广西β地中海贫血基因突变类型SSCP分析
作者：李卫 高枫 林伟雄 苏承武
单位：李卫 高枫 林伟雄 苏承武 广西医科大学第一附属医院分子生物学实验中心 南宁 520021
关键词：β地中海贫血；PCR；SSCP
广西医科大学学报990308
摘要 目的：建立一种简便易行,准确可靠,易于推广应用的β地中海贫血基因诊断方法。同时探讨单链DNA碱基构成与最适SSCP电泳温度(Ts)的相关性。方法：应用巢式PCR方法扩增β珠蛋白基因,然后用自行改良的SSCP方法对PCR扩增片段进行分析。结果：12种已知β地中海贫血突变均被检出。结论：改良的SSCP方法简便易行,准确可靠,适于推广应用。Ts与胞嘧啶碱基(C)成正相关,与腺嘌呤碱基(A)成负相关,由此得出经验公式: Ts=11×C/A。
中国图书资料分类法分类号 R556.61
, http://www.100md.com
SSCP ANALYSES FOR β THALASSEMIA GENE MUTATIONS IN GUANGXI
Li Wei,Gao Feng,Lin Weixiong,et al
Laboratory of Molecular Biology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective:To establish a simple,accurate and reliable gene diagnostic method and study the correlation between the base constitution of single strand DNA and the optimal electrophoretic temperature(Ts)for SSCP.Method:β globin gene was amplified by nested PCR,and then,the amplified fragments were analyzed by SSCP method improved by us.Result:All of 12 kinds of known β thalassemia mutations in Guangxi could be detected by the improved SSCP method.Conclusion:The improved SSCP method is simple and easy to be used and is applied in β thalassemia gene diagnoses.Ts is positively correlative to base C and negatively correlative to A.Ts=11×C/A in our system.
, 百拇医药
Key words β thalassemia；PCR；SSCP
β地中海贫血(下称β地贫)是广西一种常见的严重威胁患者身体健康直至生命的遗传性慢性溶血性疾病。目前对于重型β地贫除了输血外,尚无其它有效的治疗手段。因此,其预防显得格外重要。但由于现行的PCR-寡核苷酸探针等核酸分析方法操作过于繁琐等原因,限制了β地贫基因诊断的普及,迫切需要加以改良或创新以促进β地贫基因诊断的普及，降低重型β地贫患儿的出生率,提高人口健康素质。
1 材料与方法
1.1 样品:DNA样品取自不同的广西籍β地贫患者,用酚/氯仿法[1]进行抽提。被检测的地贫突变共有12种,分别为CDs41/42(-TTCT)、CD17(A-T)、-28(A-G)、IVS-II-654(C-T)、CD26(G-A，HbE)、CDs71/72(+A)、IVS-I-1(G-T)、-29(A-G)、CD43(G-T)、CDs27/28(+C)、CD95(+A)和CD30(AGG-GGG),其中前9种已由PCR-斑点杂交方法所确定,后3种虽经10种针对中国人已知突变的探针检测仍不能确定,后经SSCP及DNA测序分析加以确定[2]。除CD17(A-T)和CDs41/42(-TTCT)设有纯合子外，其余均为杂合子。取血红蛋白HbA2含量正常的DNA作为正常对照。
, 百拇医药
1.2 方法:巢式PCR及SSCP方法参见文献[2],但有所改进。其中第Ⅲ片段的上游引物改用引物C(5'-GTG TAC ACA TAT TGA CCA AA-3'),各片段相应的电泳条件均有所改变，分别为：第Ⅰ段11℃，8 h，第Ⅱ段14℃，10 h，第Ⅲ段7℃,5 h。
2 结果
正常人的第I片段可具有两种电泳带型,每种带型由两条电泳带组成,其中带1和带3分别来自同一条双链DNA的正链和负链,划为第一组带型,带2和带4则来自另一条双链DNA，划归第二组带型。这种电泳带型上的变化是由于β珠蛋白基因第I外显子的第3密码子末位碱基有C、T两种多态性变化所致,每种多态性变化可以产生一种电泳带型，第Ⅱ段和第Ⅲ段也有多态位点,分别位于珠蛋白基因第2内含子的第16和665位碱基。由于带1和带2重叠不易分开,正常第Ⅱ段一般只见到3条带。正常第Ⅲ段可分出四条带,其中带1,4来自同一条DNA,而2,3则来自另一条DNA,这与第1段有所不同。
