广西孕妇乙型肝炎病毒宫内感染及其危险因素的研究
作者：梁浩 邬质彬 徐国城
单位：梁浩 邬质彬 徐国城 广西医科大学流行病学教研室 南宁 530021；郭湘碧 广西妇幼保健院
关键词：乙型肝炎病毒(HBV)；宫内感染；多聚酶链反应(PCR)；Logistic回归
广西医科大学学报990305
摘要 目的：为深入揭示乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染及其危险因素。方法：采用多聚酶链反应(PCR)技术结合酶联免疫吸附法(ELISA)对广西116例HBsAg阳性和52例HBsAg阴性孕妇外周血及其引产胎儿胎心血进行HBV血清学标志物和HBV DNA检测。结果：HBsAg阳性、HBsAg和HBeAg双阳性、HBV DNA阳性孕妇胎儿HBV DNA检出率(51.3%、90.2%、83.8%)均分别显著高于其对照组(3.9%、21.2%、0.0%)。Logistic回归分析选出的孕妇HBV宫内感染危险因素有HBsAg、HBeAg、HBV DNA和孕期。结论：广西HBV宫内感染率较高，HBsAg阴性孕妇也可能发生HBV宫内感染；孕妇HBsAg、HBeAg尤其是HBV DNA阳性以及孕期是HBV宫内感染的主要危险因素。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R373.2
A STUDY ON THE HEPATITIS B VIRUS INTRAUTERINE INFECTION AND ITS RISK IN GUANGXI
Liang Hao,Wu Zhibin,Guo Xiangbi,et al
Department of Epidemiology,Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective: To go further into the hepatitis B virus (HBV) intrauterine infection and its risk factors.Method:HBV serum markers and HBV DNA were detected by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) in 116 HBsAg positive and 52 HBsAg negative mother-induced abortion foetuses.Results:The positive rates of HBV DNA in the heart blood of foetuses from HBsAg positive pregnant women,HBsAg and HBeAg positve pregnant women and HBV DNA positive pregnant women were 51.3%，90.2% and 83.8%，respectively,which were significantly higher than those (3.9%，21.2%，0.0%) of controls.HBsAg、HBeAg、HBV DNA and gestational period were selected as risk factors of HBV intrauterine infection by Logistic regression.Conclusion:The HBV intrauterine infection rate is rather high in Guangxi.HBsAg negative pregnant women may also transmit HBV intrauterine infection.The main risk factors of HBV intrauterine infection are HBV DNA,HBeAg,gestational period and HBsAg in OR-value order.
, 百拇医药
Key words hepatitis B virus；intrauferine infection；polymerase chain reaction；Logistic regression
广西是乙型肝炎(HB)高发区，宫内感染是乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播的重要途径之一，是导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的主要原因。但HBV宫内感染率究竟有多高，尚没有一致的结果。本研究试图用多聚酶链反应(PCR)技术结合ELISA法对大样本的广西孕妇、胎儿进行HBV宫内感染率的测定，以进一步弄清HBV宫内感染的确切发生率，同时探讨其主要危险因素。
1 材料与方法
1.1 研究对象：以1995年11月至1997年12月在广西区妇幼保健院用ELISA法筛选的HBsAg阳性孕妇及利凡诺引产的胎儿作为研究对象。共筛选出HBsAg阳性孕妇116例，引产胎儿117例(其中1例为双胞胎)，HBsAg阴性孕妇及引产胎儿各52例，孕妇平均年龄25.5岁(17～45岁)，平均孕期20.5周(14～37周)。胎儿娩出后立即抽胎心血和孕妇外周静脉血，分离血清置-20℃保存。
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1.2 检测方法
1.2.1 ELISA法测定HBV标志物：试剂盒购自上海科华生物技术有限公司，按试剂盒使用说明操作，结果用酶标仪判断。
1.2.2 PCR法检测HBV DNA：试剂购自上海复华公司。引物序列1为5′-GCGGTATTTTGGGGTGGA-3′；引物序列2为5′-AGATTGACGAGATGTGAG-3′。扩增产物为280bp。HBV DNA提取:取血清40μl加20μl裂解液，混匀后置100℃10 min，以15000 r/min离心15min，取上清液作为反应标本。PCR扩增:取0.5ml离心管依次加入10μl反应混合液，10μl溴酚兰以及10μl已处理的标本或阳性、阴性对照，混匀后加20μl石蜡油稍离心，置93℃预变性3min，再按93℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后，将与试剂盒阳性对照的DNA条带在同一水平位置的标本确定为扩增阳性。
