大鼠局灶性脑缺血模型及其与C反应蛋白变化的关系
作者：林春 郑淑秋 钟觉民 颜光美
单位：林 春 福建医科大学生理学教研室(福州 350004)；郑淑秋 钟觉民 中山医科大学病理学教研室(广州 510080)；颜光美 中山医科大学药理学教研室(广州 510080) 课题负责人
关键词：大脑中动脉梗塞；缺血性脑卒中；C反应蛋白；大鼠
福建医科大学学报990305 目的 改进大鼠大脑中动脉梗塞法，建立更接近于临床缺血性脑卒中及其再灌注的可靠模型，并观察其与血清C反应蛋白变化的关系。 方法 沿大鼠右颈内动脉插入长2.1～2.3 cm直径0.205 mm的单股尼龙丝，直达大脑中动脉起始部开口，阻断其血流，观察大鼠神经病学改变及脑组织形态学变化，并测定血清C反应蛋白含量。 结果 术后大鼠表现特殊体态及典型追尾征,6 h大脑中动脉供血区出现缺血性外观(TTC染色)及相应组织学变化(HE染色)，模型成功率近95%(71/75)；并伴血清C反应蛋白上升(15.9%，n=20,P<0.05)。 结论 本方法既可构成缺血性病灶，又能形成再灌注模型，具有可逆性重复操作的特点;其神经病学与形态学的特殊表现及血清C反应蛋白的升高，可作为鉴定模型可靠性的依据。
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A Model of Regional Cerebral Ischemia and its Relationship with C-reactive Protein Change
Lin Chun1, Zheng Shuqiu2, Zhong Juemin3, et al
(1.Department of Physiology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004
2.Department of Pharmacology, 3.Department of Pathology,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080)
, 百拇医药
Objective An ideal animal model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was developed and the relationship between the model and C-reactive protein change was investigated. Methods A fine and glossy nylon suture was introduced into the right cervical internal carotid artery and advanced intracranially to block blood flow into the MCA,changes of neurological syndromes and of morphology of brain were observed and CRP of serum was measured in rats. Results After MCAO,special neurological syndromes were showed by rats, the infarct surface in the area of MCA(TTC coloring, after MCAO 6 h) and corresponding change of brain histology(HE staining) were appeared and success rate of the model reached 95%(71/75); meanwhile CRP of serum rose(15.9%, P<0.05). Conclusion A reversible model of regional cerebral ischemia in rats was developed,the reliability of which could be evaluated by neurological syndromes, morphologic change and rise of serum CRP.
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Key words middle cerebral artery occlusion; ischemic stroke; C-reactive protein; rat
缺血性脑卒中是常见的脑血管意外，多构成终生残疾，对患者生活与工作带来严重后果，早期诊断与治疗是攻克该疾病的主要课题，为此，必须建立一种较为理想的动物模型——手术操作简便，损害少，可构成循环梗塞,又可顺利恢复血流这种接近临床病理状况的方法。大脑中动脉是脑梗塞好发部位，1966年Sundt在沙土鼠[1]及幼年大鼠[2]不断改进模拟大脑中动脉梗塞方法，至1989年Longa[3]改进成可逆性不开颅手术后，大脑中动脉梗塞动物模型已较成熟可靠，作者在此基础上进行改进，简化操作过程，提高成功率，同时观察C-反应蛋白与脑缺血的程度关系，以期求得早期的客观指标。心肌梗塞时C-反应蛋白升高已较肯定[4，5]，但是目前脑梗塞与C-反应蛋白的关系尚有争议。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠，♂，体重235～275 g(中山医科大学实验动物中心);随机分组：(1)假手术组10只;(2)脑缺血3 h组20只;(3)脑缺血6 h组20只;(4)脑缺血12 h组20只。
