肥大心肌缝隙连接的超微结构及临床意义*
作者：杨琳 陈明霞 刘衍晟原卫清 陈恒馥杨少毅
单位：杨 琳 原卫清(第一临床医学院心内科 西安 710061)；陈明霞刘衍晟电镜室；陈恒馥杨少毅 第一附属医院心内科硕士研究生
关键词：肥大心肌；缝隙连接；冷冻蚀刻
西安医科大学学报/990312 摘要 采用电镜冷冻蚀刻和超薄切片的方法观察了大鼠腹主动脉狭窄致左室肥厚心肌细胞缝隙连接(GJ)的结构特点。结果发现，心肌细胞超微结构损伤严重，闰盘肿胀、扩张，冷冻蚀刻法见PF面颗粒排列紊乱、颗粒的中心距离变大。这种细胞间电活动传导通路的结构变化，可认为是高血压心肌肥大时产生心律失常的一种基础。
THE UITRASTRUCTURE OF GAP JUNCTION
OF HYPERTROPHIC CARDIAC MYOCYTES AND
, 百拇医药
ITS CLINICAL SIGNIFICANCE
Yang Lin，Chen Mingxia,Liu Yancheng et al
(Department of cardiovascular internal medicine ，First Clinical Medical College)
Abstract We adopt the methods of freezing fracture and thin section electron micrographs to abserve the characteristics of the gap junctions from left ventricular hypertrophy (LVH) in rat caused by constricting the aorta.The Ultrastructure of cardiac myocytes in LVH group was heavily demaged.The intercalated disk swollen and dilatated.The arrangement of P face was dispersed and the distribution of center-to-center distance between P-face particles bacame large.The construction modification of low resistance pathway for transmission of electrical current among myocytes can be considered as a foundation of arrhythmia in hypertention and patients with left ventricular hypertrophied.
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Key words hypertrophic cardiac myocytes ;gap junction;freezing fracture.
心肌肥大是高血压容量负荷过度及冠心病等多种心血管疾病过程中产生的一个共同的病理过程，尽管曾认为心肌肥大是心脏的一种适应性代偿反应，但随着心肌肥大的不断发展，最终将不可避免地导致心泵功能的衰竭。
在高血压病人中约有1/3会出现左心室肥厚(LVH)，LVH已被认为是独立于高血压的心血管病的危险因素。部分高血压病人LVH甚至会先于高血压的出现。LVH的组织发生重构，心肌细胞肥大，心肌间质纤维化以及冠脉血管舒张功能受限，储备功能下降等[1]。
心脏有序、同步的机械活动是以细胞间快速传递的心电活动为基础的，而电活动传导又是通过细胞间的低电阻通路-缝隙连接(GJ)来完成的[2]。心肌肥大时，实质细胞和间质组织的变化， 会如何影响GJ的形态目前未见报道。本研究采用电镜冷冻蚀刻和超薄切片方法， 观察了大鼠腹主动脉狭窄导致左室肥厚心肌细胞GJ的结构特点。
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材料与方法
1 材料 本实验所用动物为成年、健康雄性SD大鼠，体重为150～200 g，由西安医科大学实验动物中心提供。
2 大鼠左心室肥厚模型的复制 随机将大鼠分为假手术(Sham)组和主动脉狭窄(AC)组，AC组参照Cutilleta[3]等人的方法略有改变。在乙醚麻醉下沿大鼠腹中线开腹，于右肾动脉上方小心分离出约3 mm长的腹主动脉，然后套上一内径为0.65～0.8 mm的银夹(根据动物大小及腹主动脉的粗细选择)，使腹主动脉形成环状狭窄，整个手术过程10～15 min。此后每日自由饮水、进食，共3周。Sham组大鼠除不狭窄主动脉外，其余步骤与AC组一致。3周后，在戊巴比妥钠加肝素麻醉下开胸取出心脏，弃去心房，滤纸吸干血液后，分别称取心室和左心室(包括室间隔)的重量，各组数据用均数±标准差(
