红桂木凝集素糖蛋白的特征及其糖肽键性质的分析
作者：曾麒燕 周德义 吴耀生 周素芳
单位：曾麒燕 周德义 吴耀生 周素芳 广西医科大学生化教研室 南宁 530021
关键词：红桂木凝集素；糖蛋白；性质
广西医科大学学报990324
摘要 目的：探讨红桂木凝集素(Artocarpus Lengnanensis Lectin,ALL)的糖蛋白特征及其糖肽键类型。方法：经Gal-Sepharose 6B亲和柱层析，从红桂木种子纯化获红桂木凝集素。以链霉蛋白酶将ALL降解，Sephadex G-25层析，分离得糖肽，用化学及物理方法分析单糖组成，以β-消除反应及凝集素结合试验分析糖肽键类型。结果：ALL和糖肽均含氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖；β-消除反应后，240 nm呈明显紫外吸收增加；ALL可与木菠萝凝集素结合。结论：ALL是一种糖蛋白，由两种分子量接近的亚基组成，其糖链与多肽连接类型为O—连接。
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中国图书资料分类法分类号 R932.41
AN ANALYSIS OF GLYCOPROPTEIN CHARACTERISTIC AND THE NATURE OF GLYCOPEPTIDE LINKAGE OF ARTOCARPUS LENGNANENSIS LECTIN
Zeng Qiyan,Zhou Deyi,Wu Yaosheng,et al
Dept.of Biochemistry,Guangxi Medical University，Nanning 530021
Abstract Objective:To study the glycopeptide characteristic and the type of glycopeptide linkage of Artocarpus Lengnanensis Lectin (ALL).Methods:ALL had been purified from the seeds of Artocarpus Lingnanensis by affinity chromatography on Gal-Sepharose 6B,following glycopeptide being purified by Sephadex G-25 chromatography from the digestion of ALL with pronase.The analysis of sugar was performed by chemistry and physics methods,and glycopeptide linkage was analyzed by β-elimination and lectin affinity test.Results:Both of ALL and glycopeptide contain aminogalactose,glucose,mannose,and arabose,and also show apparent increase of UV absorptance at 240 nm,and later,ALL was combined with jacalin.Conclusion:ALL is a glycoprotein which consists of two kinds of subunits whose molecular weights are approximative and the link between sugar chain and peptide is O-glycoside linkage.
, 百拇医药
Key words artocarpus lengnanensis lectin;glycoprptein;characteristic
凝集素是一类具有糖结合专一性,可使多种细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,凝集素的结构分析,是凝集素研究中非常重要的基础工作,对进一步阐明凝集素的生物学特性,扩大凝集素的应用具有重要的作用。桂木是生长于亚热带的乔木,广西桂东南地区有丰富的自然资源,与一些已经报道含凝集素的植物相比,桂木种子所含的红桂木凝集素(ALL)和白桂木凝集素(AHL)的生物活力非常高,且活力稳定,预示它是一种极好的研究材料,也为今后大量生产提供可能性。本文着重对ALL的糖链结构及ALL结合糖蛋白的特点进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料：红桂木种子由广西亚热带作物研究所提供。SIgA:来自初乳,由广西医科大学第一附属医院产科提供。
, 百拇医药
1.2 试剂：Sepharose 6B、甲状腺球蛋白为Pharmacia公司产品。丙烯酰胺、链霉蛋白酶为E.Merck公司产品。其余为国产试剂。
1.3 红桂木凝集素的分离纯化：按照本教研室制备的方法进行。
1.4 糖肽的制备[1]：ALL冻干粉加Tris-HAc缓冲液、Pronase溶液、甲苯,混匀,37℃消化6 d，离心将上清液上Sephadex G-25柱,收集并浓缩含糖峰,冻干备用。
1.5 电泳分析: ALL的不连续PAGE方法见文献[2]；浓度梯度凝胶电泳,参照周德义方法[3]; SDS-PAGE,方法见文献[2]。
1.6 ALL及糖肽的含糖量测定:按硫酸酚法[4]进行。