, 百拇医药
1.2.3 统计方法：调查检测原始数据全部输入计算机，用Foxbase建立数据库，以美国spss/p统计软件包在IBM-PC586微机上进行数据处理分析，其中两样本率的比较用χ2检验，多因素分析用非条件Logistic回归法。
2 结果
2.1 胎心血HBV DNA检测结果：HBsAg阳性孕妇胎儿HBV DNA检出率为51.3%(60/117)；HBsAg阴性孕妇胎儿HBV DNA检出率为3.9%(2/52)，两者差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 孕妇血HBV DNA状态与HBV宫内传播的关系，见表1。
2.3 HBsAg阳性孕妇血HBsAg状态与HBV宫内传播关系，见表2。
2.4 宫内感染多因素分析：采用非条件Logistic回归模型对168例孕妇HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、HBV DNA及孕期7个因素进行分析，最终进入回归方程的危险因素是HBsAg、HBeAg、HBV DNA及孕期，见表3。
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表1 孕妇血清HBV DNA状态与HBV宫内传播关系 孕妇HBV DNA
n
胎儿HBV DNA
阳性数
%
阳 性
73
62△
83.8*
阴 性
95
0
, http://www.100md.com
0.0
合 计
168
62
36.7
*P<0.001；△其中有1例为双胞胎表2 HBsAg阳性孕妇血HBeAg状态与HBV宫内传播关系 HBeAg
n
孕 妇
胎 儿
HBV DNA阳性数
%
HBV DNA阳性数
, http://www.100md.com
%
阳 性
50
50
100.0*
46△
90.2*
阴 性
66
21
31.8
14
, http://www.100md.com 21.2
*P<0.001；△其中有1例为双胞胎表3 HBV宫内感染危险因素分析结果 危险因素
回归系数
wald值
P值
R值
OR值
HBsAg
0.2599
2.0326
0.1047
0.0535
, 百拇医药
1.2908
HBeAg
0.4159
4.0964
0.0430
0.0973
1.5158
HBV DNA
1.0775
6.5248
0.0106
0.1430
, http://www.100md.com 2.9374
孕期
0.3110
6.1931
0.0123
0.1377
1.3660
3 讨论
3.1 HBV宫内感染率的再认识：HBV宫内感染早已被证实，但其感染率各地报道不一。早期的研究认为，一般在5%～15%之间[1]。近来报道HBV宫内感染率可高达22.2%～66.7%[2，3]。Alexander等[4]认为绝大部分的胎儿在宫内早期就感染了HBV，只是来自母血的抗HBcIgG抑制了胎儿HBV复制和抗原表达而表现出HBV低的宫内感染率。唐时幸等[5]也认为部分胎儿在宫内感染HBV后处于一种“潜隐状态”，而用常规的血清方法检测不到HBV感染的标志。可见造成HBV宫内感染率报道不一致的原因，与研究对象如孕妇和胎儿的各种情况以及检测方法的不同有关。本研究采用PCR技术，收集较大的样本例数进行宫内感染检测，HBV宫内感染检出率为51.3%，提示HBV宫内感染率较高，可能是导致广西HBV流行区慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的重要原因之一，对此应引起人们重新对HBV宫内感染率的认识。
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3.2 HBV宫内感染的影响因素
3.2.1 孕妇血清HBV标志物和HBV DNA检测与HBV宫内传播关系：本研究发现，HBsAg、HBeAg双阳性孕妇其胎儿HBV DNA检出率显著高于HBsAg阳性而HBeAg阴性孕妇，而且，HBsAg阳性孕妇其胎儿HBV DNA检出率明显高于HBsAg阴性孕妇，提示HBsAg和HBeAg双阳孕妇HBV复制活跃，传染性强，孕妇HBsAg和HBeAg状态与HBV宫内传播密切相关，这与门可等[6]报道相似。自从应用PCR技术检测HBV DNA以来，对HBV标志物的临床意义有了新的认识[7，8]。本研究结果表明血清HBsAg阴性孕妇仍可能引起HBV宫内传播。因此，对于HBV产前传播的预防，不能仅限于HBsAg阳性孕妇，对于HBsAg阴性孕妇也应予以重视。另一方面，本研究还发现，仍有少数HBsAg阳性而HBeAg阴性孕妇其胎儿检出HBV DNA，可能与HBV前C区突变有关[7]，提示孕妇HBeAg阳性并非HBV宫内传播最可靠的标志。Burk等[9]研究表明，胎儿是否感染HBV取决于母体HBV DNA的含量水平。本研究显示血清HBV DNA阳性孕妇宫内传播率显著高于血清HBV DNA阴性者。而孕妇HBV DNA阴性，不论HBsAg是否阳性，均无1例胎儿血清中检出HBV DNA。因此，PCR检测HBV DNA是预测HBV宫内感染最直接、最可靠的指标。
, 百拇医药
3.2.2 HBV宫内感染多因素分析：本研究应用非条件Logistic回归分析从7个因素中筛选出4个与HBV宫内感染有关的危险因素，按其危险性大小分别是：HBV DNA(OR=2.9374)、HBeAg(OR=1.5158)、孕期(OR=1.3660)、HBsAg(OR=1.2908)，提示孕妇HBV DNA阳性与HBV宫内感染最密切，其次是HBeAg、HBsAg，孕期越长HBV宫内感染的危险性越大。 参考文献
1 Ghendon Y.Perinatal transmission of hepatitis B virus in high incidence countries.J Virol Methods,1987,17:69～79