±s)表示，采用t检验，P<0.05为显著性检验水平。
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3 电镜标本的制备及观察
3.1 超薄切片标本的制备和电镜观察 自左室游离壁切取数块大小约1mm3组织块，放入2.5%戊二醛多聚甲醛固定液中，4℃固定2h以上，经磷酸缓冲液浸洗后，用1%的四氧化锇后固定，乙醇系列脱水，Epon812包埋，LKB超薄切片机切片，铅、铀染色，日立H-600电镜下观察拍照。 3.2 冷冻蚀刻标本的制备和观察 将取出的心脏组织切成1mm×1mm×3mm的组织块，快速置入预冷的2.5%戊二醛多聚甲醛固定液内于4℃固定24～48 h，用0.1mol/L磷酸缓冲液浸洗数次，再置入30%甘油生理盐水中浸渍约24 h后，将样品放入样品杯小孔内，置液氮内快速冷冻，并于真空喷镀仪内断裂、蚀刻、复型、捞出复型膜后，电镜下观察、拍照。
结果
1 腹主动脉狭窄导致左心室肥厚、心室/体重比值的改变 经腹主动脉狭窄手术后3周与假手术对照组分别对心室/体重比值(V/Bwt)、左室/体重比值(LV/Bwt)以及心脏湿重分别进行比较，结果见附表。提示大鼠腹主动脉狭窄可引起严重的左室肥厚，提供了观察肥大心肌GJ形态学改变的动物模型。
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附表 腹主动脉狭窄致心室/体重比值的改变 组别
n
Bwt(g)
Vwt(g)
V/Bwt(mg/100g)
LV/Bwt(mg/100g)±s
%±s
%
Sham
8
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176.3±20.2
0.605±0.073
349.3±33.6
100.0
270.4±32.1
100.0
AC
10
160.7±13.3
0.760±0.12
503.3±59.8
, 百拇医药
148.3
409.9±55.6
151.6
注∶与Sham比较*P<0.05
2 肥大心肌细胞超微结构形态特征 Sham组肌原纤维排列整齐，各带清晰，Z带的长度和宽度一致，线粒体完整，基质密度均匀，嵴平行排列，闰盘结构中GJ清晰可见(图1)。
图1 Sham组细胞间连接，ID的电子密度均匀，箭头粗、中、细分别指示桥粒、中间连接及GJ ×32000
AC组心肌细胞膜迂曲，肌丝断裂、溶解，Z线排列紊乱，宽窄不一，T管及肌浆网扩张明显，线粒体肿胀、增生，基质内出现脂质包含物(图2)，细胞间质增生，可见其将肥大的心肌细胞包绕分隔成束。
, 百拇医药
图2 AC组Z线排列紊乱，肌浆网扩张，线粒体肿胀，间质增生 ×1000
ID部位电子密度降低，未分化区连接扩张成囊泡状(图3)，GJ较对照组轻度增宽。
3 冷冻蚀刻法的缝隙连接形态特征 缝隙连接位于心肌细胞间闰盘的特殊部位，是由相邻的两心肌细胞膜共同构成的，其间有2～3nm的间隙。每一侧膜上都含有一组完整的膜蛋白，称为结合体(connexans)，由6个蛋白质亚单位构成，排列整齐、紧密，呈6边形，中央为亲水性微型通道，直径最大处约为2.5nm，和与之相对的心肌细胞膜上另一结合体同轴排列，跨过狭窄的心肌细胞外间隙，且与心肌细胞外空间完全隔离[2]。结合体的旋转运动改变了通道的开、关性质，该通道利于电流及小分子物质(至1kDa)在心肌细胞间的直接传递[4]。
, 百拇医药
图3 ID的中间连接和桥粒均有扩张，尤以未分化区连接为著，扩张成囊泡状(箭头所示)
×60000
图4所示为Sham组左心室壁肌细胞间缝隙连接的PF面[5](protoplasmic fracture face),颗粒大小均匀，排列呈规则的6边形， 每个颗粒中心与中心的距离基本一致。
图4 Sham组心肌细胞GJ的PF面构象 ×60000
图5为AC组肥大心肌细胞间ID和GJ，与对照组相比，PF面颗粒直径无明显改变，但排列紊乱，数量减少，颗粒中心与中心距离变大，未见有弥散的小的缝隙连接分布。
, 百拇医药
图5 AC组肥大心肌细胞的ID，箭头所示为GJ、PF面颗粒排列紊乱，尤其是边缘部位颗粒数量减少 ×60000
讨论
心脏兴奋活动的扩布及传导过程的异常，比如环形激动或折返是导致心律失常的重要机制，针对这种机制，多年来学者们主要以改变心肌细胞主动膜离子通道的性质加以解释。但是Severs指出改变细胞膜被动性质如电阻特性对电活动的传导也有一定的影响[5]。细胞内电阻是由胞浆电阻和细胞之间的缝隙连接电阻共同构成的，细胞浆电阻很小，因此改变缝隙连接电阻就会明显影响细胞内电阻。
缝隙连接是心肌细胞间连接的一种形式，也是细胞间电信号反复、快速传导的低电阻通路，从而确保心脏机械活动同步有序的进行。缝隙连接的排列、数量及大小都影响着电活动的传导方式。心脏兴奋沿细胞长轴方向的扩布比横轴方向要快若干倍(根据心脏不同的部位，比例不同)，这种各向异性的传导特点是以细胞各方向上缝隙连接状态为基础的。