, 百拇医药
1.7 ALL和糖肽的β消除反应[5]:分别将ALL、糖肽置于0.2 mol/L NaOH 溶液中,45℃保温30 min。测定碱处理前后紫外吸收光谱的变化,另取ALL溶解于0.2 mol/L NaOH(含0.3 mol/L NaBH4),45℃保温24 h,分析碱处理前后氨基酸变化。
1.8 酶标JFL对ALL的结合试验:按郭春祥[6]的HRP标记抗体的过碘酸钠法标记JFL,酶标JFL对ALL的结合试验参考蒋成淦[7]法进行。
1.9 ALL糖肽的单糖组成分析:ALL和糖肽分别经三氟乙酸水解[8]后,进行纸层析。
1.10 ALL的红外光谱:岛津470红外光谱仪,KBr压片。
2 结果
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2.1 糖肽的分离纯化：红桂木种子粉经PBS抽提,60%饱和度硫酸胺沉淀,Gal-Sepharose 6B亲和层析后，获纯化的ALL，ALL经链霉蛋白酶消化后上Sephadex G-25柱,用硫酸酚法测定各管糖含量，茚三酮定性检测各管的氨基酸含量，从图1可看出,糖峰Ⅰ与A280的峰a重合,推测为不完全消化的ALL及残留的链霉蛋白酶产生,糖峰Ⅱ与A280的峰a、b基本分开，故认为糖峰Ⅱ为糖肽峰。
图1 ALL的链霉蛋白酶水解液在Sephadex G-25柱上的洗脱曲线…A280——A490
2.2 电泳分析：经考马斯亮蓝R250染色,ALL的不连续PAGE显示三条区带(图2a),4%～30%浓度梯度PAGE,显示一条蛋白质主带(图2b);ALL的SDS-PAGE同时蛋白和糖染色,分别出现两条蓝染的蛋白质带(图2c)和红染的糖蛋白带(由于染色浅,未拍照出)。
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图2 ALL凝胶电泳(考马斯亮蓝R250染色)
(a)不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳;(b)4%～30%浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳;(c) 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3 ALL和糖肽的含糖量测定：分别取ALL和糖肽6.24、4.86 mg,各溶于1 ml蒸馏水中:按硫酸酚法分别测定糖百分含量为7.0%和45.8%。
2.4 ALL和糖肽β-消除反应：碱处理后的ALL在240 nm处产生明显的吸收(图3),糖肽的紫外吸收光谱变化与ALL类似,氨基酸分析表明,ALL经碱处理后,丝氨酸、苏氨酸残基数减少,而丙氨酸残基数增加(表1),这说明ALL和糖肽均存在O-糖苷键。
图3 碱处理前后的ALL紫外吸收光谱
, 百拇医药
1 -NaOH 2 +NaOH
表1 β消除前后ALL的氨基酸残基数变化 氨基酸
β消除前
β消除后
差异
Ser
38
27
-11
Thr
32
22
-10
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Ala
13
18
+5
2.5 JFL-HRP与ALL的结合试验：经酶标仪检测A450,甲状腺球蛋白、ALL、分泌型IgA及对照孔的A450分别为0.023、0.226、0.102、0.023,以P/N≥2.1为判断标准,可看出JFL可与SigA和ALL结合。
2.6 单糖组成的分析：ALL、糖肽的酸水解样品经纸层析后,与标准糖对照,发现ALL和糖肽的单糖组成均为氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖。
2.7 ALL的红外光谱(IR)
ALL的IR图谱在4000 cm-1～400 cm-1 区间具有糖类物质的一般特征,3415 cm-1～3280 cm-1为糖类羟基的吸收峰;1648 cm-1处为肽链上酰胺羰基的吸收峰;1147 cm-1～1022 cm-1的宽峰为糖分子中C-O键的振动吸收;810 cm-1和870 cm-1的两个小吸收峰表明含有甘露糖;840 cm-1附近有吸收峰表明糖甘键为α-构型。3 讨论
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ALL经不连续PAGE显示三条蛋白质区带，浓度梯度PAGE显示一条均一的蛋白质区带，SDS-PAGE显示两条蛋白区带的结果显示，ALL可能是由一种由两种分子量接近的亚基组成的四聚体，存在同功凝集素,但由于ALL亚基分子量接近，在组成可能的四聚体分子时其分子量必然非常接近，故浓度梯度PAGE无法区别，而只能在不连续PAGE上反映出来。经Schiff试剂染色，证明ALL及两种亚基都是含糖的蛋白质。
糖蛋白的糖链连接有两种方式:N-连接和O-连接.ALL及其糖肽经β-消除反应后在240 nm波长紫外吸收增加，氨基酸分析揭示丝氨酸和苏氨酸残基数减少，证实ALL和糖肽均存在O-糖苷键的存在[9]。丝氨酸和苏氨酸残基数的减少数量可反映多肽中糖链的可能连结点。本文中丝氨酸和苏氨酸的减少数量较ALL可能存在的连结点多，这可能是由于在β-消除反应中,不处于糖残基连结点的丝氨酸或苏氨酸容易受破坏所致。另外，JFL可特异地与含有O-糖苷键的糖蛋白结合[10]，JFL与ALL和SIgA结合，再次证实ALL存在O-糖苷键。
, 百拇医药
国家自然科学资金资助项目 批准号 39260023
参考文献