2 王珊珊，姜普林，曾年华，等.乙型肝炎病毒的子宫内感染.中华实验和临床病毒学杂志,1995,9(2):178～179
3 钟铃，燎洪玻，胡丽娜，等.应用PCR技术监测HBV的宫内传播.中华妇产科杂志,1995,30(9):553～554
, 百拇医药
4 Alexander GJM,Edddleston ALWF.Does materal antibody to core antigen prevent recognition of transplancental transmission of hepatitis B virus infectionLancet,1986,I:296～297
5 唐时幸，于光烈，程绍尧.HBV宫内感染及其频率的研究.中华流行病学杂志,1990,11(6):328～330
6 门可，王福生，徐德忠，等.乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究.第四军医大学学报,1996,17(1):28～29
7 Carman WF,Hadziyannis S,McGarvey MJ,et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection.Lancet,1989,2:588～590
, 百拇医药
8 Pao CC,Yao DS,Lin CY,et al.Serum hepatitis B virus DNA in hepatitis B virus seropositive and seronegative patients with normal liver function.Am J Clin Pathol,1991,95:591～595
9 Burk RD,Hwang LY,Ho GYF,et al.Outcome of perinatal hepatitis B virus exposure is dependent on materal virus loal.J Infect Dis,1994,17:1418～1423
收稿日期：1998-10-05, 百拇医药
单位：梁浩 邬质彬 徐国城 广西医科大学流行病学教研室 南宁 530021；郭湘碧 广西妇幼保健院
关键词：乙型肝炎病毒(HBV)；宫内感染；多聚酶链反应(PCR)；Logistic回归
广西医科大学学报990305
摘要 目的：为深入揭示乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染及其危险因素。方法：采用多聚酶链反应(PCR)技术结合酶联免疫吸附法(ELISA)对广西116例HBsAg阳性和52例HBsAg阴性孕妇外周血及其引产胎儿胎心血进行HBV血清学标志物和HBV DNA检测。结果：HBsAg阳性、HBsAg和HBeAg双阳性、HBV DNA阳性孕妇胎儿HBV DNA检出率(51.3%、90.2%、83.8%)均分别显著高于其对照组(3.9%、21.2%、0.0%)。Logistic回归分析选出的孕妇HBV宫内感染危险因素有HBsAg、HBeAg、HBV DNA和孕期。结论：广西HBV宫内感染率较高，HBsAg阴性孕妇也可能发生HBV宫内感染；孕妇HBsAg、HBeAg尤其是HBV DNA阳性以及孕期是HBV宫内感染的主要危险因素。
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中国图书资料分类法分类号 R373.2
A STUDY ON THE HEPATITIS B VIRUS INTRAUTERINE INFECTION AND ITS RISK IN GUANGXI
Liang Hao,Wu Zhibin,Guo Xiangbi,et al
Department of Epidemiology,Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective: To go further into the hepatitis B virus (HBV) intrauterine infection and its risk factors.Method:HBV serum markers and HBV DNA were detected by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) in 116 HBsAg positive and 52 HBsAg negative mother-induced abortion foetuses.Results:The positive rates of HBV DNA in the heart blood of foetuses from HBsAg positive pregnant women,HBsAg and HBeAg positve pregnant women and HBV DNA positive pregnant women were 51.3%，90.2% and 83.8%，respectively,which were significantly higher than those (3.9%，21.2%，0.0%) of controls.HBsAg、HBeAg、HBV DNA and gestational period were selected as risk factors of HBV intrauterine infection by Logistic regression.Conclusion:The HBV intrauterine infection rate is rather high in Guangxi.HBsAg negative pregnant women may also transmit HBV intrauterine infection.The main risk factors of HBV intrauterine infection are HBV DNA,HBeAg,gestational period and HBsAg in OR-value order.