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与正常的电泳带相比较,突变基因电泳带具有明显不同的电泳迁移率,很容易与正常带相区别。各种不同突变间的电泳迁移率也有较大的差别,形成各自独有的与众不同的电泳带型。CD30(AGG-GGG)带4移动比正常稍快,-28(A-G)带3已经移到带4的后面,-29(A-G)带2和带4均落到正常带2和带4的后面,CD17(A-T)的带1和带3明显滞后于正常带1和带3,纯合子CD17(A-T)突变无正常带型,CD26(G-A,HbE)的带4迁移比CD30(AGG-GGG)稍快,CDs27/28(+C)带4落后于正常带4,IVS-I-1(G-T)带4略慢于CDs27/28(+C)的带4(图1)。CDs71/72(+A),CD43(G-T)和CD95(+A)带1的移动均比正常快,其中以CD95 (+A)最快,CDs71/72(+A)次之,CD43(G-T)略慢于CDs71/72(+A)。此外,CDs71/72(+A)带2明显落后于正常而位于带4的后面。CDs41/42(-TTCT)带1和带2分别略慢于正常1和略快于正常带2。纯合子CDs41-42(-TTCT)无正常带型(图2),IVS-Ⅱ-654(C-T)带1和4比正常带略快(图3)。
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图1 第1段SSCP电泳图谱
第1，5，9和12泳道均为正常对照，第2，3，4，6，7，8，10和11泳道依次为CD30(AGG-GGG)，-28(A-G),-29(A-G),CD17(A-T),CD17(A-T)纯合子,CD26(G-A),CDs27/28(+C)和IVS-I-1(G-T)。除第7道为纯合子外，其余均为杂合子
图2 第2段电泳图谱
第2，5，8，11泳道均为正常对照。第1，3，4，6，7，9，10泳道依次为CD95(+A),CDs41/42(-TTCT),CDs41/42(-TTCT)纯合子,CD43(G-T),CD43(G-T),CDs71/72(+A)和CDs71/72(+A)。除第3道为纯合子外，其余均为杂合子
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图3 第三段SSCP电泳图谱
第1，3泳道为正常对照，第2，4为IVS-II-654(C-T)
3 讨论
DNA单链在一定条件下,具有相当稳定的空间构象。这种构象由DNA的一级结构,即DNA的碱基排列顺序所决定。一旦DNA的碱基排列顺序即使只有一个碱基发生改变,也可以使DNA单链的空间构象发生改变。在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,具有不同构象的DNA单链具有不同的迁移率。因此,通过对单链DNA的电泳分析可以发现突变或者碱基多态性(两者均使DNA的碱基排列顺序发生改变)的有无。这就是SSCP电泳分析的理论基础[3]。本研究发现,12种地贫突变的SSCP电泳带型与正常带型明显不同,检出率达到100%,同时也发现12种突变中,每种突变均有其特有的带型,电泳条件不变,其带型亦不改变,可重复率100%。值得一提的是,新突变CD30(AGG-GGG)最先是用SSCP分析方法发现的[2]。因此,SSCP分析不仅可以用于检测已知突变,也可以用于发现新突变。在影响SSCP结果的各种因素中,电泳温度至关重要,在具体操作过程中,应自始至终保持电泳温度的相对恒定。每个DNA片段都有一个相应的最适电泳温度(Ts),在该温度下,突变或多态性改变的检出率最高。通过对比所检测的3个片段的碱基构成后发现,A和C对Ts的影响最大,Ts的高低与A呈负相关,与C则呈正相关,但与DNA片段的长度无关，据此,我们得出一条用于计算Ts的经验公式:Ts=11×C/A。式中Ts为SSCP的最适电泳温度(℃),A和C分别代表DNA正链中A和C的碱基数(bp)。11是单链DNA电泳的温度系数，由电泳缓冲液所决定，随电泳缓冲液的改变而改变。由公式计算所得的理论值与实验所得的数值相差不到1℃。应该指出的是,SSCP所能分析的DNA片段长度并不是无限的,一般认为其最适长度为200～400 bp。一旦超出此范围,其检出率将随长度的增加而下降。本研究方法简便易行,准确可靠,一次电泳可筛查多种突变,无需使用放射性同位素标记的探针进行逐个探查,使β地贫基因诊断过程大为简化,其所需费用也大幅降低,很适合基层医疗机构使用。
, 百拇医药
参考文献
1 吴冠芸，方福德.基因诊断技术及应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1992.176
2 李卫，龙桂芳，林伟雄.应用SSCP及DNA直接测序方法检出3种罕见的地中海贫血突变型.中华血液学杂志，1996，17(8)：399
3 Masato O,Hiroyuki I,Hiroshi K,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophorresis as single strand conformation polymorphisms.Proc Natl Acad Sci USA，1989,86:276
收稿日期：1998-12-17, http://www.100md.com
单位：李卫 高枫 林伟雄 苏承武 广西医科大学第一附属医院分子生物学实验中心 南宁 520021