1 Jacoues B，Stuart K，Shaul K.Structure of the carbohydrate umits of IgE immunoglobulin.J Bio.Chem，1974,249(6):1897～1903
2 何忠效，张树政主编.电泳.北京：科学出版社，1990.37
3 周德义.介绍一种制备管状梯度凝胶的装置.生物化学与生物物理进展,1985,(1):71
4 鲁子贤主编.蛋白质和酶学研究方法.北京：科学出版社，1989.37
5 Planter JJ.Carlson CM.Studoes of Mucin-Type Glycoproteins Anal.Biochem，1975,65:153～163
, 百拇医药
6 郭春祥,郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983,3(2):97～100
7 蒋成淦编著.酶免疫测定法.北京：人民卫生出版社，1984.102
8 Yoshinobu K,Sumihiro H,Yuji K.Structure of sugar chains of Ricin D.J Biochem，1988,103:944～949
9 Downs F，Pigman W.In “Methods in CarbohydrateChemistry” Vol 7.Academic Press.New York，1976.200～201
10 Glen LH，Beverly LT.Lectinaffinity chromatographhy of proteins bearing O-linked oligosaccharides:application of jacalin-agarose.Analitical Biochemistry，1990,188:271～277
收稿日期：1998-04-10, 百拇医药
单位：曾麒燕 周德义 吴耀生 周素芳 广西医科大学生化教研室 南宁 530021
关键词：红桂木凝集素；糖蛋白；性质
广西医科大学学报990324
摘要 目的：探讨红桂木凝集素(Artocarpus Lengnanensis Lectin,ALL)的糖蛋白特征及其糖肽键类型。方法：经Gal-Sepharose 6B亲和柱层析，从红桂木种子纯化获红桂木凝集素。以链霉蛋白酶将ALL降解，Sephadex G-25层析，分离得糖肽，用化学及物理方法分析单糖组成，以β-消除反应及凝集素结合试验分析糖肽键类型。结果：ALL和糖肽均含氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖；β-消除反应后，240 nm呈明显紫外吸收增加；ALL可与木菠萝凝集素结合。结论：ALL是一种糖蛋白，由两种分子量接近的亚基组成，其糖链与多肽连接类型为O—连接。
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中国图书资料分类法分类号 R932.41
AN ANALYSIS OF GLYCOPROPTEIN CHARACTERISTIC AND THE NATURE OF GLYCOPEPTIDE LINKAGE OF ARTOCARPUS LENGNANENSIS LECTIN
Zeng Qiyan,Zhou Deyi,Wu Yaosheng,et al
Dept.of Biochemistry,Guangxi Medical University，Nanning 530021
Abstract Objective:To study the glycopeptide characteristic and the type of glycopeptide linkage of Artocarpus Lengnanensis Lectin (ALL).Methods:ALL had been purified from the seeds of Artocarpus Lingnanensis by affinity chromatography on Gal-Sepharose 6B,following glycopeptide being purified by Sephadex G-25 chromatography from the digestion of ALL with pronase.The analysis of sugar was performed by chemistry and physics methods,and glycopeptide linkage was analyzed by β-elimination and lectin affinity test.Results:Both of ALL and glycopeptide contain aminogalactose,glucose,mannose,and arabose,and also show apparent increase of UV absorptance at 240 nm,and later,ALL was combined with jacalin.Conclusion:ALL is a glycoprotein which consists of two kinds of subunits whose molecular weights are approximative and the link between sugar chain and peptide is O-glycoside linkage.