, 百拇医药
缝隙连接的中心理论认为结合蛋白规律的排列是细胞间功能性偶联的基础，而排列方式紊乱，则可造成脱偶联[6]。为了解释闰盘及缝隙连接的分布特点，展示它们的三维空间结构，冷冻蚀刻是一种有效的方法[7]。本实验采用这一方法同时结合电镜超微结构，详细观察了肥大心肌细胞GJ的结构特点。心肌肥大发生后，肌浆网扩张，线粒体变性，能量代谢障碍，细胞间ID弯曲度明显增加、肿胀，尤其是未分化区连接已扩张成囊泡状。致使GJ连接蛋白之间的距离加大，一定程度影响了GJ蛋白的排列方式，其结果必将对细胞间电活动的传导产生不利的影响。增生肥大的心肌细胞成束 ，心肌纤维排列异常带有分支，也可能导致GJ的结构随之发生改变。
GJ电导对细胞膜电位的改变不敏感，但细胞内Ca2+升高或pH降低均可明显降低GJ电导[8，9]。高血压、心肌肥大极易发生心肌缺血，而使[Ca]i和[H]i水平发生变化，使细胞内电阻增加，降低电信号传导的空间常数，增加自身的各向异性传导，并且也可改变GJ的排列特点[7]，由此可认为这是高血压心肌肥大时产生心律失常的一种结构基础。
, 百拇医药
*为院基金项目
参考文献
1 胡英，蔡乃绳.高血压左室肥厚的组织重构.中华内科杂志，1997；36(6)∶424
2 Spear JF,Michelson EL,Moore EN.Cellular electrophysiologic characteristics of chronically infarcted myocardium in dogs susceptible to sustained ventricular tachyarrythmias.J Am Coll Cardiol,1983;1∶1099
3 Cutilleta AF,Rudnik M,Iak R.Muscle and non-muscle cell RNA polymerase activity during the development of myocardial hypertrophy.J Mol Cell Cardiol 1978;10∶677
, http://www.100md.com
4 Green CR,Severs NJ.Distribution and role of gap junctions in normal myocardium and human ischaemic heart disease.Histochemistry, 1993;99∶105
5 Severs NJ.The cardiac gap junction and intercalated dise.Int1 J Cardiol,1990;26∶137
6 Luke RA,Saffitz JE.Remodeling of ventricular conduction pathways in healed canine infarct border zones.J Clin Invest, 1991;87∶1594
7 Shibata Y,Page E.Gap junctional structure in intact and cut sheep cardiac Purkinje fibers∶A freeze-fracture study of Ca2+-induced resealing.J Ultrastruct Res, 1981;75∶195
, http://www.100md.com
8 White RL,Doeller JE,Versells VK,et al.Gap junctional conductance between pairs of ventricular myocytes is modulated synergistically by H+ and Ca2+ .J Gen Physiol,1990;95∶1061
9 Marban E,Kitakaze M,koretsune Y et al.Quantification of [Ca]2+i in perfused hearts critical evaluation of the 5F-BAPTA and nuclear magnetic resonance method as applied to the study of ischemia and reperfusion.Circ Res,1990;66∶1255
(1998-01-16收稿 1999-03-06修回), http://www.100md.com
单位：杨 琳 原卫清(第一临床医学院心内科 西安 710061)；陈明霞刘衍晟电镜室；陈恒馥杨少毅 第一附属医院心内科硕士研究生
关键词：肥大心肌；缝隙连接；冷冻蚀刻