1.2 大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制备
1.2.1 线栓制备 市售单股直径0.205 mm尼龙丝，准确选取2.5 cm，浸泡于75%酒精10 min，生理盐水冲洗，1%肝素浸泡备用。
1.2.2 手术操作 动物用2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)，背位固定于大鼠手术台，颈部正中切口2～2.5 cm，分离二侧甲状腺，暴露气管右侧与胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间的三角区，钝性分离颈总动脉，颈内动脉及颈外动脉，用小动脉夹夹住颈总动脉，并置1-0手术线以备止血之需。摘除颈总动脉分叉背后的颈上交感神经节(分离枕动脉所需),分离枕动脉结扎剪断，并于甲状腺上动脉分支处双线结扎剪断颈外动脉，仔细分离位于深层的颈内动脉最下端的唯一分支翼腭动脉，于分支前1 mm处结扎(此为手术关键步骤之一)。在颈外动脉残端距颈总动脉分支约3 mm处剪一小口，插入尼龙丝，同时将颈外动脉残端牵向外下方，使之与颈内动脉呈平行走向，拉直与颈内动脉的夹角，将尼龙丝顺颈内动脉走向，轻柔缓慢推进(不可强推，以免穿通动脉壁)，直到尼龙丝在动脉外尚余1～2 mm长度，与颈外动脉同时结扎以固定尼龙丝(图1)。此时插入的尼龙丝正好封闭大脑中动脉开口，阻断大脑中动脉的血流。假手术组除不插入尼龙丝外，其他操作与手术组相同。
, 百拇医药
图1 线栓插入颈内动脉达MCA路径示意图
1.3 术后神经病学检测
术后清醒状态下观察右侧MCAO后的神经病学症状，主要表现为：
1.3.1 双眼对比(图2A) 右侧(手术侧)瞳孔缩小,眼球内陷,眼裂变小(Horner征);取出眼球时眼窝无出血现象。左侧(非手术侧)眼球稍突出，瞳孔及眼裂正常;取出眼球时眼窝出血。
图2 术后动物的体态
A.同侧(右)Horner征及左前爪伸展不能. B.动物提尾悬空的强迫体态.
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C.向左旋转的“追尾征”致静止时尾巴特殊的盘绕状.
1.3.2 体态(图2A) 左侧肌张力下降，右侧肌张力相对增强，躯体向左侧屈曲，右侧前爪伸长强于左侧，尾巴弯向左侧。提尾悬空时(图2B)呈强迫性体态，躯体向左侧扭转，右侧前后肢外展，左侧前后肢松软屈曲。
1.3.3 追尾征(图2C) 运动时躯体向左侧旋转，如同追击自己尾巴一样，旋转静止后尾巴可形成特殊的盘绕状。
1.4 氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)组化染色
术后6 h在清醒状态下断头处死，打开颅骨盖，剥去脑膜，快速取出整个大脑，用PBS液清洗后，将鼠脑置于1%TTC溶液中，再于37℃ CO2孵箱(德国Heraeus)温育20 min，应严格避光，每隔5 min摇动一次，20 min后再将大脑标本移置于4%多聚甲醛液中固定。
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1.5 光镜组织学检查 如上述操作，动物处死、取脑、PBS清洗后，将鼠脑置于4%多聚甲醛液固定24 h，石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，HE染色，光镜观察组织细胞学变化。
1.6 血清C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)检验 MCAO前右眼窝取血，术后0.5 h左眼窝取血，术后6 h断头取血，每次取血1.5～2.0 ml，静置凝固后置3000 r/min离心10 min，取血清(不少于0.2 ml)检测CRP(美国Beckman Array 360 System)。假手术组取麻醉前及假手术后0.5 h的CRP。
1.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，组间差异比较以Student t检验，P<0.05为差异具有显著性。
2 结 果
2.1 神经病学评分
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评分标准参照Longa[3]评分法。0分：无明显神经病学症状；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走。80只动物，其中3只因麻醉意外死亡，2只尼龙丝推进失败，实际可观察75只，出现前述神经病学症状71只，成功率为95%。各组动物术后不同时间评分情况见表1。
表1 大鼠MCAO后神经病学症状评分 组 别
术 后
3 h
6 h
12 h
假手术组
0
0
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0
缺血3 h
1.6±0.4
缺血6 h
1.6±0.4
2.1±0.6
缺血12 h
1.7±0.5
2.0±0.4
1.8±0.4
假手术组n=10,缺血各组n=20.
