ-GT和TAT活力变化的相同规律，本文作者用另一种公认的细胞分化诱导剂丁酸钠处理BEL-7402细胞也发现相似的变化规律[6]，说明这些指标在反映人肝癌细胞分化诱导剂丁酸钠处理BEL-7402细胞也发现相似的变化规律[6]，说明这些指标在反映人肝癌细胞分化或恶性表型逆转上的可靠性。
, 百拇医药
除此之外，鉴于Giani等[7]证明ALP是畸胎瘤细胞分化的标志，Fanjul等[8]发现肝型ALP是人胰腺癌Capan-1细胞系分化的标志，本研究发现全反式维甲酸使BEL-7402细胞ALP比活力显著升高，说明ALP同样能反映人肝癌细胞的分化，而且在全反式维甲酸诱导下此酶比活力上升幅度及变化显著高于TAT，为肝癌细胞再分化增加了一项新的指标，补充和完善了人肝癌细胞分化的指标体系，为诱导肝癌细胞分化的药物筛选提供了又一可用的指标。
近已发现维甲酸诱导分化是通过与细胞核内的特异受体结合，维甲酸-受体复合物作用于DNA的维甲酸反应元件(retinoic acid response element)，进而调控相关基因的表达，ALP、TAT、γ-GT和AFP的上述变化究竟属于何种水平基因表达调控所致，有待进一步探讨。
参考文献
1 Smith MA,Parkinson DE,Cheson BD,et al.Retinoids in cancer therapy.J Clin Oncol,1992；10:839
, http://www.100md.com
2 Vokes EE,Weichselbaum RR,Lippman SM,et al.Head and neck cancer.N Engl J Med,1993；328:184
3 艾兆伟，查锡良，刘毅等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135
4 Kohli KK,Obuch A,Stellwagen RH.Protection of tyrosine aminotransferase against proteolytic digestion by nucleotide derivatives.Biochim Biophys Acta,1988；956:77
5 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem,1951；193:265
, 百拇医药
6 朱文渊，黄炜，黄济群.丁酸钠对BEL-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13：187
7 Giani M,Studer M,Carpani G,et al.Retinoic acid induces liver/bone/kidney-type alkaline phosphatase gene expression in F9 teratocarcinoma cell.Biochem J,1991；274:673
8 Fanjul M,Thevenian M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatase during differentiation of human pancreatic cancer(Capan-1)cell in culture.Biol Cell,1991；73:15
(收稿：1999-07-07), http://www.100md.com
单位：黄炜 廖兆全 黄济群 广州医学院肿瘤生化研究室，广州 510182；陈涛 第一附属医院中心实验室，广州 510120
关键词：人肝癌细胞；维甲酸；碱性磷酸酶；酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶；γ-谷氨酰转肽酶
广州医学院学报990302
提要 目的：探讨细胞分化诱导剂全反式维甲酸对人体肝癌细胞几种酶活性的影响。方法：用10μmol/L全反式维甲酸处理BEL-7402人肝癌细胞，观察细胞碱性磷酸酶(ALP)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性以及甲胎蛋白(AFP)分泌量。结果：10μmoI/L全反式维甲酸使反映肝细胞恶变的指标AFP分泌量和γ-GT比 活力明显下降(P<0.05或<0.01)，ALP比活力和反映肝细胞分化的TAT比活力则明显升高(P<0.01或<0.05)。这些酶学指标与AFP分泌量的变化有助于综合反映肝癌细胞的再分化。
, 百拇医药
中图分类号 R735.7
The Effect of Retinoic Acid on the Activities
of Several Enzymes of BEL-7402
Human Hepatocarcinoma Cells
Huang Wei1,Chen Tao2,Liao Zhaoquan1, et al
(1Tumor Biochemistry Research Unit.Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182；
2Central Laboratory of the First Affiliated Hospital,Guangzhou 510120)
, 百拇医药
Objective:To study the effect of all trans-retinoic acid (ATRA)on the activities of several enzymes of human hepatocarcinoma cells. Methods: The BEL-7402 human hepatocarcinoma cells were treated with ATRA,and the activities of alkaline phosphatase (ALP),tyrosine-α-ketoglutarate transferase(TAT),γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT),and the secretory amount of alpha-fetoprotein (AFP) of the cells, were determined.Results: Under the action of ATRA in the concentration of 10 μmol/L,the secretory amount of AFP and the specific activity of γ-GT, which reflect the canceration of hepatocytes, decreased (P<0.05 and P<0.01,respectively)； whereas the specific activities of ALP and TAT, which indicate the differentiation of hepatocarcinoma cells, increased(P<0.01 and P<0.05,respectively).Conclusion: The observation of these enzymological indexes and the secretory amount of AFP may be a synthetical reflection of the redifferentiation of hepatocarcinoma cells.