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Key words hepatitis B virus；intrauferine infection；polymerase chain reaction；Logistic regression
广西是乙型肝炎(HB)高发区，宫内感染是乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播的重要途径之一，是导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的主要原因。但HBV宫内感染率究竟有多高，尚没有一致的结果。本研究试图用多聚酶链反应(PCR)技术结合ELISA法对大样本的广西孕妇、胎儿进行HBV宫内感染率的测定，以进一步弄清HBV宫内感染的确切发生率，同时探讨其主要危险因素。
1 材料与方法
1.1 研究对象：以1995年11月至1997年12月在广西区妇幼保健院用ELISA法筛选的HBsAg阳性孕妇及利凡诺引产的胎儿作为研究对象。共筛选出HBsAg阳性孕妇116例，引产胎儿117例(其中1例为双胞胎)，HBsAg阴性孕妇及引产胎儿各52例，孕妇平均年龄25.5岁(17～45岁)，平均孕期20.5周(14～37周)。胎儿娩出后立即抽胎心血和孕妇外周静脉血，分离血清置-20℃保存。
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1.2 检测方法
1.2.1 ELISA法测定HBV标志物：试剂盒购自上海科华生物技术有限公司，按试剂盒使用说明操作，结果用酶标仪判断。
1.2.2 PCR法检测HBV DNA：试剂购自上海复华公司。引物序列1为5′-GCGGTATTTTGGGGTGGA-3′；引物序列2为5′-AGATTGACGAGATGTGAG-3′。扩增产物为280bp。HBV DNA提取:取血清40μl加20μl裂解液，混匀后置100℃10 min，以15000 r/min离心15min，取上清液作为反应标本。PCR扩增:取0.5ml离心管依次加入10μl反应混合液，10μl溴酚兰以及10μl已处理的标本或阳性、阴性对照，混匀后加20μl石蜡油稍离心，置93℃预变性3min，再按93℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后，将与试剂盒阳性对照的DNA条带在同一水平位置的标本确定为扩增阳性。
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1.2.3 统计方法：调查检测原始数据全部输入计算机，用Foxbase建立数据库，以美国spss/p统计软件包在IBM-PC586微机上进行数据处理分析，其中两样本率的比较用χ2检验，多因素分析用非条件Logistic回归法。
2 结果
2.1 胎心血HBV DNA检测结果：HBsAg阳性孕妇胎儿HBV DNA检出率为51.3%(60/117)；HBsAg阴性孕妇胎儿HBV DNA检出率为3.9%(2/52)，两者差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 孕妇血HBV DNA状态与HBV宫内传播的关系，见表1。
2.3 HBsAg阳性孕妇血HBsAg状态与HBV宫内传播关系，见表2。
2.4 宫内感染多因素分析：采用非条件Logistic回归模型对168例孕妇HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、HBV DNA及孕期7个因素进行分析，最终进入回归方程的危险因素是HBsAg、HBeAg、HBV DNA及孕期，见表3。
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表1 孕妇血清HBV DNA状态与HBV宫内传播关系 孕妇HBV DNA
n
胎儿HBV DNA
阳性数
%
阳 性
73
62△
83.8*
阴 性
95
0
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0.0
合 计
168
62
36.7
*P<0.001；△其中有1例为双胞胎表2 HBsAg阳性孕妇血HBeAg状态与HBV宫内传播关系 HBeAg
n
孕 妇
胎 儿
HBV DNA阳性数
%
HBV DNA阳性数
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%
阳 性
50
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100.0*
46△
90.2*
阴 性
66
21
31.8
14
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*P<0.001；△其中有1例为双胞胎表3 HBV宫内感染危险因素分析结果 危险因素
回归系数
wald值
P值
R值
OR值
HBsAg
0.2599
2.0326
0.1047
0.0535
, 百拇医药
1.2908
HBeAg
0.4159
4.0964
0.0430
0.0973
1.5158
HBV DNA
1.0775
6.5248
0.0106
0.1430
, http://www.100md.com 2.9374
孕期
0.3110
6.1931
0.0123
0.1377
1.3660
3 讨论