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Key words artocarpus lengnanensis lectin;glycoprptein;characteristic
凝集素是一类具有糖结合专一性,可使多种细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,凝集素的结构分析,是凝集素研究中非常重要的基础工作,对进一步阐明凝集素的生物学特性,扩大凝集素的应用具有重要的作用。桂木是生长于亚热带的乔木,广西桂东南地区有丰富的自然资源,与一些已经报道含凝集素的植物相比,桂木种子所含的红桂木凝集素(ALL)和白桂木凝集素(AHL)的生物活力非常高,且活力稳定,预示它是一种极好的研究材料,也为今后大量生产提供可能性。本文着重对ALL的糖链结构及ALL结合糖蛋白的特点进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料：红桂木种子由广西亚热带作物研究所提供。SIgA:来自初乳,由广西医科大学第一附属医院产科提供。
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1.2 试剂：Sepharose 6B、甲状腺球蛋白为Pharmacia公司产品。丙烯酰胺、链霉蛋白酶为E.Merck公司产品。其余为国产试剂。
1.3 红桂木凝集素的分离纯化：按照本教研室制备的方法进行。
1.4 糖肽的制备[1]：ALL冻干粉加Tris-HAc缓冲液、Pronase溶液、甲苯,混匀,37℃消化6 d，离心将上清液上Sephadex G-25柱,收集并浓缩含糖峰,冻干备用。
1.5 电泳分析: ALL的不连续PAGE方法见文献[2]；浓度梯度凝胶电泳,参照周德义方法[3]; SDS-PAGE,方法见文献[2]。
1.6 ALL及糖肽的含糖量测定:按硫酸酚法[4]进行。
, 百拇医药
1.7 ALL和糖肽的β消除反应[5]:分别将ALL、糖肽置于0.2 mol/L NaOH 溶液中,45℃保温30 min。测定碱处理前后紫外吸收光谱的变化,另取ALL溶解于0.2 mol/L NaOH(含0.3 mol/L NaBH4),45℃保温24 h,分析碱处理前后氨基酸变化。
1.8 酶标JFL对ALL的结合试验:按郭春祥[6]的HRP标记抗体的过碘酸钠法标记JFL,酶标JFL对ALL的结合试验参考蒋成淦[7]法进行。
1.9 ALL糖肽的单糖组成分析:ALL和糖肽分别经三氟乙酸水解[8]后,进行纸层析。
1.10 ALL的红外光谱:岛津470红外光谱仪,KBr压片。
2 结果
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2.1 糖肽的分离纯化：红桂木种子粉经PBS抽提,60%饱和度硫酸胺沉淀,Gal-Sepharose 6B亲和层析后，获纯化的ALL，ALL经链霉蛋白酶消化后上Sephadex G-25柱,用硫酸酚法测定各管糖含量，茚三酮定性检测各管的氨基酸含量，从图1可看出,糖峰Ⅰ与A280的峰a重合,推测为不完全消化的ALL及残留的链霉蛋白酶产生,糖峰Ⅱ与A280的峰a、b基本分开，故认为糖峰Ⅱ为糖肽峰。
图1 ALL的链霉蛋白酶水解液在Sephadex G-25柱上的洗脱曲线…A280——A490
2.2 电泳分析：经考马斯亮蓝R250染色,ALL的不连续PAGE显示三条区带(图2a),4%～30%浓度梯度PAGE,显示一条蛋白质主带(图2b);ALL的SDS-PAGE同时蛋白和糖染色,分别出现两条蓝染的蛋白质带(图2c)和红染的糖蛋白带(由于染色浅,未拍照出)。
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图2 ALL凝胶电泳(考马斯亮蓝R250染色)
(a)不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳;(b)4%～30%浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳;(c) 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3 ALL和糖肽的含糖量测定：分别取ALL和糖肽6.24、4.86 mg,各溶于1 ml蒸馏水中:按硫酸酚法分别测定糖百分含量为7.0%和45.8%。
2.4 ALL和糖肽β-消除反应：碱处理后的ALL在240 nm处产生明显的吸收(图3),糖肽的紫外吸收光谱变化与ALL类似,氨基酸分析表明,ALL经碱处理后,丝氨酸、苏氨酸残基数减少,而丙氨酸残基数增加(表1),这说明ALL和糖肽均存在O-糖苷键。
图3 碱处理前后的ALL紫外吸收光谱
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1 -NaOH 2 +NaOH