(1)缺血3 h组，术后神经病学评分已达1.6±0.4，症状出现较早时间约术后1 h左右。(2)典型的肌张力失调所表现的追尾征出现在术后6 h左右。(3)缺血12 h后症状有所缓解。
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2.2 局灶性缺血区的TTC组化染色
10只动物，5只MCAO术后6 h TTC染色,肉眼可见缺血区呈白色，主要位于右侧大脑背外侧面额顶部的新皮层区(连续额状切片见尾壳核外侧部亦受累，个别重症病例其内侧部亦有受累的现象)，其余部位及左侧大脑均呈红色，表示供血状况未发生改变(图3)。而5只MCAO术后不到6 h(2只4 h,3只5 h)TTC染色，全脑均呈红色。
图3 MCAO术后6H TTC染色，缺血区呈白色
2.3 HE染色组织细胞的变化
MCAO 3 h以内脑组织改变不明显；6 h在皮层区与纹状体出现神经细胞皱缩，核内染色质凝集，部分神经细胞周边出现空白区，间质水肿(图4A)；12 h可见脑组织出现大片坏死灶，神经细胞消失，间质水肿更明显，星形细胞增生(图4B)。
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4a MCAO 6h,部分神经细胞皱缩，核深染，间质水肿.×400
4b MCAO 12h,坏死灶内神经细胞消失，星型细胞增生.×400
2.4 血清CRP变化(表2，图5)
表2 大鼠MCAO前后血清CRP的变化(mg/L) 组 别
术 前
术后0.5 h
术后6 h
假手术组
38.70±9.88
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38.50±9.38
缺血组
38.92±6.50
42.50±6.27*
45.1±6.69*
*：P<0.05 vs 术前.
图5 术后6 h CRP与神经病学评分的关系
缺血组术后0.5 h血清CRP即显著升高(P<0.05)达术前9.2%，CRP可在神经病学症状之前先出现改变。神经病学症状轻的，CRP接近正常；症状重的，CRP相应亦高，CRP变化量与神经病学症状的表现呈正相关。
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3 讨 论
由于MCAO型脑卒中是脑血管意外的常见病，因此需要创建单纯MCAO的动物模型。以往是在颅内阻断MCA[6],但该手术涉及范围广,损伤严重; 1989年Longa创建不开颅阻塞MCA的方法后，得到广泛应用和改进[7，8]，本实验采用市售直径0.205 mm的单股尼龙丝作为线性栓子(无需再加工)，在SD大鼠(235～275 g，除颈内动脉变异者外)，20 min内可顺利完成操作，成功率达95%。模型成功关键在于：第一，尼龙线栓子的粗细与硬度要选择恰当；第二，手术中要注意：(1)翼腭动脉的结扎位置要适当；(2)推送线栓时手法一定要轻柔。如需再灌注时，只要小心抽出尼龙丝后结扎或电凝创口即可。因此本方法为梗塞与再灌注的可逆性操作(本报告未提供再灌注实验部分)，简单易行。
由于大脑中动脉供血区涉及肌紧张的高级控制区，因此动物麻醉清醒后1～3 h即可表现肌紧张失调的神经病学症状，以追尾征与强迫体态较为典型，为手术成功的指征，如无神经病学症状或动物无法行走即为失败。术后表现的Horner征，是由于摘除了右颈上交感神经节，颈上交感神经径路损害，眼眶肌与睑板肌麻痹，导致瞳孔缩小，眼球内陷，眼裂变小。MCAO术后6 h TTC染色的大脑标本显示大脑中动脉供血区苍白缺血现象；而6 h前因脑组织改变尚不明显，属可逆性，故MCA供血区TTC染色无阳性征，这与临床上缺血性脑卒中常以发病6 h为治疗窗相吻合。HE染色镜检在缺血6 h时出现神经细胞损害，12 h见大片坏死灶;而神经症状在12 h稍有减轻,可能为大脑侧支循环丰富缺血区周边的血供有所恢复有关。
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已知CRP是一种急性时相蛋白，有报道梗塞时可升高[9]，可以作为组织损伤程度的敏感指标[10]。本实验在MCAO后0.5 h即较假手术对照组升高9.2%，早于以上其他症状之前出现，6 h后升高15.9%，但假手术组降低0.51%，因此手术组CRP的升高，并非因手术创伤所致，而来源于梗塞病灶本身的反应，本实验同时观察到CRP变化量与神经病学症状呈正相关,提示CRP可作为脑梗塞瞬时损伤的早期信号,即CRP升高可作为MCAO模型成功的标志之一。
国家杰出青年基金(39625022)和美国中华医学基金会基金(93-594)资助
参考文献
1 Yoshimine T，Yanagihara T. Regional cerebral ischemia by occlusion of the posterior communicating artery and the middle cerebral artery in gerbils. J Neurosurg, 1983；58：362
, 百拇医药
2 Coyle PMS. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke, 1982;13:855
3 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989;20:84
4 Morrow DA,Rifai N,Antman EM,et al. C-reactive protein is a potent predictor of mortality independently of and in combination with troponin T in acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol, 1998;31:1460
, 百拇医药