西安医科大学学报/990312 摘要 采用电镜冷冻蚀刻和超薄切片的方法观察了大鼠腹主动脉狭窄致左室肥厚心肌细胞缝隙连接(GJ)的结构特点。结果发现，心肌细胞超微结构损伤严重，闰盘肿胀、扩张，冷冻蚀刻法见PF面颗粒排列紊乱、颗粒的中心距离变大。这种细胞间电活动传导通路的结构变化，可认为是高血压心肌肥大时产生心律失常的一种基础。
THE UITRASTRUCTURE OF GAP JUNCTION
OF HYPERTROPHIC CARDIAC MYOCYTES AND
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ITS CLINICAL SIGNIFICANCE
Yang Lin，Chen Mingxia,Liu Yancheng et al
(Department of cardiovascular internal medicine ，First Clinical Medical College)
Abstract We adopt the methods of freezing fracture and thin section electron micrographs to abserve the characteristics of the gap junctions from left ventricular hypertrophy (LVH) in rat caused by constricting the aorta.The Ultrastructure of cardiac myocytes in LVH group was heavily demaged.The intercalated disk swollen and dilatated.The arrangement of P face was dispersed and the distribution of center-to-center distance between P-face particles bacame large.The construction modification of low resistance pathway for transmission of electrical current among myocytes can be considered as a foundation of arrhythmia in hypertention and patients with left ventricular hypertrophied.
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Key words hypertrophic cardiac myocytes ;gap junction;freezing fracture.
心肌肥大是高血压容量负荷过度及冠心病等多种心血管疾病过程中产生的一个共同的病理过程，尽管曾认为心肌肥大是心脏的一种适应性代偿反应，但随着心肌肥大的不断发展，最终将不可避免地导致心泵功能的衰竭。
在高血压病人中约有1/3会出现左心室肥厚(LVH)，LVH已被认为是独立于高血压的心血管病的危险因素。部分高血压病人LVH甚至会先于高血压的出现。LVH的组织发生重构，心肌细胞肥大，心肌间质纤维化以及冠脉血管舒张功能受限，储备功能下降等[1]。
心脏有序、同步的机械活动是以细胞间快速传递的心电活动为基础的，而电活动传导又是通过细胞间的低电阻通路-缝隙连接(GJ)来完成的[2]。心肌肥大时，实质细胞和间质组织的变化， 会如何影响GJ的形态目前未见报道。本研究采用电镜冷冻蚀刻和超薄切片方法， 观察了大鼠腹主动脉狭窄导致左室肥厚心肌细胞GJ的结构特点。
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材料与方法
1 材料 本实验所用动物为成年、健康雄性SD大鼠，体重为150～200 g，由西安医科大学实验动物中心提供。
2 大鼠左心室肥厚模型的复制 随机将大鼠分为假手术(Sham)组和主动脉狭窄(AC)组，AC组参照Cutilleta[3]等人的方法略有改变。在乙醚麻醉下沿大鼠腹中线开腹，于右肾动脉上方小心分离出约3 mm长的腹主动脉，然后套上一内径为0.65～0.8 mm的银夹(根据动物大小及腹主动脉的粗细选择)，使腹主动脉形成环状狭窄，整个手术过程10～15 min。此后每日自由饮水、进食，共3周。Sham组大鼠除不狭窄主动脉外，其余步骤与AC组一致。3周后，在戊巴比妥钠加肝素麻醉下开胸取出心脏，弃去心房，滤纸吸干血液后，分别称取心室和左心室(包括室间隔)的重量，各组数据用均数±标准差(
±s)表示，采用t检验，P<0.05为显著性检验水平。, http://www.100md.com