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Key words Human hepatocarcinoma；Retinoic acid；Alkaline phosphatase；Tyrosine-α-ketoglutarate transferase；γ-glutamyl transpeptidase
诱导癌细胞再分化是癌症研究的一个重要课题。维甲酸(又称视黄酸，RA)可诱导多种肿瘤细胞分化并已试用于癌症的防治[1，2]，但诱导人肝癌细胞分化的报道很少。1990年上海医科大学艾兆伟等人[3]报道全反式维甲酸可诱导SMMC-7721人肝癌细胞某些恶性表型逆转，本研究进一步探讨全反式维甲酸对BEL-7402人肝癌细胞某些表型的影响，包括对细胞碱性磷酸酶(ALP)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)比活力和甲胎蛋白(AFP)分泌量的影响，为肝癌细胞分化研究提供进一步的资料。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，全反式维甲酸为SIGMA公司产品，AFP放免试剂盒由中国原子能科学研究院提供。
1.2 细胞株及培养条件 BEL-7402人肝癌细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，接种于含10%小牛血清pH7.4的RPMI 1640培养基中，每瓶接种1×105个细胞，37℃密闭培养。选用诱导BEL-7402细胞分化最适浓度10μmol/L RA进行实验，RA先溶于二甲亚砜中，然后于细胞培养24h后加入培养液至所需浓度，对照组则不加RA，仅加入0.02%二甲亚砜溶剂。每组每天各设三个平行样品，实验组和对照组每天换含RA或不含RA的培养液，连续6天。
1.3 测定方法 每天取实验组和对照组各3瓶，培养液经4000rpm离心5min后取上清液测定AFP，收集细胞在含0.5%Triton X-100的0.05mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液中超声(106Hz,1min)破碎细胞，制成细胞匀浆，4℃1000rpm离心5min，取上清测定酶活性及蛋白质含量，ALP及γ-GT按动力学方法测定，TAT按Kohli等人改良的方法[4]测定，蛋白质按Lowry等人的方法[5]测定。
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2 结果
2.1 维甲酸对BEL-7402细胞碱性磷酸酶活性的影响
结果见表1和图1所示，从中可见RA组ALP比活力逐日升高，各处理天数ALP比活力均显著高于对照组(t检验，P<0.01)
表1 维甲酸对BEL-7402细胞ALP活性的影响 处理时间
(天)
ALP比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
1
, 百拇医药
4.0±0.9
15.0±0.5
<0.01
2
6.6±0.6
27.8±1.0
<0.01
3
11.0±2.3
31.2±1.2
<0.01
4
32.0±1.7
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75.3±3.3
<0.01
5
39.5±3.5
69.3±3.0
<0.01
6
40.4±2.8
85.6±1.5
<0.01
图1 RA对肝癌细胞ALP活性的影响
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2.2 维甲酸对BEL-7402细胞酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶活性的影响
结果见表2和图2所示，从中可见RA组TAT比活力逐日上升，第5天达高峰，对照组则第3天达高峰，以后逐日下降，各处理天数RA组TAT比活力均高于对照组，第4天起差异非常显著(t检验，P<0.01)。
表2 维甲酸对BEL-7420细胞TAT活性的影响 处理时间
(天)
TAT比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
1
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2.0±0.5
2.9±0.6
>0.05
2
2.6±0.5
3.2±1.0
>0.05
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2.9±0.8
3.5±1.2
>0.05
4
2.6±0.1
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4.0±3.3
<0.01
5
2.3±3.5
4.2±3.0
<0.01
6
1.7±2.8
3.7±1.5
<0.01
图2 RA对肝癌细胞TAT活性的影响
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2.3 维甲酸对BEL-7402细胞γ-谷氨酰转肽酶活性的影响
结果见表3和图3所示，从中可见，RA组γ-GT比活力逐日下降，对照组则先上升后缓慢下降，从第2天起，同一天数RA组γ-GT比活力均显著低于对照组(P<0.01或<0.05)。
表3 维甲酸对BEL-7402细胞γ-GT
活力的影响 处理时间
(天)
γ-GT比活力(mU/mg蛋白)
P
对照组
10μmol/L RA组
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1
10.4±1.5
9.1±1.0
>0.05
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12.0±1.0
7.5±0.8
>0.05
3
14.5±1.4
6.6±1.0
<0.01
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13.9±0.1
5.8±3.0
<0.01
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12.5±0.3