5 Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, et al. Plasma concentration of C-reactive protein and risk of developing peripheral vascular disease. Circulation, 1998;97:425
6 Tamura A，Graham DI，McCulloch J,et al. Focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab, 1981;1:53
7 杨世方，闵宝珍，周锡英. 大脑局灶性脑缺血再灌注模型的研究. 中风与神经病学杂志, 1996；13：15
8 刘亢丁，苏志强，李毅平,等. 实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进及评价. 中风与神经病学杂志, 1997；14：87
9 Nakayama S,Terry W,Closs D,et al. Inhibition of antibody responses to phosphocholine by C-reactive protein. J Immunol, 1984;132:1336
10 黄维周，时昭红，杜敏丽. C-反应蛋白临床研究进展. 中国实用内科杂志, 1996；16：245
(收稿：1999—03—19 修回：1999—05—14), http://www.100md.com
单位：林 春 福建医科大学生理学教研室(福州 350004)；郑淑秋 钟觉民 中山医科大学病理学教研室(广州 510080)；颜光美 中山医科大学药理学教研室(广州 510080) 课题负责人
关键词：大脑中动脉梗塞；缺血性脑卒中；C反应蛋白；大鼠
福建医科大学学报990305 目的 改进大鼠大脑中动脉梗塞法，建立更接近于临床缺血性脑卒中及其再灌注的可靠模型，并观察其与血清C反应蛋白变化的关系。 方法 沿大鼠右颈内动脉插入长2.1～2.3 cm直径0.205 mm的单股尼龙丝，直达大脑中动脉起始部开口，阻断其血流，观察大鼠神经病学改变及脑组织形态学变化，并测定血清C反应蛋白含量。 结果 术后大鼠表现特殊体态及典型追尾征,6 h大脑中动脉供血区出现缺血性外观(TTC染色)及相应组织学变化(HE染色)，模型成功率近95%(71/75)；并伴血清C反应蛋白上升(15.9%，n=20,P<0.05)。 结论 本方法既可构成缺血性病灶，又能形成再灌注模型，具有可逆性重复操作的特点;其神经病学与形态学的特殊表现及血清C反应蛋白的升高，可作为鉴定模型可靠性的依据。
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A Model of Regional Cerebral Ischemia and its Relationship with C-reactive Protein Change
Lin Chun1, Zheng Shuqiu2, Zhong Juemin3, et al
(1.Department of Physiology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004
2.Department of Pharmacology, 3.Department of Pathology,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080)
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Objective An ideal animal model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was developed and the relationship between the model and C-reactive protein change was investigated. Methods A fine and glossy nylon suture was introduced into the right cervical internal carotid artery and advanced intracranially to block blood flow into the MCA,changes of neurological syndromes and of morphology of brain were observed and CRP of serum was measured in rats. Results After MCAO,special neurological syndromes were showed by rats, the infarct surface in the area of MCA(TTC coloring, after MCAO 6 h) and corresponding change of brain histology(HE staining) were appeared and success rate of the model reached 95%(71/75); meanwhile CRP of serum rose(15.9%, P<0.05). Conclusion A reversible model of regional cerebral ischemia in rats was developed,the reliability of which could be evaluated by neurological syndromes, morphologic change and rise of serum CRP.