3 电镜标本的制备及观察
3.1 超薄切片标本的制备和电镜观察 自左室游离壁切取数块大小约1mm3组织块，放入2.5%戊二醛多聚甲醛固定液中，4℃固定2h以上，经磷酸缓冲液浸洗后，用1%的四氧化锇后固定，乙醇系列脱水，Epon812包埋，LKB超薄切片机切片，铅、铀染色，日立H-600电镜下观察拍照。 3.2 冷冻蚀刻标本的制备和观察 将取出的心脏组织切成1mm×1mm×3mm的组织块，快速置入预冷的2.5%戊二醛多聚甲醛固定液内于4℃固定24～48 h，用0.1mol/L磷酸缓冲液浸洗数次，再置入30%甘油生理盐水中浸渍约24 h后，将样品放入样品杯小孔内，置液氮内快速冷冻，并于真空喷镀仪内断裂、蚀刻、复型、捞出复型膜后，电镜下观察、拍照。
结果
1 腹主动脉狭窄导致左心室肥厚、心室/体重比值的改变 经腹主动脉狭窄手术后3周与假手术对照组分别对心室/体重比值(V/Bwt)、左室/体重比值(LV/Bwt)以及心脏湿重分别进行比较，结果见附表。提示大鼠腹主动脉狭窄可引起严重的左室肥厚，提供了观察肥大心肌GJ形态学改变的动物模型。
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附表 腹主动脉狭窄致心室/体重比值的改变 组别
n
Bwt(g)
Vwt(g)
V/Bwt(mg/100g)
LV/Bwt(mg/100g)
±s%
±s%
Sham
8
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176.3±20.2
0.605±0.073
349.3±33.6
100.0
270.4±32.1
100.0
AC
10
160.7±13.3
0.760±0.12
503.3±59.8
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148.3
409.9±55.6
151.6
注∶与Sham比较*P<0.05
2 肥大心肌细胞超微结构形态特征 Sham组肌原纤维排列整齐，各带清晰，Z带的长度和宽度一致，线粒体完整，基质密度均匀，嵴平行排列，闰盘结构中GJ清晰可见(图1)。
图1 Sham组细胞间连接，ID的电子密度均匀，箭头粗、中、细分别指示桥粒、中间连接及GJ ×32000
AC组心肌细胞膜迂曲，肌丝断裂、溶解，Z线排列紊乱，宽窄不一，T管及肌浆网扩张明显，线粒体肿胀、增生，基质内出现脂质包含物(图2)，细胞间质增生，可见其将肥大的心肌细胞包绕分隔成束。
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图2 AC组Z线排列紊乱，肌浆网扩张，线粒体肿胀，间质增生 ×1000
ID部位电子密度降低，未分化区连接扩张成囊泡状(图3)，GJ较对照组轻度增宽。
3 冷冻蚀刻法的缝隙连接形态特征 缝隙连接位于心肌细胞间闰盘的特殊部位，是由相邻的两心肌细胞膜共同构成的，其间有2～3nm的间隙。每一侧膜上都含有一组完整的膜蛋白，称为结合体(connexans)，由6个蛋白质亚单位构成，排列整齐、紧密，呈6边形，中央为亲水性微型通道，直径最大处约为2.5nm，和与之相对的心肌细胞膜上另一结合体同轴排列，跨过狭窄的心肌细胞外间隙，且与心肌细胞外空间完全隔离[2]。结合体的旋转运动改变了通道的开、关性质，该通道利于电流及小分子物质(至1kDa)在心肌细胞间的直接传递[4]。
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图3 ID的中间连接和桥粒均有扩张，尤以未分化区连接为著，扩张成囊泡状(箭头所示)
×60000
图4所示为Sham组左心室壁肌细胞间缝隙连接的PF面[5](protoplasmic fracture face),颗粒大小均匀，排列呈规则的6边形， 每个颗粒中心与中心的距离基本一致。
图4 Sham组心肌细胞GJ的PF面构象 ×60000
图5为AC组肥大心肌细胞间ID和GJ，与对照组相比，PF面颗粒直径无明显改变，但排列紊乱，数量减少，颗粒中心与中心距离变大，未见有弥散的小的缝隙连接分布。
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图5 AC组肥大心肌细胞的ID，箭头所示为GJ、PF面颗粒排列紊乱，尤其是边缘部位颗粒数量减少 ×60000
讨论
心脏兴奋活动的扩布及传导过程的异常，比如环形激动或折返是导致心律失常的重要机制，针对这种机制，多年来学者们主要以改变心肌细胞主动膜离子通道的性质加以解释。但是Severs指出改变细胞膜被动性质如电阻特性对电活动的传导也有一定的影响[5]。细胞内电阻是由胞浆电阻和细胞之间的缝隙连接电阻共同构成的，细胞浆电阻很小，因此改变缝隙连接电阻就会明显影响细胞内电阻。