3.1 HBV宫内感染率的再认识：HBV宫内感染早已被证实，但其感染率各地报道不一。早期的研究认为，一般在5%～15%之间[1]。近来报道HBV宫内感染率可高达22.2%～66.7%[2，3]。Alexander等[4]认为绝大部分的胎儿在宫内早期就感染了HBV，只是来自母血的抗HBcIgG抑制了胎儿HBV复制和抗原表达而表现出HBV低的宫内感染率。唐时幸等[5]也认为部分胎儿在宫内感染HBV后处于一种“潜隐状态”，而用常规的血清方法检测不到HBV感染的标志。可见造成HBV宫内感染率报道不一致的原因，与研究对象如孕妇和胎儿的各种情况以及检测方法的不同有关。本研究采用PCR技术，收集较大的样本例数进行宫内感染检测，HBV宫内感染检出率为51.3%，提示HBV宫内感染率较高，可能是导致广西HBV流行区慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的重要原因之一，对此应引起人们重新对HBV宫内感染率的认识。
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3.2 HBV宫内感染的影响因素
3.2.1 孕妇血清HBV标志物和HBV DNA检测与HBV宫内传播关系：本研究发现，HBsAg、HBeAg双阳性孕妇其胎儿HBV DNA检出率显著高于HBsAg阳性而HBeAg阴性孕妇，而且，HBsAg阳性孕妇其胎儿HBV DNA检出率明显高于HBsAg阴性孕妇，提示HBsAg和HBeAg双阳孕妇HBV复制活跃，传染性强，孕妇HBsAg和HBeAg状态与HBV宫内传播密切相关，这与门可等[6]报道相似。自从应用PCR技术检测HBV DNA以来，对HBV标志物的临床意义有了新的认识[7，8]。本研究结果表明血清HBsAg阴性孕妇仍可能引起HBV宫内传播。因此，对于HBV产前传播的预防，不能仅限于HBsAg阳性孕妇，对于HBsAg阴性孕妇也应予以重视。另一方面，本研究还发现，仍有少数HBsAg阳性而HBeAg阴性孕妇其胎儿检出HBV DNA，可能与HBV前C区突变有关[7]，提示孕妇HBeAg阳性并非HBV宫内传播最可靠的标志。Burk等[9]研究表明，胎儿是否感染HBV取决于母体HBV DNA的含量水平。本研究显示血清HBV DNA阳性孕妇宫内传播率显著高于血清HBV DNA阴性者。而孕妇HBV DNA阴性，不论HBsAg是否阳性，均无1例胎儿血清中检出HBV DNA。因此，PCR检测HBV DNA是预测HBV宫内感染最直接、最可靠的指标。
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3.2.2 HBV宫内感染多因素分析：本研究应用非条件Logistic回归分析从7个因素中筛选出4个与HBV宫内感染有关的危险因素，按其危险性大小分别是：HBV DNA(OR=2.9374)、HBeAg(OR=1.5158)、孕期(OR=1.3660)、HBsAg(OR=1.2908)，提示孕妇HBV DNA阳性与HBV宫内感染最密切，其次是HBeAg、HBsAg，孕期越长HBV宫内感染的危险性越大。 参考文献
1 Ghendon Y.Perinatal transmission of hepatitis B virus in high incidence countries.J Virol Methods,1987,17:69～79
2 王珊珊，姜普林，曾年华，等.乙型肝炎病毒的子宫内感染.中华实验和临床病毒学杂志,1995,9(2):178～179
3 钟铃，燎洪玻，胡丽娜，等.应用PCR技术监测HBV的宫内传播.中华妇产科杂志,1995,30(9):553～554
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4 Alexander GJM,Edddleston ALWF.Does materal antibody to core antigen prevent recognition of transplancental transmission of hepatitis B virus infectionLancet,1986,I:296～297
5 唐时幸，于光烈，程绍尧.HBV宫内感染及其频率的研究.中华流行病学杂志,1990,11(6):328～330
6 门可，王福生，徐德忠，等.乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究.第四军医大学学报,1996,17(1):28～29
7 Carman WF,Hadziyannis S,McGarvey MJ,et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection.Lancet,1989,2:588～590
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8 Pao CC,Yao DS,Lin CY,et al.Serum hepatitis B virus DNA in hepatitis B virus seropositive and seronegative patients with normal liver function.Am J Clin Pathol,1991,95:591～595
9 Burk RD,Hwang LY,Ho GYF,et al.Outcome of perinatal hepatitis B virus exposure is dependent on materal virus loal.J Infect Dis,1994,17:1418～1423
收稿日期：1998-10-05, 百拇医药