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Key words middle cerebral artery occlusion; ischemic stroke; C-reactive protein; rat
缺血性脑卒中是常见的脑血管意外，多构成终生残疾，对患者生活与工作带来严重后果，早期诊断与治疗是攻克该疾病的主要课题，为此，必须建立一种较为理想的动物模型——手术操作简便，损害少，可构成循环梗塞,又可顺利恢复血流这种接近临床病理状况的方法。大脑中动脉是脑梗塞好发部位，1966年Sundt在沙土鼠[1]及幼年大鼠[2]不断改进模拟大脑中动脉梗塞方法，至1989年Longa[3]改进成可逆性不开颅手术后，大脑中动脉梗塞动物模型已较成熟可靠，作者在此基础上进行改进，简化操作过程，提高成功率，同时观察C-反应蛋白与脑缺血的程度关系，以期求得早期的客观指标。心肌梗塞时C-反应蛋白升高已较肯定[4，5]，但是目前脑梗塞与C-反应蛋白的关系尚有争议。
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1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠，♂，体重235～275 g(中山医科大学实验动物中心);随机分组：(1)假手术组10只;(2)脑缺血3 h组20只;(3)脑缺血6 h组20只;(4)脑缺血12 h组20只。
1.2 大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制备
1.2.1 线栓制备 市售单股直径0.205 mm尼龙丝，准确选取2.5 cm，浸泡于75%酒精10 min，生理盐水冲洗，1%肝素浸泡备用。
1.2.2 手术操作 动物用2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)，背位固定于大鼠手术台，颈部正中切口2～2.5 cm，分离二侧甲状腺，暴露气管右侧与胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间的三角区，钝性分离颈总动脉，颈内动脉及颈外动脉，用小动脉夹夹住颈总动脉，并置1-0手术线以备止血之需。摘除颈总动脉分叉背后的颈上交感神经节(分离枕动脉所需),分离枕动脉结扎剪断，并于甲状腺上动脉分支处双线结扎剪断颈外动脉，仔细分离位于深层的颈内动脉最下端的唯一分支翼腭动脉，于分支前1 mm处结扎(此为手术关键步骤之一)。在颈外动脉残端距颈总动脉分支约3 mm处剪一小口，插入尼龙丝，同时将颈外动脉残端牵向外下方，使之与颈内动脉呈平行走向，拉直与颈内动脉的夹角，将尼龙丝顺颈内动脉走向，轻柔缓慢推进(不可强推，以免穿通动脉壁)，直到尼龙丝在动脉外尚余1～2 mm长度，与颈外动脉同时结扎以固定尼龙丝(图1)。此时插入的尼龙丝正好封闭大脑中动脉开口，阻断大脑中动脉的血流。假手术组除不插入尼龙丝外，其他操作与手术组相同。
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图1 线栓插入颈内动脉达MCA路径示意图
1.3 术后神经病学检测
术后清醒状态下观察右侧MCAO后的神经病学症状，主要表现为：
1.3.1 双眼对比(图2A) 右侧(手术侧)瞳孔缩小,眼球内陷,眼裂变小(Horner征);取出眼球时眼窝无出血现象。左侧(非手术侧)眼球稍突出，瞳孔及眼裂正常;取出眼球时眼窝出血。
图2 术后动物的体态
A.同侧(右)Horner征及左前爪伸展不能. B.动物提尾悬空的强迫体态.
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C.向左旋转的“追尾征”致静止时尾巴特殊的盘绕状.