表1 β消除前后ALL的氨基酸残基数变化 氨基酸
β消除前
β消除后
差异
Ser
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-11
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-10
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13
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2.5 JFL-HRP与ALL的结合试验：经酶标仪检测A450,甲状腺球蛋白、ALL、分泌型IgA及对照孔的A450分别为0.023、0.226、0.102、0.023,以P/N≥2.1为判断标准,可看出JFL可与SigA和ALL结合。
2.6 单糖组成的分析：ALL、糖肽的酸水解样品经纸层析后,与标准糖对照,发现ALL和糖肽的单糖组成均为氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖。
2.7 ALL的红外光谱(IR)
ALL的IR图谱在4000 cm-1～400 cm-1 区间具有糖类物质的一般特征,3415 cm-1～3280 cm-1为糖类羟基的吸收峰;1648 cm-1处为肽链上酰胺羰基的吸收峰;1147 cm-1～1022 cm-1的宽峰为糖分子中C-O键的振动吸收;810 cm-1和870 cm-1的两个小吸收峰表明含有甘露糖;840 cm-1附近有吸收峰表明糖甘键为α-构型。3 讨论
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ALL经不连续PAGE显示三条蛋白质区带，浓度梯度PAGE显示一条均一的蛋白质区带，SDS-PAGE显示两条蛋白区带的结果显示，ALL可能是由一种由两种分子量接近的亚基组成的四聚体，存在同功凝集素,但由于ALL亚基分子量接近，在组成可能的四聚体分子时其分子量必然非常接近，故浓度梯度PAGE无法区别，而只能在不连续PAGE上反映出来。经Schiff试剂染色，证明ALL及两种亚基都是含糖的蛋白质。
糖蛋白的糖链连接有两种方式:N-连接和O-连接.ALL及其糖肽经β-消除反应后在240 nm波长紫外吸收增加，氨基酸分析揭示丝氨酸和苏氨酸残基数减少，证实ALL和糖肽均存在O-糖苷键的存在[9]。丝氨酸和苏氨酸残基数的减少数量可反映多肽中糖链的可能连结点。本文中丝氨酸和苏氨酸的减少数量较ALL可能存在的连结点多，这可能是由于在β-消除反应中,不处于糖残基连结点的丝氨酸或苏氨酸容易受破坏所致。另外，JFL可特异地与含有O-糖苷键的糖蛋白结合[10]，JFL与ALL和SIgA结合，再次证实ALL存在O-糖苷键。
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国家自然科学资金资助项目 批准号 39260023
参考文献
1 Jacoues B，Stuart K，Shaul K.Structure of the carbohydrate umits of IgE immunoglobulin.J Bio.Chem，1974,249(6):1897～1903
2 何忠效，张树政主编.电泳.北京：科学出版社，1990.37
3 周德义.介绍一种制备管状梯度凝胶的装置.生物化学与生物物理进展,1985,(1):71
4 鲁子贤主编.蛋白质和酶学研究方法.北京：科学出版社，1989.37
5 Planter JJ.Carlson CM.Studoes of Mucin-Type Glycoproteins Anal.Biochem，1975,65:153～163
, 百拇医药
6 郭春祥,郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983,3(2):97～100
7 蒋成淦编著.酶免疫测定法.北京：人民卫生出版社，1984.102
8 Yoshinobu K,Sumihiro H,Yuji K.Structure of sugar chains of Ricin D.J Biochem，1988,103:944～949
9 Downs F，Pigman W.In “Methods in CarbohydrateChemistry” Vol 7.Academic Press.New York，1976.200～201
10 Glen LH，Beverly LT.Lectinaffinity chromatographhy of proteins bearing O-linked oligosaccharides:application of jacalin-agarose.Analitical Biochemistry，1990,188:271～277
收稿日期：1998-04-10, 百拇医药