关键词：β地中海贫血；PCR；SSCP
广西医科大学学报990308
摘要 目的：建立一种简便易行,准确可靠,易于推广应用的β地中海贫血基因诊断方法。同时探讨单链DNA碱基构成与最适SSCP电泳温度(Ts)的相关性。方法：应用巢式PCR方法扩增β珠蛋白基因,然后用自行改良的SSCP方法对PCR扩增片段进行分析。结果：12种已知β地中海贫血突变均被检出。结论：改良的SSCP方法简便易行,准确可靠,适于推广应用。Ts与胞嘧啶碱基(C)成正相关,与腺嘌呤碱基(A)成负相关,由此得出经验公式: Ts=11×C/A。
中国图书资料分类法分类号 R556.61
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SSCP ANALYSES FOR β THALASSEMIA GENE MUTATIONS IN GUANGXI
Li Wei,Gao Feng,Lin Weixiong,et al
Laboratory of Molecular Biology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective:To establish a simple,accurate and reliable gene diagnostic method and study the correlation between the base constitution of single strand DNA and the optimal electrophoretic temperature(Ts)for SSCP.Method:β globin gene was amplified by nested PCR,and then,the amplified fragments were analyzed by SSCP method improved by us.Result:All of 12 kinds of known β thalassemia mutations in Guangxi could be detected by the improved SSCP method.Conclusion:The improved SSCP method is simple and easy to be used and is applied in β thalassemia gene diagnoses.Ts is positively correlative to base C and negatively correlative to A.Ts=11×C/A in our system.
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Key words β thalassemia；PCR；SSCP
β地中海贫血(下称β地贫)是广西一种常见的严重威胁患者身体健康直至生命的遗传性慢性溶血性疾病。目前对于重型β地贫除了输血外,尚无其它有效的治疗手段。因此,其预防显得格外重要。但由于现行的PCR-寡核苷酸探针等核酸分析方法操作过于繁琐等原因,限制了β地贫基因诊断的普及,迫切需要加以改良或创新以促进β地贫基因诊断的普及，降低重型β地贫患儿的出生率,提高人口健康素质。
1 材料与方法
1.1 样品:DNA样品取自不同的广西籍β地贫患者,用酚/氯仿法[1]进行抽提。被检测的地贫突变共有12种,分别为CDs41/42(-TTCT)、CD17(A-T)、-28(A-G)、IVS-II-654(C-T)、CD26(G-A，HbE)、CDs71/72(+A)、IVS-I-1(G-T)、-29(A-G)、CD43(G-T)、CDs27/28(+C)、CD95(+A)和CD30(AGG-GGG),其中前9种已由PCR-斑点杂交方法所确定,后3种虽经10种针对中国人已知突变的探针检测仍不能确定,后经SSCP及DNA测序分析加以确定[2]。除CD17(A-T)和CDs41/42(-TTCT)设有纯合子外，其余均为杂合子。取血红蛋白HbA2含量正常的DNA作为正常对照。
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1.2 方法:巢式PCR及SSCP方法参见文献[2],但有所改进。其中第Ⅲ片段的上游引物改用引物C(5'-GTG TAC ACA TAT TGA CCA AA-3'),各片段相应的电泳条件均有所改变，分别为：第Ⅰ段11℃，8 h，第Ⅱ段14℃，10 h，第Ⅲ段7℃,5 h。
2 结果
正常人的第I片段可具有两种电泳带型,每种带型由两条电泳带组成,其中带1和带3分别来自同一条双链DNA的正链和负链,划为第一组带型,带2和带4则来自另一条双链DNA，划归第二组带型。这种电泳带型上的变化是由于β珠蛋白基因第I外显子的第3密码子末位碱基有C、T两种多态性变化所致,每种多态性变化可以产生一种电泳带型，第Ⅱ段和第Ⅲ段也有多态位点,分别位于珠蛋白基因第2内含子的第16和665位碱基。由于带1和带2重叠不易分开,正常第Ⅱ段一般只见到3条带。正常第Ⅲ段可分出四条带,其中带1,4来自同一条DNA,而2,3则来自另一条DNA,这与第1段有所不同。