缝隙连接是心肌细胞间连接的一种形式，也是细胞间电信号反复、快速传导的低电阻通路，从而确保心脏机械活动同步有序的进行。缝隙连接的排列、数量及大小都影响着电活动的传导方式。心脏兴奋沿细胞长轴方向的扩布比横轴方向要快若干倍(根据心脏不同的部位，比例不同)，这种各向异性的传导特点是以细胞各方向上缝隙连接状态为基础的。
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缝隙连接的中心理论认为结合蛋白规律的排列是细胞间功能性偶联的基础，而排列方式紊乱，则可造成脱偶联[6]。为了解释闰盘及缝隙连接的分布特点，展示它们的三维空间结构，冷冻蚀刻是一种有效的方法[7]。本实验采用这一方法同时结合电镜超微结构，详细观察了肥大心肌细胞GJ的结构特点。心肌肥大发生后，肌浆网扩张，线粒体变性，能量代谢障碍，细胞间ID弯曲度明显增加、肿胀，尤其是未分化区连接已扩张成囊泡状。致使GJ连接蛋白之间的距离加大，一定程度影响了GJ蛋白的排列方式，其结果必将对细胞间电活动的传导产生不利的影响。增生肥大的心肌细胞成束 ，心肌纤维排列异常带有分支，也可能导致GJ的结构随之发生改变。
GJ电导对细胞膜电位的改变不敏感，但细胞内Ca2+升高或pH降低均可明显降低GJ电导[8，9]。高血压、心肌肥大极易发生心肌缺血，而使[Ca]i和[H]i水平发生变化，使细胞内电阻增加，降低电信号传导的空间常数，增加自身的各向异性传导，并且也可改变GJ的排列特点[7]，由此可认为这是高血压心肌肥大时产生心律失常的一种结构基础。
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*为院基金项目
参考文献
1 胡英，蔡乃绳.高血压左室肥厚的组织重构.中华内科杂志，1997；36(6)∶424
2 Spear JF,Michelson EL,Moore EN.Cellular electrophysiologic characteristics of chronically infarcted myocardium in dogs susceptible to sustained ventricular tachyarrythmias.J Am Coll Cardiol,1983;1∶1099
3 Cutilleta AF,Rudnik M,Iak R.Muscle and non-muscle cell RNA polymerase activity during the development of myocardial hypertrophy.J Mol Cell Cardiol 1978;10∶677
, http://www.100md.com
4 Green CR,Severs NJ.Distribution and role of gap junctions in normal myocardium and human ischaemic heart disease.Histochemistry, 1993;99∶105
5 Severs NJ.The cardiac gap junction and intercalated dise.Int1 J Cardiol,1990;26∶137
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7 Shibata Y,Page E.Gap junctional structure in intact and cut sheep cardiac Purkinje fibers∶A freeze-fracture study of Ca2+-induced resealing.J Ultrastruct Res, 1981;75∶195
, http://www.100md.com
8 White RL,Doeller JE,Versells VK,et al.Gap junctional conductance between pairs of ventricular myocytes is modulated synergistically by H+ and Ca2+ .J Gen Physiol,1990;95∶1061
9 Marban E,Kitakaze M,koretsune Y et al.Quantification of [Ca]2+i in perfused hearts critical evaluation of the 5F-BAPTA and nuclear magnetic resonance method as applied to the study of ischemia and reperfusion.Circ Res,1990;66∶1255
(1998-01-16收稿 1999-03-06修回), http://www.100md.com