1.3.2 体态(图2A) 左侧肌张力下降，右侧肌张力相对增强，躯体向左侧屈曲，右侧前爪伸长强于左侧，尾巴弯向左侧。提尾悬空时(图2B)呈强迫性体态，躯体向左侧扭转，右侧前后肢外展，左侧前后肢松软屈曲。
1.3.3 追尾征(图2C) 运动时躯体向左侧旋转，如同追击自己尾巴一样，旋转静止后尾巴可形成特殊的盘绕状。
1.4 氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)组化染色
术后6 h在清醒状态下断头处死，打开颅骨盖，剥去脑膜，快速取出整个大脑，用PBS液清洗后，将鼠脑置于1%TTC溶液中，再于37℃ CO2孵箱(德国Heraeus)温育20 min，应严格避光，每隔5 min摇动一次，20 min后再将大脑标本移置于4%多聚甲醛液中固定。
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1.5 光镜组织学检查 如上述操作，动物处死、取脑、PBS清洗后，将鼠脑置于4%多聚甲醛液固定24 h，石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，HE染色，光镜观察组织细胞学变化。
1.6 血清C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)检验 MCAO前右眼窝取血，术后0.5 h左眼窝取血，术后6 h断头取血，每次取血1.5～2.0 ml，静置凝固后置3000 r/min离心10 min，取血清(不少于0.2 ml)检测CRP(美国Beckman Array 360 System)。假手术组取麻醉前及假手术后0.5 h的CRP。
1.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，组间差异比较以Student t检验，P<0.05为差异具有显著性。
2 结 果
2.1 神经病学评分
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评分标准参照Longa[3]评分法。0分：无明显神经病学症状；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走。80只动物，其中3只因麻醉意外死亡，2只尼龙丝推进失败，实际可观察75只，出现前述神经病学症状71只，成功率为95%。各组动物术后不同时间评分情况见表1。
表1 大鼠MCAO后神经病学症状评分 组 别
术 后
3 h
6 h
12 h
假手术组
0
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0
缺血3 h
1.6±0.4
缺血6 h
1.6±0.4
2.1±0.6
缺血12 h
1.7±0.5
2.0±0.4
1.8±0.4
假手术组n=10,缺血各组n=20.
(1)缺血3 h组，术后神经病学评分已达1.6±0.4，症状出现较早时间约术后1 h左右。(2)典型的肌张力失调所表现的追尾征出现在术后6 h左右。(3)缺血12 h后症状有所缓解。
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2.2 局灶性缺血区的TTC组化染色
10只动物，5只MCAO术后6 h TTC染色,肉眼可见缺血区呈白色，主要位于右侧大脑背外侧面额顶部的新皮层区(连续额状切片见尾壳核外侧部亦受累，个别重症病例其内侧部亦有受累的现象)，其余部位及左侧大脑均呈红色，表示供血状况未发生改变(图3)。而5只MCAO术后不到6 h(2只4 h,3只5 h)TTC染色，全脑均呈红色。
图3 MCAO术后6H TTC染色，缺血区呈白色
2.3 HE染色组织细胞的变化
MCAO 3 h以内脑组织改变不明显；6 h在皮层区与纹状体出现神经细胞皱缩，核内染色质凝集，部分神经细胞周边出现空白区，间质水肿(图4A)；12 h可见脑组织出现大片坏死灶，神经细胞消失，间质水肿更明显，星形细胞增生(图4B)。
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4a MCAO 6h,部分神经细胞皱缩，核深染，间质水肿.×400
4b MCAO 12h,坏死灶内神经细胞消失，星型细胞增生.×400
2.4 血清CRP变化(表2，图5)
表2 大鼠MCAO前后血清CRP的变化(mg/L) 组 别
术 前
术后0.5 h
术后6 h
假手术组
38.70±9.88
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38.50±9.38
缺血组
38.92±6.50
42.50±6.27*
45.1±6.69*
*：P<0.05 vs 术前.