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与正常的电泳带相比较,突变基因电泳带具有明显不同的电泳迁移率,很容易与正常带相区别。各种不同突变间的电泳迁移率也有较大的差别,形成各自独有的与众不同的电泳带型。CD30(AGG-GGG)带4移动比正常稍快,-28(A-G)带3已经移到带4的后面,-29(A-G)带2和带4均落到正常带2和带4的后面,CD17(A-T)的带1和带3明显滞后于正常带1和带3,纯合子CD17(A-T)突变无正常带型,CD26(G-A,HbE)的带4迁移比CD30(AGG-GGG)稍快,CDs27/28(+C)带4落后于正常带4,IVS-I-1(G-T)带4略慢于CDs27/28(+C)的带4(图1)。CDs71/72(+A),CD43(G-T)和CD95(+A)带1的移动均比正常快,其中以CD95 (+A)最快,CDs71/72(+A)次之,CD43(G-T)略慢于CDs71/72(+A)。此外,CDs71/72(+A)带2明显落后于正常而位于带4的后面。CDs41/42(-TTCT)带1和带2分别略慢于正常1和略快于正常带2。纯合子CDs41-42(-TTCT)无正常带型(图2),IVS-Ⅱ-654(C-T)带1和4比正常带略快(图3)。
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图1 第1段SSCP电泳图谱
第1，5，9和12泳道均为正常对照，第2，3，4，6，7，8，10和11泳道依次为CD30(AGG-GGG)，-28(A-G),-29(A-G),CD17(A-T),CD17(A-T)纯合子,CD26(G-A),CDs27/28(+C)和IVS-I-1(G-T)。除第7道为纯合子外，其余均为杂合子
图2 第2段电泳图谱
第2，5，8，11泳道均为正常对照。第1，3，4，6，7，9，10泳道依次为CD95(+A),CDs41/42(-TTCT),CDs41/42(-TTCT)纯合子,CD43(G-T),CD43(G-T),CDs71/72(+A)和CDs71/72(+A)。除第3道为纯合子外，其余均为杂合子
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图3 第三段SSCP电泳图谱
第1，3泳道为正常对照，第2，4为IVS-II-654(C-T)
3 讨论
DNA单链在一定条件下,具有相当稳定的空间构象。这种构象由DNA的一级结构,即DNA的碱基排列顺序所决定。一旦DNA的碱基排列顺序即使只有一个碱基发生改变,也可以使DNA单链的空间构象发生改变。在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,具有不同构象的DNA单链具有不同的迁移率。因此,通过对单链DNA的电泳分析可以发现突变或者碱基多态性(两者均使DNA的碱基排列顺序发生改变)的有无。这就是SSCP电泳分析的理论基础[3]。本研究发现,12种地贫突变的SSCP电泳带型与正常带型明显不同,检出率达到100%,同时也发现12种突变中,每种突变均有其特有的带型,电泳条件不变,其带型亦不改变,可重复率100%。值得一提的是,新突变CD30(AGG-GGG)最先是用SSCP分析方法发现的[2]。因此,SSCP分析不仅可以用于检测已知突变,也可以用于发现新突变。在影响SSCP结果的各种因素中,电泳温度至关重要,在具体操作过程中,应自始至终保持电泳温度的相对恒定。每个DNA片段都有一个相应的最适电泳温度(Ts),在该温度下,突变或多态性改变的检出率最高。通过对比所检测的3个片段的碱基构成后发现,A和C对Ts的影响最大,Ts的高低与A呈负相关,与C则呈正相关,但与DNA片段的长度无关，据此,我们得出一条用于计算Ts的经验公式:Ts=11×C/A。式中Ts为SSCP的最适电泳温度(℃),A和C分别代表DNA正链中A和C的碱基数(bp)。11是单链DNA电泳的温度系数，由电泳缓冲液所决定，随电泳缓冲液的改变而改变。由公式计算所得的理论值与实验所得的数值相差不到1℃。应该指出的是,SSCP所能分析的DNA片段长度并不是无限的,一般认为其最适长度为200～400 bp。一旦超出此范围,其检出率将随长度的增加而下降。本研究方法简便易行,准确可靠,一次电泳可筛查多种突变,无需使用放射性同位素标记的探针进行逐个探查,使β地贫基因诊断过程大为简化,其所需费用也大幅降低,很适合基层医疗机构使用。
, 百拇医药
参考文献
1 吴冠芸，方福德.基因诊断技术及应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1992.176
2 李卫，龙桂芳，林伟雄.应用SSCP及DNA直接测序方法检出3种罕见的地中海贫血突变型.中华血液学杂志，1996，17(8)：399
3 Masato O,Hiroyuki I,Hiroshi K,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophorresis as single strand conformation polymorphisms.Proc Natl Acad Sci USA，1989,86:276
收稿日期：1998-12-17, http://www.100md.com