4.2±1.0
<0.01
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11.4±2.8
4.5±0.4
<0.01
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图3 RA对肝癌细胞γ-GT活性的影响
2.4 维甲酸对BEL-7402细胞AFP分泌量的影响
结果见表4和图4，可见各组AFP分泌量逐日下降，但同一天数RA处理组AFP分泌量均低于对照组，从第3天起差异显著(t检验，P<0.05)。
表4 维甲酸对BEL-7402细胞AFP分泌量的影响 处理时间
(天)
AFP分泌量(ng/106细胞)
P
对照组
10μmol/LRA组
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1
33.2±3.6
27.0±5.1
>0.05
2
26.2±1.0
22.2±0.2
>0.05
3
23.2±1.0
18.0±1.0
<0.05
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20.2±0.5
15.8±0.9
<0.05
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15.5±1.3
11.2±1.0
<0.05
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6.9±0.3
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图4 RA对肝癌细胞AFP分泌量的影响
3 讨论
分化异常是癌细胞最重要的生物学特性，诱导癌细胞向正常方向分化是癌症分化治疗的基础。判断恶性细胞分化，除了形态学的改变外，细胞分化的特征性生物化学变化常作为重要的判断依据，如血红蛋白的合成是判断红白血病细胞分化最重要的标志，反映脱氢酶活性的硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验是判断早幼粒白血病细胞分化最常用的客观指标。原发性肝癌是我国的高发癌症，探讨原发性肝癌细胞的分化指标是寻找肝癌细胞分化诱导剂的前提，但这方面的研究不多。90年代初艾兆伟等人[3]用公认的细胞分化诱导剂全反式维甲酸诱导SMMC-7721人肝癌细胞恶性表型逆转，发现肝细胞恶性指标AFP分泌量及γ-GT比活力均明显下降，而反映肝细胞分化的TAT比活力则明显升高。本研究在另一种人肝癌细胞株BEL-7402细胞也发现相同的变化，全反式维甲酸处理不同的人肝癌细胞系出现AFP、γ-GT和TAT活力变化的相同规律，本文作者用另一种公认的细胞分化诱导剂丁酸钠处理BEL-7402细胞也发现相似的变化规律[6]，说明这些指标在反映人肝癌细胞分化诱导剂丁酸钠处理BEL-7402细胞也发现相似的变化规律[6]，说明这些指标在反映人肝癌细胞分化或恶性表型逆转上的可靠性。
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除此之外，鉴于Giani等[7]证明ALP是畸胎瘤细胞分化的标志，Fanjul等[8]发现肝型ALP是人胰腺癌Capan-1细胞系分化的标志，本研究发现全反式维甲酸使BEL-7402细胞ALP比活力显著升高，说明ALP同样能反映人肝癌细胞的分化，而且在全反式维甲酸诱导下此酶比活力上升幅度及变化显著高于TAT，为肝癌细胞再分化增加了一项新的指标，补充和完善了人肝癌细胞分化的指标体系，为诱导肝癌细胞分化的药物筛选提供了又一可用的指标。
近已发现维甲酸诱导分化是通过与细胞核内的特异受体结合，维甲酸-受体复合物作用于DNA的维甲酸反应元件(retinoic acid response element)，进而调控相关基因的表达，ALP、TAT、γ-GT和AFP的上述变化究竟属于何种水平基因表达调控所致，有待进一步探讨。
参考文献
1 Smith MA,Parkinson DE,Cheson BD,et al.Retinoids in cancer therapy.J Clin Oncol,1992；10:839
, http://www.100md.com
2 Vokes EE,Weichselbaum RR,Lippman SM,et al.Head and neck cancer.N Engl J Med,1993；328:184
3 艾兆伟，查锡良，刘毅等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135
4 Kohli KK,Obuch A,Stellwagen RH.Protection of tyrosine aminotransferase against proteolytic digestion by nucleotide derivatives.Biochim Biophys Acta,1988；956:77
5 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem,1951；193:265
, 百拇医药
6 朱文渊，黄炜，黄济群.丁酸钠对BEL-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13：187
7 Giani M,Studer M,Carpani G,et al.Retinoic acid induces liver/bone/kidney-type alkaline phosphatase gene expression in F9 teratocarcinoma cell.Biochem J,1991；274:673
8 Fanjul M,Thevenian M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatase during differentiation of human pancreatic cancer(Capan-1)cell in culture.Biol Cell,1991；73:15
(收稿：1999-07-07), http://www.100md.com