图5 术后6 h CRP与神经病学评分的关系
缺血组术后0.5 h血清CRP即显著升高(P<0.05)达术前9.2%，CRP可在神经病学症状之前先出现改变。神经病学症状轻的，CRP接近正常；症状重的，CRP相应亦高，CRP变化量与神经病学症状的表现呈正相关。
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3 讨 论
由于MCAO型脑卒中是脑血管意外的常见病，因此需要创建单纯MCAO的动物模型。以往是在颅内阻断MCA[6],但该手术涉及范围广,损伤严重; 1989年Longa创建不开颅阻塞MCA的方法后，得到广泛应用和改进[7，8]，本实验采用市售直径0.205 mm的单股尼龙丝作为线性栓子(无需再加工)，在SD大鼠(235～275 g，除颈内动脉变异者外)，20 min内可顺利完成操作，成功率达95%。模型成功关键在于：第一，尼龙线栓子的粗细与硬度要选择恰当；第二，手术中要注意：(1)翼腭动脉的结扎位置要适当；(2)推送线栓时手法一定要轻柔。如需再灌注时，只要小心抽出尼龙丝后结扎或电凝创口即可。因此本方法为梗塞与再灌注的可逆性操作(本报告未提供再灌注实验部分)，简单易行。
由于大脑中动脉供血区涉及肌紧张的高级控制区，因此动物麻醉清醒后1～3 h即可表现肌紧张失调的神经病学症状，以追尾征与强迫体态较为典型，为手术成功的指征，如无神经病学症状或动物无法行走即为失败。术后表现的Horner征，是由于摘除了右颈上交感神经节，颈上交感神经径路损害，眼眶肌与睑板肌麻痹，导致瞳孔缩小，眼球内陷，眼裂变小。MCAO术后6 h TTC染色的大脑标本显示大脑中动脉供血区苍白缺血现象；而6 h前因脑组织改变尚不明显，属可逆性，故MCA供血区TTC染色无阳性征，这与临床上缺血性脑卒中常以发病6 h为治疗窗相吻合。HE染色镜检在缺血6 h时出现神经细胞损害，12 h见大片坏死灶;而神经症状在12 h稍有减轻,可能为大脑侧支循环丰富缺血区周边的血供有所恢复有关。
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已知CRP是一种急性时相蛋白，有报道梗塞时可升高[9]，可以作为组织损伤程度的敏感指标[10]。本实验在MCAO后0.5 h即较假手术对照组升高9.2%，早于以上其他症状之前出现，6 h后升高15.9%，但假手术组降低0.51%，因此手术组CRP的升高，并非因手术创伤所致，而来源于梗塞病灶本身的反应，本实验同时观察到CRP变化量与神经病学症状呈正相关,提示CRP可作为脑梗塞瞬时损伤的早期信号,即CRP升高可作为MCAO模型成功的标志之一。
国家杰出青年基金(39625022)和美国中华医学基金会基金(93-594)资助
参考文献
1 Yoshimine T，Yanagihara T. Regional cerebral ischemia by occlusion of the posterior communicating artery and the middle cerebral artery in gerbils. J Neurosurg, 1983；58：362
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2 Coyle PMS. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke, 1982;13:855
3 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989;20:84
4 Morrow DA,Rifai N,Antman EM,et al. C-reactive protein is a potent predictor of mortality independently of and in combination with troponin T in acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol, 1998;31:1460
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6 Tamura A，Graham DI，McCulloch J,et al. Focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab, 1981;1:53
7 杨世方，闵宝珍，周锡英. 大脑局灶性脑缺血再灌注模型的研究. 中风与神经病学杂志, 1996；13：15
8 刘亢丁，苏志强，李毅平,等. 实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进及评价. 中风与神经病学杂志, 1997；14：87
9 Nakayama S,Terry W,Closs D,et al. Inhibition of antibody responses to phosphocholine by C-reactive protein. J Immunol, 1984;132:1336
10 黄维周，时昭红，杜敏丽. C-反应蛋白临床研究进展. 中国实用内科杂志, 1996；16：245
(收稿：1999—03—19 修回：1999—05—14), http://www.100md.com